INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DE TIERRA

BLANCA
INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
TEMA: PRCTICA 10 y 11
Determinacin de azcares totales por el mtodo de Dubois
(Fenol/Sulfrico)

ALUMNOS(A):
Gonzlez Vera Ftima
Krauss Benites Jessica
Lpez Silva Amrica
Martnez Rodrguez Karina Yamilet

DOCENTE:
Ing. Laura Ins Elvira Torales

SEMESTRE Y GRUPO:
401-A



Tierra Blanca, Veracruz a 04 de junio del 2014.
INTRODUCCIN
En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes
vegetales. Son carbohidratos los diferentes azcares, almidones, celulosa,
hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas.
Los azcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en
el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en
forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacridos que
conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho.
Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura,
valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de
calidad los carbohidratos desempean un papel relevante, por ejemplo, el sabor
est dado bsicamente por un balance entre azcares y cidos orgnicos. El
sabor caracterstico de y diferente de las frutas se debe a la gran variacin en
composicin y concentracin de los azcares; el color atractivo se debe
principalmente a los glucsidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza est
determinada por los polisacridos estructurales.
Es importante sealar que las proporciones de los diversos carbohidratos
existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia
de la actividad metablica, ya que durante la maduracin se producen cambios
intensos en donde los azcares son los sustratos preferidos para la biosntesis y
suministro de energa pues son oxidados (va gluclisis) hasta cido pirvico, el
cual a su vez, por descarboxilacin oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se
metaboliza, va ciclo de Krebs, dando lugar a la formacin de CO
2
, H
2
O y
ENERGA la cual queda disponible para la biosntesis de otros componentes
(otros azcares, cidos orgnicos, cido ascrbico, protenas, nucletidos
azucarados, glucsidos, etc.). Durante todo este proceso, el contenido de
azcares aumenta casi invariablemente bsicamente por hidrlisis que
experimentan los polisacridos, aunque algunos azcares sean utilizados como
sustratos para la actividad respiratoria.
Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios mtodos
para su determinacin: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-
Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio:
Todos los azcares con un grupo aldehdo libre o un grupo cetnico se clasifican
como azcares reductores y se transforman fcilmente en enedioles (reductonas)
al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y
se oxidan fcilmente en presencia de oxgeno u otros agentes oxidantes, por lo
tanto, los azcares en solucin alcalina rpidamente reducen iones oxidantes
como Ag
+
, Hg
+
, Cu
2+
y Fe(CN)
6
3-
y los azcares se oxidan formando mezclas
complejas de cidos. Esta accin reductora es la que se utiliza tanto en las
determinaciones cualitativas como cuantitativas.











FUNDAMENTO

Este mtodo propuesto por Dubois en 1956 se fundamenta en que los
carbohidratos son particularmente sensibles a cidos fuertes y altas temperaturas.
Bajo estas condiciones una serie de reaccione complejas toman lugar empezando
con una deshidratacin simple, si se contina el calentamiento y la catlisis cida
se producen varios derivados del furano (furfural para pentosas e hidroximetil-
furfural para hexosas) que condensan consigo mismos y con otros subproductos
para producir compuestos coloridos producto de la condensacin de compuestos
fenlicos y con heterociclos con el nitrgeno como heterotomo. La condensacin
ms comn es con fenol. Por medio de este mtodo, se determinan azcares
simples, oligosacridos, polisacridos y sus derivados; que presentarn un
complejo color amarillo-naranja muy estable luego de que reaccionan con el fenol
en presencia de cido sulfrico concentrado (Figura 1).



Figura 1. Estructura del complejo generado a partir de la reaccin de
fructosa con fenol en medio cido


Este mtodo es fcil, eficaz y rpido. Todos los azcares como oligosacridos y
polisacridos pueden ser determinados, recordando que stos bajo hidrlisis cida
producen monosacridos. La forma en que procede la reaccin no es
estequiomtrica y depende de la estructura del azcar, por lo tanto se realiza una
curva patrn diseada a partir del o los carbohidratos mayoritarios.





MATERIALES Y EQUIPO.
Tubos de ensayo para contener 15 mL
Pipetas volumtricas o micropipetas.
Pipetas graduadas
Agitador
Gradilla
Espectrofotmetro UV-Visible

REACTIVOS.
Solucin de sulfato de Zinc 10%
Solucin de NaOH 0.5 N
Solucin de fenol 5%
cido Sulfrico concentrado
Solucin patrn de glucosa, sacarosa o fructosa 100 mg/L

MUESTRAS
- Bebida carbonatada (Coca-cola)
- Jugo de frutas (no nctar)
- Bebida energtica (Powerade)
PROCEDIMIENTO

Determinacin de Azucares Totales Solucin patrn

1. Realizar una curva estndar de 10 puntos con la finalidad de obtener un
parmetro de referencia. Para esto se recomienda preparar una solucin
concentrada de 100 mg/L del carbohidrato de su preferencia y a partir de
esta obtener los otros 9 puntos realizando diluciones progresivas (Ver la
tabla siguiente). Emplear micropipetas para mayor exactitud. Realizar el
mtodo de determinacin para cada tubo. Para este ejercicio realizar las
diluciones para sacarosa y glucosa o fructosa.

No. de
tubo
Concentracin
(mg/L)
mL de la sol.
de 100 mg/L
mL de
agua
1 10 1
9
2 20 2
8
3 30 3
7
4 40 4
6
5 50 5
5














2. En tubos de ensayo perfectamente etiquetados, colocar 1 mL de la solucin
o suspensin acuosa de la curva.
3. Para cada tubo adicionar 0.6 mL de una solucin acuosa de fenol al 5%.
Mezclando perfectamente.
4. Adicionar cuidadosamente 3.6 mL de cido sulfrico concentrado,
homogeneizar.
5. Dejar enfriar la mezcla a temperatura ambiente (aproximadamente 30 min.).
6. Determinar la intensidad del color naranja obtenido en un espectrofotmetro
a 490 nm, frente a un blanco preparado de la misma manera utilizando
agua desmineralizada.
7. Anotar la lectura de Absorbencia para cada tubo de la solucin patrn y
establecer la ecuacin de regresin lineal para la curva patrn.

Tubo Concentracin
(mg/L)
Absorbencia
1 10
2 20
3 30
4 40
5 50
6 60
7 70
8 80
6 60 6
4
7 70 7
3
8 80 8
2
9 90 9
1
10 100 10
0
9 90
10 100

8. Se traza un grfico con las seales frente a la concentracin de analito y se
calcula la recta que "mejor" se ajusta a los datos mediante un ajuste por
mnimos cuadrados. De esta forma se obtiene la pendiente (b) y la
ordenada (a) en el origen que definen la recta.
9. En la actualidad las calculadoras cientficas realizan el ajuste por mnimos
cuadrados y, dicho ajuste, tambin puede realizarse en el ordenador
mediante la hoja de clculo EXCEL.


CON MUESTRAS: COCACOLA, JUGO Y POWERADE

Desproteinizacin de las muestras (en caso de requerirse para muestras con
alto contenido de protenas)

1. Pesar 2 g de muestra homogenizada y suspender en 20 mL agua
desmineralizada. Homogenizar.
2. Filtrar y tomar 10 mL del filtrado, a este adicionar 1 mL de una solucin de
Sulfato de Zinc al 10% y 1 mL de NaOH 0.5 N.
3. Mantener en reposo durante 15 minutos y luego centrifugar a 200 rpm
durante 15 minutos. Utilizar el sobrenadante para la cuantificacin de
azucares totales.

Determinacin de Azucares Totales.

10. Preparar una solucin o suspensin de la muestra en agua dependiendo de
la concentracin probable de carbohidratos totales, procurando que los
carbohidratos se encuentren en el intervalo de sensibilidad del mtodo (10-
y = 0.1044x + 0.0352
R = 0.9924
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 2 4 6 8 10 12
A
b
s
o
r
b
e
n
c
i
a

Concentracin (mg/L)
100 mg/L) y realizando diluciones seriadas. Por ejemplo, para una solucin
de 20 g/L de azcares, habr que realizar una dilucin 1:50 y despus una
dilucin 1:20, con esto tendremos una dilucin final 1:1000 y una
concentracin de 20 mg/L, la cual se encontrar dentro del rango sensible.
Para este caso se realizar la determinacin de azcares totales a una
bebida carbonatada (Coca-Cola o Pepsi), un jugo de frutas (Jugo, no
nctar) y una bebida energtica (Gatorade o Powerade)

11. En tubos de ensayo perfectamente etiquetados, colocar 1 mL de la solucin
o suspensin acuosa de la muestra.

12. Para cada tubo adicionar 0.6 mL de una solucin acuosa de fenol al 5%.
Mezclando perfectamente.

13. Adicionar cuidadosamente 3.6 mL de cido sulfrico concentrado,
homogeneizar.

14. Dejar enfriar la mezcla a temperatura ambiente (aproximadamente 30 min.).

15. Determinar la intensidad del color naranja obtenido en un espectrofotmetro
a 490 nm, frente a un blanco preparado de la misma manera utilizando
agua desmineralizada en lugar de muestra.

16. Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a partir de la
ecuacin resultante de la curva patrn preparada con el carbohidrato de
inters en el intervalo del mtodo, considerar la dilucin efectuada. Para
muestras con mezcla de carbohidratos emplear el carbohidrato mayoritario.

Al despejar

Con dicha ecuacin se determina la concentracin de la muestra diluida
conociendo la Absorbencia obtenida para cada muestra.

Por ltimo se realiza un ajuste con la dilucin empleada y se obtiene la
concentracin real.

C
A
real = (C
A
experimental) (dilucin)


PASOS Y RESULTADOS


1. Se realizo una curva estndar de 10 puntos con la finalidad de
obtener un parmetro de referencia. Se preparo una solucin
concentrada de 100 mg/L del carbohidrato de su preferencia y a
partir de esta obtener los otros 9 puntos realizando diluciones
progresivas como se indico en la tabla.

2. En tubos de ensayo perfectamente etiquetados, se coloco 1 mL
de la solucin o suspensin acuosa de la curva.

3. Para cada tubo adicionamos 0.6 mL de una solucin acuosa de
fenol al 5%. Mezclando perfectamente

4. Por lo siguiente se adiciono 3.6 mL de cido sulfrico
concentrado, homogeneizar.



5. Se dejo enfriar la mezcla aproximadamente 30 minutos


6. Se determino la intensidad del color naranja obtenido en un
espectrofotmetro a 490 nm, frente a un blanco preparado de la
misma manera utilizando agua desmineralizada.

7. Finalmente se anotaron las lecturas de Absorbencia para cada
tubo de la solucin patrn y se realizo la ecuacin de regresin
lineal para la curva patrn.
Tubo Concentracin
Sacarosa(mg/L)
Absorbencia
1 10
0.582
2 20
0.611
3 30
0.73
4 40
0.752
5 50
0.775
6 60
0.997
7 70
1.375
8 80
1.668
9 90
1.712
10 100
2.498

Tubo Concentracin
Glucosa(mg/L)
Absorbencia
1 10
0.217
2 20
0.46
3 30
0.669
4 40
0.885
5 50
1.108
6 60
1.22
7 70
1.323
8 80
1.445
9 90
1.448
10 100
1.537


y = 0.0156x + 0.1553
R = 0.9491
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 20 40 60 80 100 120
Series1
Linear (Series1)
SACAROSA
blanco
0
10 0.582
20 0.611
30 0.73
40 0.752
50 0.775
60 0.997
70 1.375
80 1.668
90 1.712
100 2.498


GLUCOSA
blanco 0
10 0.217
20 0.46
30 0.669
40 0.885
50 1.108
60 1.22
70 1.323
80 1.445
90 1.448
100 1.537

y = 0.0168x + 0.166
R = 0.9119
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
0 20 40 60 80 100
Series1
Linear (Series1)


Se realizo una dilucin de las muestras utilizadas de 1:2000 ml
Se prepararo una solucin o suspensin de la muestra en agua
dependiendo de la concentracin probable de carbohidratos totales,
procurando que los carbohidratos se encuentren en el intervalo de
sensibilidad del mtodo (10-100 mg/L) y realizando diluciones
seriadas.
Se coloco 1 mL de la solucin o suspensin acuosa de la muestra.
Para cada tubo se adiciono 0.6 mL de una solucin acuosa de fenol al
5%.





Se adiciono cuidadosamente 3.6 mL
de cido sulfrico concentrado, y se
homogeneizo



Se dejo enfriar durante 30 minutos

Determinar la intensidad del color
naranja obtenido en un
espectrofotmetro a 490 nm, frente a
un blanco preparado de la misma
manera utilizando agua
desmineralizada en lugar de muestra.



Finalmente se Calculo la cantidad de
carbohidratos presentes y se obtuvo
lo siguiente
muestra coca-cola
blanco 0
M1 1.088
M2 1.075
M3 1.051

1.07133333
muestra power
blanco 0
M1 1.269
M2 1.158
M3 1.347

1.258
muestra jugo
blanco 0
M1 1.276
M2 1.3
M3 1.491

1.35566667



Azucares Sacarosa (g/L) Glucosa (g/L)
Ecuacin lineal y= 0.016x+0.166 y= 0.015x+0.155
Coca-Cola 57.375 0.17126
power 68.25 0.17387
jugo 74.3125 0.175335

CALCULOS

Al despejar

NOTA: En la absorbencia de sacarosa no se toma en cuenta el punto arriba
de 2
NOTA (Los resultados nos dan en mg/L, estos se multiplican por 1000 que
es la dilucin y nos quedara 57375 mg/L = 57.375 g/L.
Si la dilucin es 2000, se multiplican por el 2000
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
blanco M1 M2 M3
AZUCARES REDUCTORES
coca-cola
power
jugo

Al despejar

SACAROSA (G/L) disoluciones
MUESTRA y= 0.016x+0.166 1 a 1000 1 a 2000
COCA-COLA 57.375 57375 114750
POWER 68.25 68250 136500
JUGO 74.3125 74312.5 148625
GLUCOSA (G/L) disoluciones
MUESTRA y= 0.015x+0.155 1 a 1000 1 a 2000
COCA-COLA 0.17126 171.26 342.52
POWER 0.17387 173.87 347.74
JUGO 0.175335 175.335 350.67















CONCLUSIN

Con este mtodo se pudo determinar la absorbancia de la solucin de sacarosa y
de glucosa por medio del espectrofotmetro que se ocup resaltando la intensidad
del color naranja de las soluciones y por medio de este obteniendo la
concentracin real de cada muestra y determinando que solucin tenia mayor
contenido de carbohidratos resultando que el producto ms elevado en
carbohidratos fue la sacarosa, lo mismo se realiz con las muestras de jugo
refresco y bebida energtica con la diferencia que en esta prueba la que resulto
con mayor contenido de carbohidratos fue el jugo seguido de la bebida energtica
y terminando con el refresco concluyendo que la bebida ms rica en azucares es
el jugo.



















BIBLIOGRAFIA

http://www.buenastareas.com/ensayos/Determinacion-De-Azucares-
Totales-y-Reductores/2292366.html
http://www.redalyc.org/pdf/2231/223120664006.pdf