Coryne Diphtheriae 1

Aislamiento y Caracterizacin de Corynebacterium
diphtheriae

Servicio Bacteriologa Clnica - INEI - ANLIS Dr.
Carlos G. Malbrn
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INTRODUCCION

La difteria es una enfermedad aguda, de notificacin obligatoria que se clasifica de acuerdo al
sitio de manifestacin; en respiratoria y cutnea. La difteria cutnea se observa ms frecuentemente
en zonas tropicales y subtropicales.
La enfermedad respiratoria se presenta por una infeccin local del tracto respiratorio superior y
efectos sistmicos, que se manifiestan especialmente en corazn y nervios perifricos y que son
producidos por la exotoxina.
La etiologa, el modo de transmisin, el mecanismo de patogenicidad, la estructura molecular de
la toxina, su funcin y su mecanismo de accin han sido claramente establecidos. Esto ha permitido
que fueran desarrollados mtodos efectivos para el diagnstico, tratamiento y prevencin de esta
grave enfermedad.

Resea Histrica

400 aos A.C. Hipcrates realiza la primera descripcin clnica de difteria. Tambin
existen referencias de la enfermedad en la antigua Siria y Egipto.
Siglo XVII. Se producen epidemias en Europa.
Siglo XVIII. La enfermedad llega a las colonias americanas, donde se registra una epidemia
alrededor del ao 1735. Fallecen familias completas en pocas semanas a causa de esta
infeccin.
1883. Klebs demuestra que Corynebacterium diphtheriae es el agente etiolgico de la
difteria.
1884. Loeffler observa que el microorganismo puede ser cultivado solamente de la cavidad
nasofarngea y postula que el dao de los rganos internos se debe a la presencia de una
toxina soluble.
1888. Roux y Yersin inoculan animales de laboratorio con filtrados de C. diphtheriae libre
de clulas y observan que stos presentan las mismas manifestaciones sistmicas de la
difteria humana. Esto demuestra que la exotoxina es el factor de virulencia ms importante.
1890. von Behring y Kitasato inmunizan cobayos con una forma atenuada de toxina y
comprueban que el suero de los animales inmunizados contiene una antitoxina capaz de
proteger a otros animales susceptibles contra la enfermedad. Esta toxina modificada, es
adecuada para inmunizar animales y obtener antitoxina, pero produce reacciones locales
severas en humanos y no puede ser usada como vacuna.
1909. Theobald Smith demuestra que la toxina diftrica neutralizada por la antitoxina
(forma un complejo toxina-antitoxina, llamado TAT) sigue siendo inmunognica y no
produce las reacciones locales observadas con la toxina modificada utilizada por von
Behring.
1910. Durante algunos aos, TAT es usada para la inmunizacin activa contra difteria. TAT
presenta dos inconvenientes para su uso como vacuna; alta toxicidad y la mezcla con la
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antitoxina (obtenida en suero de caballo) tiene caractersticas alergnicas y sensibiliza a los
individuos contra el suero.

1913. Schick disea una prueba cutnea como forma de determinar la inmunidad a la
difteria en humanos.
1929. Ramn demuestra la conversin de la toxina diftrica a no txica (toxoide) utilizando
formaldehdo.
1951. Freeman descubre que las cepas patgenas (toxignicas) de C. diphtheriae son
lisognicas (estn infectadas por un fago temperado), mientras que las no lisognicas son
no toxignicas. Esto demuestra que el gen para la produccin de la toxina esta localizado en
el DNA del fago .
1960. Pappenheimer y su grupo demuestran el mecanismo de accin de la toxina diftrica.
Descubren que la toxina inhibe la sntesis de protenas en el ribosoma, bloqueando la
transferencia de aminocidos desde el tRNA a la cadena polipeptdica en crecimiento.

Distribucin de la Enfermedad

A principios del siglo XX, en Estados Unidos, la difteria era una enfermedad comn,
especialmente en nios y una de las principales causas de muerte. Durante los aos 20, se
registraban anualmente 150.000 casos y alrededor de 13.000 muertes como causa de esta
enfermedad. En el ao 1945, luego que se introdujo la vacunacin, el nmero de casos descendi a
19.000.

1970-1979. (USA). Se registraron un promedio de 196 casos anuales.
1980-1989. (USA). El nmero descendi a 24 casos (2 fueron fatales y 18 enfermos eran
mayores de 20 aos). La mayora de los afectados eran individuos no vacunados con
vacunacin incompleta.
La prevalencia de difteria en frica, Asia, Amrica Central y Sudamrica es alta. La OMS
inform 92.000 casos de difteria respiratoria en 1980 y 46.000 casos en 1983.
En los aos 80 se registraron epidemias en Suecia y Dinamarca
A principios de los 90, en los estados independientes de la Unin Sovitica hubo un
aumento dramtico en el nmero de casos. Entre 1990 y 1996, fueron informados por la
Federacin Rusa ms de 110.000 casos de difteria y 2.900 muertes. La incidencia declina a
partir de 1996, debido a la vacunacin secundaria y a la iniciacin de programas de
deteccin temprana, implementados a causa de la epidemia.
En nuestro pas, la difteria pas de cientos de casos anuales en la dcada del 70 a:

Ao 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002
Casos 31 1 4 3 3 5 1 0 2 0 0 0 0
Fuente: SINAVE, Ministerio de Salud de la Nacin

Estructura y Clasificacin de Corynebacterium diphtheriae

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Corynebacterium diphtheriae es un bacilo gram positivo, aerobio, no esporulado, pleomrfico,
en forma de clava y disposicin en letras chinas, inmvil y no capsulado. La coloracin de Gram
realizada a partir de cultivos viejos, es variable. Con la coloracin de azul de metileno pueden
observarse grnulos metacromticos (polimetafosfatos) intracelulares, de color azul-prpura.

La mayora de los aislamientos requieren cido pantotnico y nicotnico para su desarrollo;
algunos otros, necesitan tiamina, biotina o cido pimlico. Para una ptima produccin de toxina, el
medio debe ser suplementado con aminocidos y deficiente en hierro.
Las cepas toxignicas son lisognicas por la accin de un bacterifago, que es portador del gen
estructural tox que codifica la produccin de la toxina diftrica.
Las cepas no toxignicas (tox-) causan un cuadro leve, parecido a la forma localizada producida
por las cepas (tox+), pero no producen la forma diseminada. Las cepas tox- pueden convertirse en
tox+ in vivo, por infeccin con el fago portador del gen de la toxina (fago conversin).
C. diphtheriae comprende cuatro biotipos, var. gravis, var. intermedius, var. mitis y var.
belfanti. Todos los biotipos, con excepcin del biotipo var. belfanti, pueden producir la exotoxina
letal. Este microorganismo se clasifica en lisotipos en base a su sensibilidad frente a diferentes
corinebacteriofgos.

Descripcin de la Enfermedad

Es una enfermedad del tracto respiratorio superior que se caracteriza por dolor de garganta,
fiebre y presencia de una membrana adherente, la que se localiza en los pilares tonsilares y en la
nasofaringe.
Inicialmente, se desarrolla una lesin producida por injuria necrtica del tejido epitelial. Como
resultado de sta: una red de fibrina, leucocitos, eritrocitos, clulas epiteliales muertas, y bacilos de
C. diphtheriae de crecimiento rpido, forman una membrana que recubre el rea y que se conoce
como pseudomembrana.
El bacilo diftrico no invade los tejidos subyacentes del epitelio y en el sitio de la lesin en
nasofaringe produce la toxina, la cual es absorbida y diseminada por los vasos linfticos y la sangre
a los tejidos susceptibles de los diferentes rganos. Como resultado de la patologa sistmica, se
producen cambios degenerativos en los tejidos del corazn, msculo, nervios perifricos, adrenales,
riones, hgado y bazo.

Modo de Transmisin

El hombre es el nico reservorio de la infeccin, aunque se han aislado cepas toxignicas en
caballos. El contacto directo facilita la transmisin de la enfermedad, a travs de aerosoles y/o
secreciones nasofarngeas.
Los portadores son fuente de transmisin, pero los pacientes con infeccin activa, son los que
ms pueden transmitir la enfermedad. El polvo y las ropas tambin pueden contribuir a la
transmisin.

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Perodo de Incubacin

El perodo de incubacin, generalmente, es de 2 a 5 das.
Para la difteria cutnea, el perodo de incubacin es de 7 das, despus de la infeccin primaria
de piel.

Signos y Sntomas

Sntomas No Especficos

Fiebre leve y escalofros (entre el 50 y el 85% de los casos).
Malestar general y dificultad para respirar.
Dolor de garganta (85-90%).
Voz ronca y disfagia (26-40%).
Edema y linfoadenopata cervical (50%).
Tos, rinorrea (mucopurulenta, que puede ser tambin sanguinolenta).
Estridor.
Nauseas y vmitos.

Sntomas Especficos

Sospechar difteria cuando se observa una pseudomembrana
y el paciente presenta nasofaringitis, tonsilitis o laringitis

La enfermedad respiratoria se caracteriza por la pseudomembrana fibrosa en las vas
respiratorias superiores, seguido por la produccin de exotoxina. Hay dificultad respiratoria por
obstruccin de la va area superior debido a la presencia de la membrana.
La mucosa orofarngea es inicialmente edematosa, hay hiperemia, seguida de necrosis epitelial e
inflamacin aguda. La pseudomembrana es generalmente adherente, delgada, de color blanco
griscea. Se localiza en paladar, faringe, epiglotis, laringe o trquea y puede extenderse al rbol
traqueo bronquial. Sangra al ser retirada (Figura 1).

Cuello: Se observa marcado edema en los pilares tonsilares, en la vula, en la regin submaxilar
y cuello anterior. Puede haber linfoadenopata cervical anterior y hemorragias petequiales.

Sintmas cardiovasculares: La toxicidad cardiovascular generalmente se evidencia despus de
1 a 2 semanas del comienzo de la enfermedad.
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La miocarditis puede presentarse en las dos terceras partes de los enfermos y el 10 al 25% de los
mismos desarrollan disfuncin cardiaca. Otras complicaciones son colapso circulatorio, paro
cardaco, bloqueo atrioventricular y disrritmias.

Sntomas neurolgicos: Alrededor de las tres cuartas partes de los pacientes con enfermedad
severa desarrollan neuropata. Pueden presentar neuritis y parlisis motora. Se observa parlisis de
los nervios craneales (ej: oculomotor, nasociliar) y perifricos.
Despus de 2 a 8 semanas de establecida la infeccin se manifiesta la neuritis perifrica.
El sntoma neurolgico revierte completamente con la resolucin de la infeccin.

Otros sistemas: Puede presentarse necrosis focal renal, heptica y de glndulas adrenales.

La difteria cutnea se asocia con un trauma previo o una enfermedad primaria de la piel.
Eritema, dolor y presencia de exudado son caractersticos de las infecciones secundarias. Las
lesiones aparecen como lceras con membranas grisceas (Figura 2).

Patogenicidad

La patogenicidad de Corynebacterium diphtheriae comprende dos mecanismos diferentes.

a- Invasin del Tejido de la Cavidad Nasofarngea

Requiere la colonizacin y posterior proliferacin de la bacteria. Hasta el momento, se
desconocen los factores de colonizacin de C.diphtheriae. Sin embargo, otros factores, adems de
la produccin de la toxina podran contribuir a la virulencia.
C. diphtheriae produce neuraminidasa que cliva el cido silico de la superficie celular en piruvato
y cido N-acetil neuraminico. Esta enzima podra ser una de las causas de injuria celular.
El factor de anclaje (6,6'-di-O-micoloil-a,a'-D-trehalose) es un componente de la superficie de C.
diphtheriae, pero su rol en la colonizacin del husped no ha sido esclarecida.
Estudios epidemiolgicos han demostrado que un lisotipo determinado puede persistir en una
poblacin por largos perodos y puede ser suplantado por otro lisotipo. La emergencia y
predominancia de un nuevo lisotipo en una poblacin, se debe probablemente a su capacidad de
colonizar la nasofaringe y competir en ese nicho ecolgico.

b- Toxignesis

La toxina diftrica causa la muerte de la clula eucariota y de los tejidos por inhibicin de la
sntesis de protenas. Aunque la toxina es responsable de los sntomas letales de la enfermedad, la
virulencia de C. diphtheriae no puede ser atribuida slo a la toxigenicidad, ya que aparentemente
una fase invasiva precede a la toxignesis.
Los biotipos de Corynebacterium diphtheriae conocidos como gravis, intermedius y mitis se
diferencian en cuanto a su patogenicidad. El biotipo gravis es el ms agresivo, seguido por
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intermedius y por ltimo mitis. Todos producen la misma toxina y colonizan la nasofaringe. La
diferencia en la virulencia, entre los tres biotipos, puede explicarse por la rapidez y cantidad de la
toxina producida por cada uno de ellos y por tener diferentes velocidades de crecimiento.

Toxigenicidad

Los factores de mayor importancia en la produccin de toxina diftrica son:

Baja concentracin extracelular de hierro.
Presencia de un profago lisognico en el cromosoma bacteriano.

El gen de la toxina se encuentra en el genoma del profago, pero una protena bacteriana
represora, controla la expresin del gen. El represor es activado por el hierro y de esta forma, el
hierro tiene influencia en la produccin de la toxina. Las bacterias lisognicas sintetizan grandes
cantidades de toxina en condiciones deficientes de hierro.

Importancia del Hierro

En cultivos in vitro, el factor ms importante que controla la produccin de toxina es la
concentracin de hierro inorgnico (Fe
++
o Fe
+++
) presente en el medio de cultivo.
La toxina es sintetizada en grandes cantidades, slo despus que el aporte de hierro exgeno ha
sido agotado. Esto tiene importancia prctica en la produccin industrial del toxoide.
La bacteria no puede producir grandes cantidades de toxina hasta que el aporte de hierro en los
tejidos del tracto respiratorio superior no disminuya. La regulacin de la produccin de toxina es
parcialmente controlada por el hierro. El gen tox es regulado por un mecanismo de control negativo,
mediante una molcula represora, producto del gen DtxR, que es activado por el hierro.
La expresin del gen tox depende del estado fisiolgico de C. diphtheriae. Bajo condiciones en
las cuales el hierro es el sustrato limitante del crecimiento, el hierro se disocia de DtxR, el gen tox
se dereprime y la toxina diftrica es sintetizada y secretada al medio de cultivo (Esquema 1).

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tox
P/O Corinebacterifago
dtxR
P Corynebacterium diphtheriae
DtxR + Fe
2+
DtxR-Fe
2+

Reduce Niveles
de TD

Esquema 1. Mecanismo Regulador del Hierro en la produccin de la Toxina Diftrica
TD = toxina diftrica, P = promotor, dtxR = gen regulador de TD,
DtxR = aporepresor, P/O = promotor/operador, tox = gen toxina

Importancia del fago

El fago contiene el gen estructural de la molcula de la toxina. El experimento original demostr
que la lisogenia de C. diphtheriae por fagos beta mutados, producan una molcula no txica, pero
antignicamente similar a la toxina (llamado CMR por cross-reacting material). Las propiedades
de esta molcula, demostraron sin duda, que el gen tox se encuentra en el fago y no en el genoma
bacteriano.
Aunque el gen tox no forma parte del DNA bacteriano, la regulacin de la produccin de la
toxina, se encuentra bajo el control de la bacteria, ya que el gen regulatorio DtxR forma parte de su
genoma y la produccin de toxina depende del metabolismo bacteriano del hierro.
El gen estructural tox para la toxina diftrica, es portado por una familia de corinebacterifagos
muy relacionados, de los cuales el fago , es el ms estudiado.

Mecanismo de Accin de la Toxina

La toxina diftrica, una protena de 58 kD, es extraordinariamente potente, en especies sensibles
(ej: humanos, monos, conejos, cobayos). Una dosis de slo 100 a 150 ng/kg de peso corporal, es
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letal. Est compuesta por una sola cadena polipeptdica de 535 aminocidos. Los estudios genticos
y cristalogrficos por rayos X, demuestran que la toxina esta compuesta por tres dominios
estructurales y funcionales (Figura 3):

dominio cataltico (A) Tiene actividad de N-terminal ADP-ribosiltransferasa.
dominio de unin (B) de la toxina al receptor de la clula eucariota, ubicado en la
superficie celular, que permite que la toxina entre a la clula mediante un mecanismo de
endocitosis mediada por un receptor.
dominio de translocacin (T) Una regin que permite que el dominio cataltico atraviese
la membrana celular (dominio transmembrana). En el endosoma, una cada del pH de 7.0 a
5.0 produce un cambio conformacional en el dominio de translocacin (T) de la toxina, la
cual luego se inserta en la membrana endosomal y facilita la transferencia del dominio
cataltico al citoplasma.

La digestin suave de la toxina con tripsina y reduccin en condiciones desnaturalizantes, la
cliva en dos fragmentos polipeptdicas (A y B). El fragmento A es el componente N-terminal de la
toxina de 21 kD y contiene el centro cataltico para la ADP-ribosilacin del factor de elongacin 2
(EF-2).
La toxina se une a un receptor especfico (conocido como receptor HB-EGF,heparin- binding
epidermal growth factor) de la clula y penetra por endocitosis. La acidificacin de la vescula
endoctica produce un cambio en la conformacin de la protena y la insercin de uno de sus
segmentos dentro de la membrana endosomal. Como resultado de la actividad sobre la membrana
del endosoma, la subunidad A, se separa de la subunidad B, mientras A se inserta y pasa a travs de
la membrana (Figura 4).
Una vez en el citoplasma, el fragmento A vuelve a tener su conformacin inicial y su actividad
enzimtica. El fragmento A cataliza la transferencia de ADP-ribosa desde el NAD al factor de
elongacin 2 (EF-2) de la clula eucariota.

Se inhibe la funcin de EF-2 en la sntesis de protenas, lo que causa la muerte de la clula. La
unin del grupo ribosil-ADP se realiza a un derivado poco frecuente de histidina llamado diftamina
(Figura 5).
La toxina diftrica nativa es inactiva y puede ser activada por tripsina en presencia de tiol. La
actividad enzimtica del fragmento A no se manifiesta en la toxina intacta. El fragmento B es
necesario para unir la toxina nativa a su receptor y permitir la salida del fragmento A del endosoma.
El extremo C terminal del fragmento B, contiene una regin peptdica que se une al receptor
HB-EFG de la membrana celular y el extremo N-terminal es una regin hidrofbica que se insertar
dentro de la bicapa lipdica de membrana.
El precursor del receptor especfico de membrana EB-EFG es una protena de superficie
presente en muchas clulas. El nmero y distribucin de receptores HB-EGF, determina la
susceptibilidad de una especie animal y de algunos tejidos a la toxina diftrica.
Normalmente, el precursor HB-EGF libera una hormona peptdica que tiene actividad sobre el
crecimiento normal y la diferenciacin celular.
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Una de las hiptesis, es que el receptor HB-EGF, es una proteasa que cliva el fragmento A del
fragmento B y reduce los puentes disulfuro entre ambos, en el momento en que el fragmento A sale
a travs de la membrana endosomal al citoplasma.

Tratamiento

Los pacientes con evidencia clnica de difteria debern ser aislados
y tratados antes que el laboratorio confirme el diagnstico

Administrar rpidamente la antitoxina en los casos severos, debido a las complicaciones (ej:
miocarditis, neuritis), las que estn directamente relacionadas con el tiempo de demora en la
administracin de la misma.

La antitoxina diftrica es un antisuero hiperinmune de caballo que neutraliza la toxina antes
que penetre a la clula, lo cual es importante en la prevencin de las secuelas de la difteria.
Aplicar por va intramuscular una sola dosis de 20.000 a 100.000 unidades, segn la
duracin de los sntomas, la zona de afeccin y la gravedad de la enfermedad.

El tratamiento antibitico erradica al microorganismo y limita la produccin de la toxina.
Sin embargo, el antibitico no es sustituido por la antitoxina. Se recomienda en general
penicilina o eritromicina. Ambas drogas son igualmente efectivas en resolver la fiebre y los
sntomas locales, sin embargo, la eritromicina ha demostrado ser superior en la erradicacin
del estado de portacin. Deber administrarse tratamiento antibitico tanto en enfermos
como en contactos ntimos con sintomatologa. Antes deben tomarse las muestras para
cultivo. Se recomienda aplicar:

Eritromicina endovenosa (40 a 50 mg/Kg/da, mximo 2 g /da) hasta que el paciente
pueda deglutir. Luego, pasar a un rgimen de igual dosis de eritromicina oral,
dividida en cuatro tomas diarias o penicilina V, 125-250 mg 4 veces por da, durante
un perodo de 14 das.
Penicilina G sdica intramuscular (100.000 a 150.000 U/Kg/da dividida en 4 dosis
durante 14 das.

Se define como contactos ntimos, a los individuos que duermen en la misma casa o
comparten alimentos, bebidas o utensilios de comida con el enfermo, as como al personal
de salud expuesto a las secreciones respiratorias del paciente.

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Los enfermos debern permanecer en estricto aislamiento a pesar de la terapia y an
despus de la misma.

Si la laringe est comprometida se requerir la entubacin, a fin de facilitar la
remocin de la membrana traqueobronquial. Se recomienda el monitoreo cardaco
para la deteccin de posibles arritmias. Debern tener dos cultivos negativos
consecutivos, con un intervalo de 24 horas entre los mismos, a fin de documentar la
erradicacin del microorganismo. Los materiales para estos cultivos, sern tomados
por lo menos 2 semanas despus de concluda la terapia antimicrobiana.

En el caso de los contactos ntimos con sintomatologa, se realizar: 1) toma de muestra
para cultivo, 2) tratamiento antibitico, 3) evaluacin para iniciar la terapia con antitoxina
diftrica. En el caso que los cultivos fueran positivos, se repetir dos veces ms el cultivo
nasofarngeo, dos semanas despus de terminado el tratamiento antibitico. Las muestras
sern tomadas con un intervalo de 24 hs:

Si los cultivos son negativos el contacto ser considerado libre de la infeccin.
Si alguno de los cultivos resultara positivo, se le administrar eritromicina oral
durante 10 das ms y se repetirn los cultivos.

Los casos y contactos con sintomatologa que no tuvieran la vacunacin al da, debern
comenzar o completar un plan de inmunizacin activa con toxoide diftrico, de acuerdo a la
edad, durante la convalecencia.

Con los contactos ntimos asintomticos se deber:

Tomar hisopados nasofarngeos
Controlar la aparicin de sntomas, por lo menos durante 7 das despus de la ltima
exposicin.
Todos los contactos ntimos recibirn tratamiento antibitico independientemente
del resultado del cultivo y del estado de inmunizacin.
Vacunacin de bloqueo de todos los contactos sin importar antecedentes de
vacunacin.

Los contactos ntimos adultos, cuya ocupacin incluya la manipulacin de alimentos o la
relacin ntima con nios no inmunizados, debern ser eximidos de sus funciones hasta
que los exmenes bacteriolgicos corroboren que ya no son portadores.

Los portadores asintomticos con cultivo positivo de C.diphtheriae no deben notificarse
como casos sospechosos o confirmados de difteria. Se deber:

Vacunar si no tuvieran esquema completo de vacunacin o hayan recibido la ltima
dosis hace ms de un ao.
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Dar penicilina o eritromicina segn dosis adecuadas.
Administrar una sola dosis intramuscular de penicilina benzatnica de 600.000
unidades para nios menores de 6 aos de edad y 1.200.000 unidades para los
mayores de esa edad.
Alternativamente, se puede utilizar hasta 2 gr. diarios de eritromicina por va oral
durante 7 das en los adultos. En los nios administrar 40 mg. diarios de eritromicina
por Kg. de peso durante 7 das.
Dos semanas despus del tratamiento, hacer un cultivo farngeo de seguimiento.
Repetir el tratamiento a aquellas personas cuyos cultivos siguen dando positivos.

Epidemiologa

La inmunizacin masiva sostiene la teora que cuanto mayor es la poblacin (>70-75%)
adecuadamente vacunada, el riesgo de grandes epidemias disminuye, an en pequeos grupos no
inmunizados dentro de la poblacin. Sin embargo, en algunas poblaciones la inmunizacin masiva
fracas en la prevencin de epidemias y no siempre erradic la portacin de C. diphtheriae.
Concentraciones bajas de antitoxina srica no previenen la enfermedad. La concentracin de
antitoxina en suero para la prevencin de la enfermedad es de 0.01 UI/ml o mayor. Sin embargo, la
antitoxina no impide la colonizacin ni erradica el estado de portacin. En Estados Unidos, por lo
menos 50% de los adultos mayores de 60 aos tienen niveles de antitoxina de 0.01 UI/ml o
menores. Por esta razn, se deben dar dosis de refuerzo cada 10 aos.
Se deben vacunar quienes estn expuestos a un riesgo, quienes realicen viajes a reas endmicas
de alto riesgo o durante una epidemia.
Son grupo de riesgo:

Alcohlicos y drogadictos.
Personas de bajo nivel socio-econmico.
Individuos que viven en estado de hacinamiento.
Entre los homosexuales ha aumentado la tasa de incidencia.

En Estados Unidos, Europa y Europa del Este se han producido brotes recientes en poblaciones
de alcohlicos y drogadictos. Dentro de este grupo, los portadores de C. diphtheriae toxignico
tenan niveles moderadamente altos de antitoxina.

Los brotes de difteria casi siempre estn asociados a portadores que regresan de zonas, donde la
difteria es endmica. Los casos recientes de difteria clnica, ocurridos en Estados Unidos y Europa
estuvieron asociados a viajeros que regresaron de Rusia y Europa del Este.
Pueden ocurrir grandes brotes en poblaciones en donde los planes de vacunacin activa no se
mantienen.

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Inmunizacin y Prevencin

La prevencin se logra a travs de la vacunacin con el toxoide diftrico inactivo (toxina
diftrica tratada con formaldehdo). El esquema es el siguiente:

Esquema de Vacunacin
Edad
Cudruple Bacteriana
(DPT+HIb)
Triple Bacteriana
DPT
Doble Adultos
dTa
Recin nacido - - -
2 meses 1ra. Dosis - -
4 meses 2da. Dosis - -
6 meses 3ra. Dosis - -
12 meses - - -
18 meses 4ta. Dosis - -
6 aos - Refuerzo -
16 aos - - Refuerzo
Cada 10 aos - - Refuerzo

Referencias:

DPT + Hib = Difteria Ttanos Coqueluche + Haemophilus influenzae tipo b
DPT = Difteria Ttanos Coqueluche
dTa = Difteria - Ttanos
Embarazadas: Se indica dTa como esquema bsico a partir del segundo trimestre de embarazo

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Figura 1. Faringitis por Corynebacterium diphtheriae.
Obsrvese la pseudomembrana adherente, blanca griscea,
asimtrica, con inflamacin a su alrededor. Puede ocupar
amgdalas, pilares y pared posterior de la faringe

Fuente: www.vet.uga.edu/erc/WEBFILES/sgrposrd
BAILEY AND SCOTT'S DIAGNOSTIC MICROBIOLOGY, 9
th
edition. E.J. Baron, L.R. Peterson, and S.M. Finegold,
editors, Moseby-Year Book, Inc., 1994.

Figura 2. Lesin cutnea de difteria localizada en la pierna

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Fuente: http://phil.cdc.gov/phil/results.asp

Figura 3. Monmero de la Toxina Diftrica.
A (rojo) es el dominio cataltico; B (amarillo) es el dominio de unin al receptor
de la celula; T (azul) es el dominio hidrofbico que se inserta en la membrana
del endosoma para la liberacin de A dentro del citoplasma

Fuente: Todar's Online Textbook of Bacteriology
Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2002.
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Figura 4. Actividad de la Toxina Diftrica en Clulas Eucariotas.
A representa A/B de la toxina del dominio A (cataltico). B es el
dominio B (receptor). T es el dominio T (hidrobofbico)
que est inserto dentro de la membrana celular

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Fuente: Todar's Online Textbook of Bacteriology
Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2002.

Figura 5. Mecanismo de Accin del Fragmento A de la Toxina Diftrica
en la Sntesis de Protenas

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Fuente: Adaptado de Enfermedades Infecciosas: Principios y Prctica, Mandell/Douglas/Bennett. Editorial
Mdica Panamericana, 2000.

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TOMA DE MUESTRAS, MEDIOS DE CULTIVO, IDENTIFICACION

TOMA DE MUESTRAS

Tipo de Muestras

Para el diagnstico etiolgico de la enfermedad respiratoria se requieren muestras de
hisopados de fauces y nasofarngeos y/o trozos de membrana.

Si se sospecha difteria cutnea las muestras deben ser de piel, garganta y nasofarngea.

Toma de Muestras

Los hisopos utilizados para la toma de muestras son los habituales: hisopos estriles con punta
de algodn, dacrn o alginato de calcio.

La toma de muestras debe realizarse previo al tratamiento antibitico

a- Hisopado de Fauces

La faringe debe estar claramente visible y bien iluminada.
Deprimir la base de la lengua con baja lengua e hisopar la garganta, sin tocar saliva ni
mucosas laterales.
Frotar vigorosamente cualquier membrana, o rea inflamada, presionando ligeramente con
el hisopo y ejerciendo un movimiento de rotacin.
Si existe alguna membrana, levantar el borde e hisopar por debajo de la misma, para
acceder a los microorganismos diftricos localizados ms profundamente. Es
recomendable, adems, enviar un trozo de membrana.
Realizar extendidos en 2 portaobjetos. Dejar secar al aire y fijar por calor. Realizar la
coloracin de Gram y la coloracin de azul de metileno de Leffler.
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Carlos G. Malbrn
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Remitir la muestra al laboratorio junto con los portaobjetos.

b- Hisopado Nasofarngeo

Insertar el hisopo flexible de alambre de cromo o acero inoxidable en la nariz, a travs del
orificio nasal, ms all de la parte anterior de la narina.
Introducir suavemente el hisopo en la nariz hasta encontrar resistencia a nivel de los
cornetes (no debe utilizarse la fuerza para salvar algn tipo de obstruccin).
Rotar el hisopo sobre la mucosa nasal.

Realizar extendidos en 2 portaobjetos. Dejar secar al aire y fijar por calor. Realizar la
coloracin de Gram y la coloracin de azul de metileno de Leffler.

c- Muestra Cutnea

Limpiar con solucin salina estril y remover el material adherido a la lesin.
Presionar el hisopo firmemente dentro de la misma.

Nota: Introducir el hisopo con la muestra dentro de un tubo con medio de Amies,
aproximadamente, a un tercio del fondo. Cortar el sobrante del palillo del hisopo y cerrar la tapa
a rosca, empujando el hisopo hacia el fondo del tubo. Mantener a temperatura ambiente durante
el transporte.

TRANSPORTE DE MUESTRAS

Enviar el hisopo y/o la muestra de membrana en medio Amies con carbn activado;
especialmente cuando los cultivos no se realizan en el mismo lugar donde se efectu la
toma del material.

Como alternativa, puede colocarse el hisopo en un tubo estril conteniendo cristales de
slica gel en el fondo y tapa a rosca, para evitar la desecacin.

El envo se realiza a temperatura ambiente, cualquiera sea el sistema de transporte
utilizado.

El tiempo para el transporte en medio de Amies no debe exceder las 24 horas. En slica gel,
el tiempo de transporte puede ser mayor de 24 horas, si bien, siempre es aconsejable el
rpido procesamiento de la muestra.

diphtheriae

Carlos G. Malbrn
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PROCESAMIENTO DE LA MEMBRANA

Utilizar uno de los siguientes mtodos:

a- Homogeneizacin con Bistur Estril

Fragmentar el trozo de membrana en una placa de petri, con bistur estril, hasta que su
consistencia sea homognea. Se puede utilizar un pequeo volumen de caldo nutritivo
para suspender el material y mantenerlo hmedo.
Tomar la muestra disgregada y sembrar con pipeta Pasteur estril.

b- Homogeneizacin con Mortero

Colocar una pequea cantidad de arena estril en el mortero. (La arena ayuda a la
maceracin del material).
Agregar 1 a 2 ml de caldo nutritivo y una porcin de la membrana.
Disgregar la muestra realizando un movimiento circular con el piln.
Retirar el material del mortero utilizando una pipeta Pasteur.
Colocar en tubo estril y centrifugar durante 1 minuto a 2500-3000 rpm para separar el
homogeneizado de la arena.
Retirar el sobrenadante con pipeta Pasteur y proceder al cultivo.

MEDIOS DE CULTIVO

Siembra de hisopados y homogeneizados de membrana. Medios utilizados

Medio Agar Sangre Cistina Telurito (ASCT).
Medio Leffler (ML). Se aconseja para la observacin de la morfologa bacteriana.
Agar Sangre (AS).
Caldo Todd Hewitt (CTH) con 3 % de sangre.

SIEMBRA DE LA MUESTRA

En lo posible, las muestras clnicas deben ser sembradas sin demora

diphtheriae

Si el hisopo farngeo o nasofarngeo se encuentra deshidratado o es recibido en slica gel,
colocarlo en un caldo Todd Hewitt con 3% de sangre estril. Incubar durante 18 hs y
resembrar en un medio ASCT.

Si el hisopo fue enviado en el medio de transporte de Amies y/o si se dispone del
homogeneizado de membrana, realizar la siembra en los medios ASCT, AS.

Incubar los cultivos a 37 C en aerobiosis.

Examinar las placas de ASCT y AS a las 18 h, 24 h y 48 hs C. diphteriae desarrolla colonias
negras en el medio de cultivo ASCT.

Sembrar caldo nitrato, medio urea y realizar la prueba de la pirazinamidasa a partir de las
colonias negras con morfologa y microscopa compatibles con C. diphtheriae y sembrar de
las mismas colonias AS, para realizar la identificacin bioqumica de las mismas.

Algoritmo para el Diagnstico de Laboratorio de Difteria

Diferenciacin
Diagnstico de casos,
contactos y portadores
Agar telurito, agar sangre
18 a 48 hs
Agar telurito, agar sangre
18 a 48 hs
Colonias negras
Bacilos Gram positivos
Catalasa positiva
Nitrato
24-48 hs
Pirazinamidasa
4 hs
Urea
24 hs
Pirazinamidasa
4 hs
Biotipificacin
24 hs
Laboratorio Referencia
Prueba de Elek
24 hs 48 hs
PCR: 6 hs
Cistinasa
24 hs
Agar sangre
(cultivo puro)
Laboratorio
de
Referencia
Muestra Clnica

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CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS

Examen Microscpico

a- Coloracin de Gram

Bacilos pleomrficos gram positivos, dispuestos en forma de letras chinas y en empalizada,
posibles formas cocobacilares, ms predominantes en cultivos viejos. Los frotis directos de garganta
muestran mucho menos pleomorfismo; los microorganismos son generalmente ms cortos y se
tien ms uniformemente que los cultivados (Figura 6).

No debe realizarse el diagnstico presuntivo de difteria nicamente por el examen directo,
ya que la microscopa puede dar resultados falsos positivos o falsos negativos

b- Coloracin de Azul de Metileno de Leffler

Bacilos rectos o levemente curvos, frecuentemente, se deforman en forma de clavas en uno o
ambos extremos y no se tien con uniformidad sino que muestran grnulos (metacromticos color
rojo prpura) o barras que se colorean ms profundamente. Pueden mostrar diversas formas: en
clava, granular, en barra, en cua y de coloracin intensa.

La coloracin de Leffler no es especfica para C. diphtheriae

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CARACTERISTICAS DE LOS CULTIVOS Y PRUEBAS DE IDENTIFICACION

Aspecto de las Colonias

a- Medio Agar Sangre Cistina Telurito

Corynebacterium diphtheriae reduce el telurito del medio a telurito metlico, el cual precipita y
produce el desarrollo de colonias negras, gris acero, de 1 a 3 mm de dimetro (Figura 7). El aspecto
de las colonias es orientador de los posibles biotipos.

C. diphtheriae var. intermedius: colonias negras planas y pequeas.
C. diphtheriae var. mitis y C. diphtheriae var. gravis : colonias negras, ms grandes,
convexas, lisas y brillantes.

b- Medio de Leffler

Luego de 24 horas de incubacin a 37 C, las colonias tienen alrededor de 1mm de dimetro y
son circulares, de superficie lisa y borde entero. Son cremosas, fcilmente emulsionables en agua o
solucin fisiolgica y convexas, con centro ligeramente elevado. Despus de 48-72 hs. de
incubacin, las colonias se agrandan, el centro se hace ms elevado y la periferia sigue siendo plana
y ms transparente que el centro.

El ML no es selectivo para C. diphtheriae, pueden desarrollar otros microorganismos,
por lo cual no es recomendado como medio de aislamiento primario

c- Medio Agar Sangre

C. diphtheriae var. intermedius: ms pequeas, planas, cremosas, transparentes, no
hemolticas.
C. diphtheriae var. mitis y C. diphtheriae var. gravis: ms grandes, convexas, dbil beta
hemlisis.

d- Medio Agar Tinsdale

Este medio de cultivo se utiliza para la deteccin de la enzima cistinasa y es de utilidad para la
identificacin presuntiva de C. diphtheriae.
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El medio agar Tinsdale contiene telurito y cistina. La cistinasa produce sulfuro de hidrgeno a
partir de la cistina, el cual reacciona con el telurito formando un halo marrn difuso alrededor
de una colonia negra, luego de incubar a 37 C durante 24-48 hs. Otras especies de corinebacterias
pueden dar colonias negras, pero sin la formacin del halo marrn (Figuras 8A y 8B).

Reaccin positiva: colonias negras con halo marrn.

C. diphtheriae
C. pseudotuberculosis
C. ulcerans

Reaccin negativa: ausencia de halo marrn.

Otras corinebacterias

Nota: No se recomienda el medio de Tinsdale para el cultivo primario, dado que es muy selectivo
y por lo tanto puede dar resultados falsos negativos, especialmente en muestras clnicas que
tengan un bajo nmero de microorganismos.

e- Produccin de Pirazinamidasa

Esta enzima hidroliza la pirazinamida dando cido pirazinoico. El cido reacciona con el sulfato
amnico ferroso dando un compuesto rojo naranja.

Reaccin positiva: rosa/naranja.

Otras corinebacterias

Reaccin negativa: incoloro o amarillo plido.

C. diphtheriae
C. ulcerans

Las pruebas de pirazinamidasa y cistinasa son tiles para diferenciar las especies
potencialmente toxignicas de otras corinebacterias

f- Produccin de Ureasa

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La urea es una diamina del cido carbnico que puede ser hidrolizada por la enzima ureasa
existente en algunos grupos bacterianos, con liberacin de amoniaco y dixido de carbono. El
amonaco en solucin pasa a formar carbonato de amonio, producindose una alcalinizacin del
medio y por lo tanto un cambio de color debido al indicador de rojo de fenol.
El caldo urea y el agar urea de Christensen, son los dos medios ms comnmente utilizados en los
laboratorios clnicos para la determinacin de la actividad de la ureasa.

Reaccin positiva: rosado intenso.

C. ulcerans

Reaccin negativa: amarillo.

C.diphtheriae

Nota: Tambin se pueden utilizar discos de urea comerciales para la determinacin de la hidrlisis
enzimtica de urea.

g- Reduccin de Nitrato

Estas pruebas tienen por objeto analizar la capacidad de las diferentes especies de reducir los
nitratos a nitritos, los cuales se detectan mediante la reaccin con cido sulfanlico y
dimetilnaftilamina.

Reaccin positiva: rojo.

Reaccin negativa: incoloro.

h- Fermentacin de Carbohidratos

Para la determinacin de la fermentacin de carbohidratos se utiliza un caldo enriquecido con
suero de caballo y el agregado del indicador de Andrade. La concentracin de hidratos de carbono
es de 0.5% al 1%. Los azcares utilizados son glucosa, maltosa, sacarosa y almidn (Tabla 1).

Reaccin positiva: rosado.

Reaccin negativa: amarillo.

Tabla 1. Identificacin bioqumica de los biotipos de C. diphtheriae y su diferenciacin con
corinebacterias relacionadas

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Especies CYS PYZ Nitrato Urea Glu Mal Sac Alm
C. diphtheriae
var. gravis + - + - + + - +
var. mitis + - + - + + - -
var. intermedius + - + - + + - -
var. belfanti + - - - + + - -
C. ulcerans + - - + + + - +
C. pseudotuberculosis + - - + + + - -
C. amycolatum - + V V + V V -
C. imitans - + - - + + + -
C. pseudodiphtheriticum - V + + - - - -
C. striatum - + + - + - V -

Referencias: Glu = Glucosa; Mal = Maltosa; Sac = Sacarosa; Alm = Almidn; + = Reaccin dbil; V = Reaccin variable;
CYS = Produccin de cistinasa en el medio de Tinsdale; PYZ = Actividad de pirazinamidasa

i- Prueba de Toxigenicidad: Mtodo de Inmunoprecipitacin de Elek

La confirmacin de la patogenicidad de una cepa de C. diphtheriae requiere la demostracin de
su capacidad para producir toxina.
La prueba de inmunoprecipitacin de Elek, es el mtodo ms utilizado.
El medio base empleado para la prueba de Elek fue modificado en 1992, para mejorar la
sensibilidad, dado que se increment la claridad y visualizacin de las lneas dbiles de
precipitacin, para una correcta interpretacin del resultado.
En el agar se deben observar lneas blancas de precipitacin, que aparecen aproximadamente a
10 mm del borde de la tira de papel de filtro, formando un ngulo de 45, respecto de la lnea de
crecimiento. Estas bandas indican que la toxina producida, por el aislamiento en estudio, ha
reaccionado con la antitoxina homloga (Figura 9).
La aparicin de lneas de precipitacin, en forma de arco entre el control positivo y la cepa cuya
toxicidad se est probando, indican que sta es productora de toxina. Las cepas no toxignicas no
forman lneas de precipitacin.
Despus de 48 horas de incubacin, pueden aparecer lneas de precipitacin inespecficas,
debido a otros antgenos solubles que pueden ser producidos por cepas toxignicas y no toxignicas,
por lo cual la placa no debe incubarse ms de 48 horas.

j- Otros Mtodos empleados para Determinar la Produccin de Toxina

Los metdos que se utilizan para la deteccin de cepas toxignicas son: western blotting, dot
blotting y ELISA. Sin embargo, estos mtodos aunque sensibles, son laboriosos e insumen mucho
tiempo, por lo que no son recomendados para la rutina.

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Prueba de Deteccin de Toxina in vivo

La prueba consiste en inocular conejos o cobayos por va subcutnea con una suspensin
bacteriana. Los animales son previamente protegidos con 200 unidades de antitoxina diftrica
Debido a la demora de los resultados, la limitacin de trabajar con animales y la naturaleza
compleja de la prueba in vivo, ya no se la utiliza.

Prueba de Deteccin de Toxina in vitro

En esta prueba se observa el efecto de la toxina diftrica en cultivos de clulas Vero
(citotoxicidad).

Deteccin del Gen de la Toxina Diftrica mediante la Tcnica de PCR

Los mtodos genotpicos basados en la tcnica de PCR, ofrecen ventajas sobre las pruebas
fenotpicas habituales.
La PCR es rpida, simple, fcil de interpretar y muchos laboratorios en el mundo ya la utilizan.
Se han descrito primers especficos para amplificar diferentes regiones del gen y su utilizacin
ha resultado exitosa.

La secuencia de los primers descriptos para la amplificacin de un fragmento interno del gen
de la toxina de 248 bp es la siguiente (Pallen et al, 1994):

5 ATC CAC TTT TAG TGC GAG AAC CTT CGT CA-3
5 GAA AAC TTT TCT TGC TAC CAC GGG ACT AA-3

La tcnica utiliza como templado DNA, obtenido por calentamiento de una suspensin
bacteriana en bao de agua a 100 C. Se obtienen resultados en el trmino de 6 hs.
Sin embargo, este mtodo no demuestra si el microorganismo puede expresar la toxina diftrica
funcional. La PCR debe ser utilizada con cuidado, porque un bajo porcentaje de aislamientos de C.
diphtheriae (alrededor de un 3%) poseen el gen , pero no expresan la toxina.
Se recomienda el uso de la PCR en forma conjunta con la prueba fenotpica de Elek.

diphtheriae

Figura 6. Coloracin de Gram de Corynebacterium diphtheriae.
Bacilo Gram positivo, pleomfico, morfologa en empalizada y letras chinas

Fuente: Adaptado de www.medinfo.ufl.edu/year2/mmid/bms5300/bugs/corydiap

Figura 7. Agar Sangre Cistina Telurito.
Corynebacterium diphtheriaereduce el telurito
del medio a telurito metlico, el cual precipita
y produce el desarrollo de colonias negras

Fuente: Adaptado de www.endeavor.med.nyu.edu/courses/microbiology/courseware/infect-disease/GPB3
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Figura 8A. Agar Tinsdale.
Izquierda: Corynebacterium diphtheriae, reaccin positiva,
hay formacin de halo marrn alrededor de las colonias.
Derecha: Corynebacteriumxerosis, reaccin negativa,
no hay formacin de halo marrn alrededor de las colonias

Fuente: Adaptado de www.medschool.lsumc.edu/Micr/COURSES/DMIP/dmex17

Figura 8B. Vista en detalle de las colonias en Agar Tinsdale.
Izquierda: C. diphtheriae, produce sulfuro de hidrogeno
con formacin de halo marrn alrededor de la colonia.
Derecha: C. xerosis, no produce sulfuro de hidrogeno

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Fuente: Adaptado de www.endeavor.med.nyu.edu/courses/microbiology/courseware/infect-disease/GPB3

Figura 9. Test de Inmonoprecipitacin de Elek.
Corynebacterium diphtheriae: reaccin positiva,
obsrvese las lneas de precipitacin de identidad
entre las toxina y antitoxina diftricas

Fuente: Adaptado de www.medinfo.ufl.edu/year2/mmid/bms5300/bugs/corydiap

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BIOSEGURIDAD

a- Recomendaciones Generales para el Envo de Muestras

El laboratorio de microbiologa debe asegurar un transporte adecuado de las sustancias
infecciosas y especmenes para diagnstico. El correcto acondicionamiento de los materiales
infecciosos enviados generan menores riesgos de exposicin accidental tanto para el personal del
laboratorio como para todo el que entra en contacto con el envo. Por otra parte, se asegura que las
muestras lleguen en condiciones adecuadas lo que redundar en la calidad del estudio que se realice.
El acondicionamiento seguro de muestras para el diagnstico bacteriolgico es responsabilidad
de todos los involucrados en el proceso: el profesional, el tcnico de laboratorio y el personal de
correos. El embalaje de materiales infecciosos debe evitar la fuga de los mismos por rotura o mal
empaque del envo.
Los aislamientos presuntivos de C. diphtheriae, as como las muestras clnicas deben ser
enviados en medio de transporte y acondicionadas en un sistema triple bsico de embalaje de
acuerdo a las recomendaciones de la Organizacin Mundial de la Salud, 1999 (Guidelines for the
Safe Transport of Infectious Substances and Diagnosctic Specimens, WHO, Geneva, 1999).

Recipiente primario, a prueba de agua, bien cerrado, en el cual se coloca la muestra.

Recipiente secundario, a prueba de agua, resistente.

Recipiente terciario o envoltorio externo, es para proteger el envase secundario de
influencias externas, como dao fsico o agua.

Para armar un sistema de envo se pueden utilizar los envases de toma de muestra, de reactivos
de laboratorio o de alimentos que sean de material resistente.
La parte externa del recipiente primario debe ser cuidadosamente examinada y debe limpiarse
en caso que haya sangre, materia fecal u otros contaminantes, antes de embalarlo para su envo.
El espacio entre los recipientes primario y secundario debe llenarse con material absorbente
suficiente, para absorber el contenido del recipiente primario, en caso que ocurra una prdida
durante el transporte.
Los formularios con datos del especimen, notas y otro tipo de informacin que identifiquen o
describan la muestra y tambin identifiquen al remitente y al destinatario, deben ser pegados con
cinta adhesiva en el exterior del recipiente secundario.
Es aconsejable una buena coordinacin entre quien enva y quien recibe de manera que la
muestra llegue a tiempo y en buenas condiciones; para esto es conveniente realizar arreglos con el
destinatario, previos al envo, para asegurarse que las muestras sean aceptadas y conservadas
convenientemente.
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Carlos G. Malbrn
31
Finalmente se debe enfatizar la necesidad de una correcta rotulacin del envo con la mayor
cantidad de datos posibles.

b- Recomendaciones especficas para el Manejo de Muestras Clnicas y Aislamientos
de C. diphtheriae

Han sido publicado informes de infecciones por C. diphtheriae adquiridas por el personal de
laboratorio, que contrajo la enfermedad accidentalmente por manipuleo incorrecto de materiales
clnicos y/o aislamientos de dicho microorganismo.
El accidente laboral puede ocurrir por: inhalacin de aerosoles, inoculacin accidental o
ingestin del microorganismo, a travs de la exposicin con exudados, secreciones nasofarngeas,
heridas, sangre, piel del paciente y/o cultivos del patgeno.
Las prcticas de laboratorio para la manipulacin de materiales clnicos y cultivos de
Corynebacterium diphtheriae son las recomendadas para un Nivel de Bioseguridad 2 y deben ser
realizadas en cabina de seguridad biolgica Clase 1.
Debe recordarse que los controles positivos utilizados para la prueba de Elek (NCTC 10648,
control positivo fuerte) y (NCTC 3984, control positivo dbil) son toxignicas y pueden causar
infeccin. Las normas internacionales recomiendan:

Todo el personal de laboratorio que, por su trabajo,
Pueda estar expuesto a la Difteria deber vacunarse.
Debe tener un mnimo de proteccin de 0.01 UI/ml

Importante: El personal de laboratorio que manipula aislamientos toxignicos con
regularidad, debe tener un nivel mayor de 0.1 UI/ml.

A pesar que el riesgo de contraer difteria en el laboratorio es bajo, el refuerzo con la vacuna
difteria-ttanos dTa cada 10 aos, reduce el peligro de exposicin del personal de laboratorio.

c- Envo de los Aislamientos Sospechosos de Corynebacterium diphtheriae

Cuando se aisle una cepa con caractersticas morfolgicas y/o bioqumicas compatibles con
Corynebacterium diphtheriae, remitirlas al Laboratorio de Referencia del Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn a fin de completar la caracterizacin
bioqumica y realizar la prueba de toxigenicidad del aislamiento.

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Remitir el cultivo en medio de Amies con carbn activado y un extendido del mismo,
coloreado con algunas de las dos tcnicas indicadas. Adjuntar Ficha con datos completos
del paciente, resea de la historia clnica, determinaciones de laboratorio realizadas y,
datos de la institucin (denominacin, direccin, N de TE/FAX) y del profesional
(nombre, apellido y correo electrnico) al cual debe remitirse el resultado.

Datos del Laboratorio de Referencia para el envo de la Encomienda:

Servicio Bacteriologa Clnica
Departamento Bacteriologa
INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn
Av. Velez Sarsfield 563
CP 1282 AFF C.A.B.A.

Datos del Laboratorio de Referencia para comunicarse por telfono, FAX o correo
electrnico:

TEL/FAX: 54(11)4301 - 9346
e-mail: mregueira@anlis.gov.ar

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ANEXO

Preparacin de Colorantes, Medios de Transporte y Cultivo

1- Coloracin de Gram

Colorantes habitualmente utilizados en el laboratorio de bacteriologa.

Advertencia: Se recomienda decolorar con alcohol. La decoloracin con alcohol acetona
puede desvirtuar la observacin microscpica, ya que son bacilos gram positivos lbiles.

2- Coloracin de Azul de Metileno Leffler

Reactivo
Azul de Metileno 1 g
Etanol 96% 10 ml

Mezclar y mantener durante 7 das a 37 C.
Preparar una solucin acuosa al 10% a partir de la solucin anterior y agregar 10 ml de
una solucin acuosa 0.1% de KOH.
Incubar a 37 C durante una semana y filtrar.

Coloracin

Los extendidos son fijados por calor y coloreados durante 10 min con la solucin.
Lavar con agua corriente.

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3- Medio de Transporte Amies

Medio de Transporte Amies
Cloruro de Sodio 3 g
Cloruro de Potasio 0.2 g
Fosfato Disdico 1.15 g
Tioglicolato de Sodio 1 g
Cloruro de Calcio 0.1 g
Cloruro de Magnesio 0.1 g
Agar 4 g
Agua Destilada o
Desionizada
1000 ml
pH final 7.2 0.2

Preparacin del medio a partir de los componentes

Disolver el agar en agua, calentando hasta disolucin. Agregar los dems componentes
mientras la solucin se encuentra caliente, a una temperatura inferior a la de ebullicin.
Agitar hasta disolucin completa y agregar 10 g de carbn activado.
Agitar suavemente y autoclavar a 121 C durante 15 minutos.
Una vez retirado del autoclave, fraccionar en caliente de a 7ml, en tubos plsticos estriles
con tapa a rosca.

Conservacin

En tubo cerrado a 15-20 C en la oscuridad, hasta 6 meses.

Medios de cultivo y transporte comerciales

Medio deshidratado Marca Difco cat. 0996-17-7.
Hisopos comerciales con medio de transporte Amies y carbn activado.
1. Marca COPAN cat. 114 C.
2. Marca Difco cat. 9345-26-5.
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4- Medio Leffler ML

Medio Leffler ML
Caldo Peptonado 100 ml
Suero Normal Equino
estril
300 ml
Glucosa 2 g

Preparacin

Adicionar 2 g de glucosa a 100ml de caldo nutritivo y calentar hasta disolucin.
Esterilizar a 121 C durante 15 minutos.
Enfriar a 56 C.
Aspticamente, agregar 300ml de suero equino estril. Mezclar.
Fraccionar de a 6ml en tubo de vidrio estril de 16x150mm.
Utilizar coagulador o de lo contrario realizar la coagulacin a bao mara.
Colocar los tubos en posicin inclinada y con la tapa semicerrada sobre dos soportes
metlicos colocados sobre un recipiente con agua en ebullicin, cuidando que los tubos
estn en contacto con el vapor durante unos minutos. El medio debe tornarse color blanco
amarillento.
Retirar del bao una vez alcanzado este color, ajustar la tapa y dejar enfriar sobre la
mesada en forma inclinada hasta que termine el proceso de coagulacin.

Conservacin

Hasta 6 meses a 4 C.

5- Medio Agar Sangre Cistina Telurito ASCT

Medio Agar Sangre Cistina Telurito
Agar Infusin Corazn 2% 100 ml
Sangre Equina estril 5 ml
Solucin de Telurito de Potasio 0.3% 15 ml
L-cistina polvo estril 5 mg

Preparacin

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Mezclar el agar infusin corazn a 45-50 C, el telurito de potasio, la sangre equina estril
y luego agregar la L-cistina. Ajustar a pH 7.2-7.6.
Plaquear.

Conservacin

Hasta 1 mes a 4 C.

Pruebas de Caracterizacin y Diferenciacin

6- Prueba de la Pirazinamidasa

Solucin de Pirazinamida

Disolver 2mg/ml de pirazinamida en agua destilada.
Esterilizar por filtracin con una membrana filtrante de 0.45 m.
Fraccionar de a 1 ml en tubo plstico estril.

Conservacin

Conservar a -20 C.

Nota: Evitar el contacto del polvo con la piel. No inhalar el polvo.

Reactivo Revelador

Sulfato ferroso amnico al 20% p/v en agua destilada.

Conservacin

Conservar a - 20 C.

Procedimiento

Fraccionar 0.25 ml de la solucin de pirazinamida en tres tubos estriles.
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Preparar una suspensin turbia equivalente a un McFarland 8 de la cepa en estudio en la
solucin de pirazinamida. De la misma manera, preparar en otros dos tubos suspensiones
de una cepa control positivo y de una cepa control negativo.
Incubar a 37 C durante 4 horas o durante toda la noche.
Agregar 1 gota del reactivo revelador a cada suspensin.

Interpretacin

La reaccin positiva se evidencia por la aparicin de un color rojo anaranjado.

7- Medio Agar Tinsdale

Medio Agar Tinsdale
Proteosa N 3 20 g
Cloruro de Sodio 5 g
Agar deshidratado 14 g
Agua destilada 1000 ml

Preparacin

Disolver los componentes y ajustar el pH a 7.4
Autoclavar a 121 C durante 15 min.
Enfriar a 55 C y agregar aspticamente las siguientes soluciones estriles

Medio Agar Tinsdale
NaOH 0.1N 60.0 ml
Solucin de L-Cistina 0.4% * 60.0 ml
Sol. aq. Telurito de Potasio 1% 30.0 ml
Sol. de Tiosulfato de Sodio 17.0 ml
Suero Bovino estril 100 a 150 ml

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* Sol. de L-Cistina: 0.24 g de L-Cistina disuelta en 60ml de HCl 0.1 N a 60-70 C.
Sol. de Tiosulfato: 2.5 g de Tiosulfato de Sodio disueltos en 100ml de agua destilada a 60 C.

Verter el medio en placa de petri y conservar a 4 C por no ms de 4 das.
Controlar cada lote con la cepa de referencia y observar la formacin de colonias negras
con halo difuso.

8- Prueba de Ureasa

a- Urea de Christensen

Urea de Christensen
Agar Base Urea Difco 2.9 g
Agua Destilada 10 ml

Preparacin
Disolver el medio base en agua destilada. No hervir o autoclavar.
Esterilizar por filtracin.
Suspender 1,5 g de Bacto Agar en 90 ml de agua destilada y hervir hasta disolucin total.
Esterilizar a 121 C durante 15 min.
Enfriar a 50-55 C.
Agregar en forma estril el Agar Base Urea. Mezclar bien. No calentar el medio completo.
Fraccionar 3ml por tubo y dejar enfriar en pico de flauta.

Procedimiento
Sembrar en la superficie del pico.
Incubar a 37 C durante 18 a 24 horas.

Lectura: La aparicin de un color rosado indica actividad de ureasa.

b- Caldo Urea

Caldo Urea
Fosfato Monopotsico 0.1 g
Fosfato Dipotsico 0.1 g
Cloruro de Sodio 0.5 g
Rojo Fenol 1/500 0.5 ml
diphtheriae

Carlos G. Malbrn
39

Preparacin
Preparar la solucin de rojo de fenol 1/500. (0.2 g de rojo de fenol en 92 ml de agua
destilada y 8ml de NaOH).
Disolver el caldo urea y ajustar a pH 7 con NaOH 5 N.
Adicionar 10.4 ml de solucin de urea (al 20% en solucin acuosa) esterilizada por
filtracin.
Fraccionar en tubos 13/100 de a 2ml.

Procedimiento
Sembrar un inculo denso de bacterias a partir de un cultivo en medio slido.
Incubar a 37 C. Leer los resultados de la prueba a las 4 horas.

Lectura: La aparicin de color rojo indica actividad de ureasa.

9- Reduccin de Nitrato

Medio Caldo Nitrato
Caldo Infusin Corazn 25 g
Nitrato de Potasio 2 g

Preparacin

Ajustar a pH 7.0.
Distribuir 4 ml en tubo 16/150.
Esterilizar por autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Reactivo Revelador
Reactivo I
Acido Sulfanlico 0.8 g
Acido Actico Glacial 30 ml
H
2
O 100 ml
Reactivo II
Naftilamina 0.5 g
Acido Actico Glacial 30 ml
H
2
O 100 ml

Procedimiento
diphtheriae

Carlos G. Malbrn
40

Sembrar el caldo con la cepa a probar e incubar a 37 C durante 24-48hs.

Revelado de la Reaccin

Aadir 0.5 ml del reactivo I y 0.5 ml del reactivo II.

Interpretacin

La reaccin positiva est determinada por la presencia de NO
2
, producto de la reduccin
de nitrato, que produce una reaccin color rojo vinoso, al agregar el reactivo revelador.
Interpretacin: NO
3

NO
2
positivo.
Si la reaccin es negativa, aadir zinc en polvo y agitar. La formacin de un color rojo
significa que el zinc reduce el nitrato a nitrito y se interpreta como reduccin de nitrato,
NO
3
NO
2
negativo.
10- Fermentacin de Hidratos de Carbono
Medio Base

Medio Base
Peptona 0.5 g
PO
4
HNa
2
0.1 g
Suero Normal Equino 17.8 ml
Indicador de Andrade 0.78 ml
Agua Destilada c.s.p 100 ml

Preparacin
Disolver la peptona y el fosfato disdico en agua destilada. Hervir hasta disolucin. Filtrar
y enfriar.
Ajustar a pH 7.4.
Autoclavar a 121C durante 15 min. Enfriar.
Agregar el suero y mezclar bien, calentando a 50 C durante 20 min.
Agregar el indicador y ajustar a pH 7.7.
Agregar 1ml de la solucin del azcar al 10%, esterilizado por filtracin, por cada 9ml de
medio base previamente esterilizado. La concentracin final de los azcares es al 1% para
glucosa, maltosa y sacarosa. La concentracin final del almidn es 0.5%.
Fraccionar 4.5 ml por tubo.

Preparacin de la solucin de Almidn
Preparar una solucin acuosa de almidn soluble, agregando 0.15 g de almidn en 5 ml de
agua destilada estril y agitando continuamente.
Hervir durante 5 minutos aproximadamente. Enfriar. Agitar a intervalos.
Adicionar 0.15 ml de esta solucin por cada 3ml de medio base estril. Fraccionar en
volmenes de 4.5 ml.

diphtheriae

Carlos G. Malbrn
41
Nota: Se debe utilizar un tubo control con caldo base sin el agregado de hidratos de carbono.

Interpretacin: Reaccin positiva: color rosado (produccin de cido).
Reaccin negativa: color amarillo (alcalinizacin).

Indicador de Andrade
Fucsina cida 2 g
H
2
O destilada 1000 ml
NaOH 1N 160 ml

Preparacin
Disolver la fucsina en agua destilada.
Agregar el hidrxido de sodio. Si la fucsina no est suficientemente decolorada despus de
dejar en reposo toda una noche, agregar 1 a 2 ml de hidrxido de sodio ms. La fucsina
debe tener un color ligeramente naranja o ms oscura.

Nota: El indicador de Andrade debe envejecer por 6 meses antes de ser utilizado.

11- Prueba de Toxigenicidad: Mtodo de Inmunoprecipitacin de Elek

Medio Base

A
Proteosa peptona N 2 20 g
OHNa (40% W/V 10 N) 3.25 ml
Acido Lctico 0.7 ml
Maltosa 3 g

Preparacin
Disolver la peptona en agua.
Adicionar NaOH (40% p/v = solucin 10 N)
Mezclar y calentar a ebullicin en bao. Enfriar.
Filtrar para eliminar el precipitado de los fosfatos.
Agregar solucin de cido lctico 90%.
Mezclar y agregar maltosa.
Disolver y ajustar con pHmetro. a pH 7.8 con HCl 1N o HCl 5N.

B
ClNa 5 g
Lab M agar 10 g
diphtheriae

Carlos G. Malbrn
42

Preparacin

Mezclar. Dejar hidratar y luego colocar a bao mara hasta disolver. Enfriar a 50 C y
ajustar a pH 7.8 con NaOH 1N.
Calentar A a 50 C y luego mezclar A y B.
Fraccionar en volmenes de 15 ml en tubos y autoclavar a 116 C por 10 minutos.

Preparacin de las Tiras de Papel de Filtro con Antitoxina

Las tiras pueden ser de papel Whatman N 1 o N 3 y el tamao es de 1.5 cm de ancho x 8
cm. de largo. Se colocan en un tubo de boca ancha y se esterilizan por calor, previo a ser
embebidas con la antitoxina.
Diluir la antitoxina a 500 UI/ml con agua destilada estril, de acuerdo al ttulo inicial que
tenga el suero. La antitoxina diluida es estable durante 6 meses conservada a 4 C.
Embeber la tira estril con 0.3 ml de la antitoxina diluida.
Dejar escurrir el exceso.

Conservacin

Las tiras embebidas en antitoxina y secas pueden conservarse en un tubo estril a 4 C durante 6
meses.

Realizacin de la Prueba de Elek

Fundir 15 ml de agar base Elek y transferir a un bao mara a 50 C.
Adicionar al agar base, 3 ml de suero fetal bovino suero normal equino.
Mezclar y verter en la placa. Dejar solidificar y secar en estufa a 37 C por 20-30 minutos.
La placa puede conservarse solamente 24 hs a 4 C.
La siembra debe hacerse en forma de puntos o lneas (6-7mm de dimetro). La distancia
entre cada punto o lnea debe ser 7-8 mm. La distancia entre el borde de la tira y el lugar
de siembra es de 5 mm.
En forma estril, colocar la tira con la antitoxina sobre el agar, en el centro de la placa.
Incubar a 37 C durante 24-48 hs.

Lectura e Interpretacin de la Prueba

Utilizar una fuente de luz y una lupa para examinar cuidadosamente la placa, despus de
18 hs de incubacin. Observar las lneas de precipitacin de identidad entre la cepa en
estudio y las cepas control positivo fuerte y positivo dbil. El control negativo no debe
mostrar lneas de precipitacin.
Reincubar por 24 hs ms y leer nuevamente. No incubar ms de 48 hs porque pueden
observarse lneas de precipitacin inespecficas.
diphtheriae

Carlos G. Malbrn
43

Cepas Patrn
Control Microorganismo
Positivo C. diphtheriae 510 NCTC 10648
Negativo C. diphtheriae 511 NCTC 10356
Positivo Dbil C. diphtheriae 512 NCTC 3984

12- Conservacin de Aislamientos a Corto y Largo plazo

Corto plazo

Cultivar los microorganismos en agar nutritivo, agar Mueller Hinton, Medio Leffler a 35-
37 C durante 18-24 hs. Conservar los cultivos a 4 C.
Subcultivar una vez por mes en placas o estras de medio de cultivo fresco.

Largo plazo

Suspender un cultivo fresco en caldo Brucela con 15% de glicerol.
Fraccionar 1 ml de la suspensin en criotubos de 1.5 ml de volumen. Conservar a -70 C.

Coryne Diphtheriae 1

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