En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una
columna que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y estacionaria A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos poli funcionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin. La cromatografa lquida de alto rendimiento se utiliza en las ramas de la bioqumica para separar e identificar compuestos en base a su polaridad. El dispositivo emplea una bomba que acta para crear una presin lo suficientemente alta como para forzar al compuesto a separarse en partculas polarizadas a travs del dispositivo. Ventajas: El HPLC es un proceso automtico que toma slo unos pocos minutos para producir resultados. Esta es una marcada diferencia en la cromatografa lquida que utiliza la gravedad en lugar de una bomba de alta velocidad para forzar compuestos a travs de un tubo densamente empaquetado. Los resultados obtenidos son de una alta resolucin y son fciles de leer, y las pruebas se reproducen con facilidad a travs del proceso automatizado Desventajas: Es difcil de detectar coelucin (dos compuestos que escapan de la tubera a la vez) con HPLC, lo que puede dar a la categorizacin de compuesto incorrecto. Existe un alto costo para el equipo necesario para llevar a cabo HPLC. Su funcionamiento puede ser complejo y requiere un tcnico entrenado para operar. Debido a la velocidad del proceso, el equipo tiene una baja sensibilidad a algunos compuestos.
FUNDAMENTO
La cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) es un proceso analtico que utiliza un instrumento especialmente diseado para separar, cuantificar y analizar los componentes de una mezcla qumica. La muestra de inters se hace pasar mediante un flujo de disolvente hasta una columna rellena del material especial para llevar a cabo la separacin de los componentes, posteriormente dichos componentes pasan a un sistema de deteccin acoplado con un sistema de grabacin de datos. Los componentes bsicos del sistema HPLC incluyen: contenedor de disolventes, inyector automtico, bomba cuaternaria, columna analtica, detector/es y el registrador de datos. Los detectores de los que se dispone son 2: (a) detector ultravioleta-visible de longitud de onda variable y (b) detector LSD (evaporative light-scattering detector). Posee un ordenador donde se incluye el programa Chemstation para controlar tanto los instrumentos como los datos obtenidos.
Campos de Aplicacin de HPLC
Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos. Se realizan anlisis cualitativos y cuantitativos de polifenoles y carotenos en una amplia variedad de matrices alimentarias y biolgicas (ctricos, uvas, vinos, orina, plasma, entre otros).
OBJETIVOS Aprender y dar a conocer el proceso de una cromatografa liquida de alta resolucin y sus diferentes tipos Conocer la funcional del equipo y las diferentes partes que se compone.
INSTRUMENTACIN Bomba
Las bombas para HPLC deben cumplir ciertos requisitos fundamentales: - Deben producir presiones estables hasta 6000psi. - Deben mantener el flujo libre de pulsaciones - Deben generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min) - Deben permitir un control y reproducibilidad del flujo de solvente - Sus componentes deben ser resistentes a la corrosin
Detector
La eficiencia de un detector cromatogrfico depende de la relacin entre la cantidad fsica medida y la composicin del efluente, as como tambin de las caractersticas de las seal de transferida. Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en: Detectores basados en una propiedad de la fase mvil . Ejemplo: Detector de Indice de Refraccin Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta
Integrador
Fase mvil Alta pureza (calidad HPLC). Inactividad frente a la fase estacionaria. Baja viscosidad. Compatibles con la muestra. Facilitar la recuperacin de la muestra. Compatibilidad con el sistema de deteccin. Segn su composicin vare o no con el tiempo: Elucin isocrtica y Elucin en gradiente
Inyector Inyeccin Se emplean vlvulas inyectoras de volumen (loop) constante Pueden ser manuales o automticas Para variar el volumen de inyeccin se debe cambiar el loop correspondiente Se debe evitar la entrada de burbujas en el sistema de Inyeccin
PROCEDIMIENTO PARA UN ANALISIS CROMATOGRAFICO HPLC Parmetros a seguir: Naturaleza de la fase estacionaria Interaccin de la fase mvil y estacionaria Tamao de partcula Composicin del flujo Detector
1. El compuesto pasa por la columna cromagrafica a travs de la fase estacionaria mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin a travs de la columna. 2. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. (El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil) 3. Despus los componentes pasan por un detector que genera una seal (dependiendo de la concentracin y del tipo de compuesto) 4. Se utiliza una bomba para impulsar a la fase mvil con velocidad y presin contante. 5. Luego llegan a las columnas en donde hay unos detectores que no hacen ms que indicar el momento de aparicin de los distintos componentes que constituyen la muestra. Caractersticas Que Debe Tener Una Fase Mvil (Solvente) Tener Baja Viscosidad Para Reducir Las Cadas De Presin Ser Compatible Con El Detector Utilizado No Debe Disolver La Fase Estacionaria Bajo Contenido De Impurezas
CONCLUSIN Con esta prctica pudimos observar que funcin cumple el cromatografo de lquidos de alta resolucin el cual se encarga cuantificar y determinar el contenido de cada solucin mediante la separacin de compuestos y su anlisis digital que nos ayuda a calcular el contenido de cada solucin mediante grficas y reas bajo la curva que nos dan como resultado una exactitud de compuestos que contiene cada muestra liquida. Tambin se pudo observar mediante esta prctica que elementos componen un cromatografo de lquidos de alta resolucin.