Microscopia confocal

Fundamentos de la t ecnica
Implementaciones de campo lejano
Presentaci on para la materia Nano- optica
Vctor A. Bettachini
16 de Setiembre de 2010
Point Spread Function en plano imagen (z = 0 x, y

z)
Haces Gaussianos en aproximaci on paraxial.


z
Disco de Airy: elptico
x
>
y
, entre primeros mnimos

x
= 0,6098
M
NA


z
no tiene componente

z

x
(

z) >
x
(

z)
V. A. Bettachini () Microscopia confocal 2 / 12
Lmite de resoluci on lateral
Iluminando toda la muestra:

x
disco de Airy /
magnicaci on lateral M
(Abbe)
Minr

= 0,6098

NA
Confocal de alta resoluci on lateral: Ingeniera de la PSF
Barrer muestra con

E
exc
que excite un a la vez
Se quiere: extensi on de

E
exc
r

separaci on dipolos a resolver

= f [material ,

E
exc
(

r
s

r
n
)]

r
s
jo s =

r |

E(

r )|
2
en
plano imagen, depende de

r
n
V. A. Bettachini () Microscopia confocal 3 / 12
Ingeniera de PSF: PSF Total = PSF Excitaci on PSF Detecci on
Conguraciones
R
e
p
r
o
d
u
c
i
d
o
d
e
:
P
r
i
n
c
i
p
l
e
s
o
f
N
a
n
o
-
O
p
t
i
c
s
,
L
.
N
o
v
o
t
n
y
y
B
.
H
e
c
h
t
,
C
a
m
b
r
i
d
g
e
U
n
i
v
e
r
s
i
t
y
P
r
e
s
s
,
2
0
0
6
T ecnicas de ingeniera
Interacciones no-lineales
desplazamiento espacial
una PSF respecto a la otra
Interferencia de haces
coherentes
contra-propagantes
Mejoras
Resoluci on
Contraste
V. A. Bettachini () Microscopia confocal 4 / 12
Point Spread Function: aproximaci on paraxial en eje

z


z

z
= 2n

M
2

NA
2

x
M = 60 NA = 1,4 = 500 nm
x
13 m
z
1,8 mm
V. A. Bettachini () Microscopia confocal 5 / 12
Barriendo la muestra: en el eje axial
s =

r |

E(

r )|
2
en plano imagen de en eje

z, no depende de z
Filtrando en el plano imagen con un pinhole de radio del orden de
x
Hay dependencia en z resoluci on en z
Pero

z es invisible
V. A. Bettachini () Microscopia confocal 6 / 12
Resoluci on axial del confocal
R
e
p
r
o
d
u
c
i
d
o
d
e
:
P
r
i
n
c
i
p
l
e
s
o
f
N
a
n
o
-
O
p
t
i
c
s
,
L
.
N
o
v
o
t
n
y
y
B
.
H
e
c
h
t
,
C
a
m
b
r
i
d
g
e
U
n
i
v
e
r
s
i
t
y
P
r
e
s
s
,
2
0
0
6
En plano imagen: s
2
(z) max para @z = 0 y min para @z = r

Min[r

] = 2
n
NA
2
Profundidad focal
(n = 1,515 NA = 1,4 = 500 nm Profundidad focal 0,8m)
V. A. Bettachini () Microscopia confocal 7 / 12
Principio confocal
R
e
p
r
o
d
u
c
i
d
o
d
e
:
P
r
i
n
c
i
p
l
e
s
o
f
N
a
n
o
-
O
p
t
i
c
s
,
L
.
N
o
v
o
t
n
y
y
B
.
H
e
c
h
t
,
C
a
m
b
r
i
d
g
e
U
n
i
v
e
r
s
i
t
y
P
r
e
s
s
,
2
0
0
6
crculo: en el eje optico en el
plano de detecci on conjugado en
el espacio objeto forma imagen
en el pinhole y es detectado
tri angulo: es enfocado a un lado
del pinhole
cuadrado: imagen fuera de foco
en pinhole, se suprime su se nal
Hace maximo uso del limitado ancho de banda impuesto por
iluminaci on y detecci on de campo lejano
V. A. Bettachini () Microscopia confocal 8 / 12
Principios: veamos las cuentas
C alculos para obtener s
2
= s
2
(

r
n
)
1

E
exc
en espacio objeto: PSF de excitaci on
2
Interacci on: generaci on de
3

E en espacio imagen: PSF de detecci on
4
Se nal de

r
n
5
Asumiendo |I
00
| |I
0x
|
vs. (microscopia ordinaria)
PSF confocal = PSF ordinaria
2
V. A. Bettachini () Microscopia confocal 9 / 12
Dispositivo de microscopia confocal: en forma esquem atica
R
e
p
r
o
d
u
c
i
d
o
d
e
:
P
r
i
n
c
i
p
l
e
s
o
f
N
a
n
o
-
O
p
t
i
c
s
,
L
.
N
o
v
o
t
n
y
y
B
.
H
e
c
h
t
,
C
a
m
b
r
i
d
g
e
U
n
i
v
e
r
s
i
t
y
P
r
e
s
s
,
2
0
0
6
elementos centrales
Haz gaussiano de excitaci on que sobrellena el objetivo
Objetivo (alta NA) enfoca haz connamiento espacial
Mismo objetivo recoge respuesta que es enfocada en pinhole
V. A. Bettachini () Microscopia confocal 10 / 12
Dispositivo de microscopia confocal: armado usual
R
e
p
r
o
d
u
c
i
d
o
d
e
:
P
r
i
n
c
i
p
l
e
s
o
f
N
a
n
o
-
O
p
t
i
c
s
,
L
.
N
o
v
o
t
n
y
y
B
.
H
e
c
h
t
,
C
a
m
b
r
i
d
g
e
U
n
i
v
e
r
s
i
t
y
P
r
e
s
s
,
2
0
0
6
elementos
Pinhole o Fibra: ltra haz para
darle perl Gaussiano
L1: lentes coliman haz
excitaci on
Beamsplitter / Dicr oico (DM):
Sobrellenan objetivo (O) de
alta NA
Barredor xyz: mueve muestra
respecto al foco
Single Photon Avalanche
Photodiode: Registra se nal
encauzada por O y L2/M a
trav es de pinhole
V. A. Bettachini () Microscopia confocal 11 / 12
Para nalizar...sobre el inventor
Marvin Minsky
Obra
Patente del microscopio confocal (1955)
Coautor con Seymour Papert de
Perceptrones, que redeni o el estudio
de redes neuronales articiales (1969)
Con Papert (inventor del lenguaje LOGO)
creo la primer tortuga robot LOGO para
educaci on, en base a estudios de Piaget
Pope del area de inteligencia articial,
director vitalicio del grupo de IA en el MIT
V. A. Bettachini () Microscopia confocal 12 / 12