T n i c a s h i s t o l g i c a s

5 . T I N C I O N E S G E N E R A L E S
La mayora de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos teirlos para observar
sus caractersticas morfolgicas. Las tinciones generales estn basadas en el uso de colorantes, sustancias mediante las
cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se caracterizan por unirse a
ciertas molculas presentes en los tejidos gracias a afinidades qumicas. Se utilizan normalmente para teir a las clulas y
componentes tisulares que van a ser observados con el microscopio ptico y por ello se realizan habitualmente sobre
secciones de tejido, siendo las ms utilizadas las secciones obtenidas a partir de inclusiones en parafina u obtenidas en el
criostato. Los colorantes son los elementos principales de las tinciones generales. Son molculas que poseen tres
componentes importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromtico de benceno, al cual se le unen
dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominado cromforo, y otro que posibilita la unin a elementos del tejido
denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molcula se denomina cromgeno.
Segn la naturaleza qumica del cromforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, derivados de la
antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinnicas, derivados de diferrilmetano y triferrilmetano,
derviados del xanteno y derivados de las talocianinas.
Segn la naturaleza qumica del radical auxocromo los colorantes se clasifican en:
Bsicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte cida es incolora. Tienen apetencia por
sustancias cidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los glucosaminoglucanos.
As, ponen de manifiesto el ncleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy abundante, as
como ciertas matrices extracelulares ricas en componentes cidos. Ejemplos de colorantes bsicos son la tionina, safranina,
azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina
cidos: son sales con el anin coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por sustancias bsicas, sobre todo
estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y tambin el colgeno de la matriz extracelular. Ejemplos de
colorantes cidos son la fucsina cida, verde rpido, naranja G o la eosina.
Neutros: poseen una porcin cida y otra bsica, ambas con capacidad para aportar color. Por tanto un mismo
colorante puede teir tanto las partes bsicas como las cidas de los tejidos. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.
Indiferentes: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad qumica sino porque se disuelven en ellos.
Por ejemplo, el colorante sudn se disuelve en los lpidos y por tanto teir a las gotas de lpidos, especialmente en los
adipocitos.
En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos tisulares de manera especfica y para ello usamos colorantes
que tienen apetencia por dichas estructuras. Por ejemplo, la tincin denominada azn contiene azocarmn y anilina-naranja-
cido actico que tie los ncleos de rojo y sobre todo destaca el conectivo intensamente teido de azul. Otra tincin
combinada es el tricrmio de Mallory que tie el colgeno de verde, las clulas musculares de rojo.
Cuando un colorante se une al tejido y refleja un color diferente al que tiene en solucin se dice que ha ocurrido un
fenmeno de metacromasia. Esto se debe a que las propiedades de absorcin de la luz del colorante cambian al unirse a
componentes celulares. Por ejemplo, el azul de toluidina se vulve prpura cuando se une a ciertos grnulos de los
mastocitos. Cuando el colorante unido al tejido tiene el mismo color que en solucin se denomina ortocromasia.
Tincin general. Una de las tinciones ms comnmente usada en histologa es la hematoxilina-eosina sobre cortes de
parafina. Como vemos se usa un colorante bsico y otro cido para teir de diferente color a las estructuras cidas y
bsicas de la clula. Antes de proceder a la tincin, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos
tratamientos previos sobre las secciones como es el desaparafinado, puesto que estos cortes son hidrosolubles. Si partimos
de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.

Seccin de un glomrulo de un rin de mamfero obtenida a partir de una inclusin en parafina y teido con hematoxilina-eosina. Los ncleos aparecen de
color violceo (hemtoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina).

Pasos que se siguen durante una tincin general de hematoxilina-eosina. Los tiempos son aproximativos porque dependen del grosor de los cortes y de la
concentracin de los colorantes. El desparafinado permite eliminar el medio de inclusin, la parafina. El paso por agua de grifo es tpico de la hematoxilena y
se denomina diferenciacin. Las sales del agua permiten obtener una coloracin ms violcea, en vez de prpura. La deshidratacin final es necesaria porque
el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades pticas excelentes.
Adems, conservan las preparaciones durante aos en buenas condiciones. Tras el montado y secado (evaporacin del xileno), las secciones se puede observar
con el microscopio ptico.
Tincin de semifinos. Cuando se procesa material para microscopa electrnica es necesario, a veces, hacerse una
idea de qu zona del tejido vamos a cortar. Tngase en cuenta que el rea de una seccin para observar con el microscopio
electrnico es muy pequea. Adems, el proceso de osmificacin que ha de llevarse a cabo previamente a la inclusin
acarrea el oscurecimiento del tejido, con lo que dificulta an ms la orientacin de la muestra. Por ello es frecuente hacer
secciones de 0.5 a 1 m de grosor con el ultramicrotomo, para orientarnos en la muestra y seleccionar la zona a partir de la
cual haremos las secciones ultrafinas. Los semifinos suelen tener reas ms ms grandes que las que posteriormente
vamos a usar para la obtencin de las secciones ultrafinas. El colorante usado para teir secciones semifinas es
normalmente el azul de toluidina, el cual puede infiltrase en la resina calentada en un plancha y llegar hasta el tejido.
Contraste de ultrafinos. El contraste no es estrictamente una tincin, puesto que no aporta color a la muestra, pero s
es un proceso para poder observar los componentes ultraestructurales de la clula, por ese motivo lo incluimos en este
apartado. Aunque las secciones para microscopa electrnica se pueden observar directamente con el microscopio
electrnico se suelen tratar previamente con metales pesados en un proceso denominado contraste, obteniendo as una
imagen ptima de la ultraestructura celular. Tngase en cuenta que en la microscopa electrnica lo importante no es aadir
sustancias coloreadas sino molculas que puedan interferir con el camino de los electrones emitidos por el microscopio y
que atraviesan la muestra. Los electrones que atraviesan la muestra inciden sobre una pantalla fosforescente que emitir
destellos de luz cuando reciban el impacto de un electrn y permite observar las caractersticas del tejido. Los metales
pesados unidos al tejido impedirn que pasen los electrones y por tanto se ver una zona negra en la pantalla
fosforescente, mientras que en aquellas zonas de la clula donde no estn estos metales provocaran reas luminosas en
dicha pantalla. Por ello todas las imgenes originales de microscopa electrnica son en blanco y negro, aunque se puedan
colorear posteriormente con un ordenador.

TINCIONES HEMATOLGICAS
La realizacin de extensiones y tinciones es prctica habitual en el laboratorio. Pese a no realizarse a todas las
muestras, al no ser considerado procedimiento de rutina, es necesario en aquellos casos en los que se detecte
mediante anlisis previos alguna alteracin.
La correcta realizacin, as como una buena interpretacin de lo observado, permite en muchos casos el
diagnstico de hematopatas.
1. INTRODUCCIN.
Las tinciones hematolgicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloracin de las estructuras que
componen las clulas sanguneas. Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio
que las rodea, y permite por tanto que las clulas sean visual izadas microscpicamente con mayor facilidad.
2. TIPOS DE TINCIONES.
Las tinciones hematolgicas pueden clasificarse segn distintos criterios:
Atendiendo al nivel de vitalidad de las clulas que se pretende colorear, se dividen en tinciones vitales y no vitales.
Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el diagnstico hematolgico, se dividen en tinciones
tradicionales y especiales.
2.1. TINCIONES VITALES Y NO VITALES.
Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre clulas que estn vivas.
Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un
colorante en la circulacin de un organismo vivo. Son colorantes vitales, por ejemplo, el verde Jano y el azul de
metileno.
Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del
organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas
muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el
adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijacin puede realizarse mediante calor, aunque
habitualmente se realiza con etanol o metanol.
2.2. TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES.
Tradicionalmente, las tinciones se han logrado mediante el uso de colorantes que con frecuencia derivan de la
anilina (tinciones tradicionales o clsicas). Estos colorantes se renen en 4 grupos:
Colorantes cidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la hemoglobina.
El principal de ellos es la eosina.
Colorantes bsicos: tienen una especial afinidad por las estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los cidos
nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno.
Colorantes neutros: son sales de un cido y de una base coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Uno
de ellos es el eosinato de azul de metileno.
Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua y tien a
aquellas sustancias que tienen un poder de disolucin superior al del lquido empleado para preparar la solucin colorante. Uno
de ellos es el Sudn III empleado para teir las grasas.
Tambin hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polcromas. Una coloracin es panptica
cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras y es pancrmica cuando se aplican todas las
sustancias colorantes neutras juntas.
El primero que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes
hematolgicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que l prepar.
Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante cido (eosina) y de colorantes bsicos (tiacinas). Las
tiacinas son el azul de metileno y sus derivados obtenidos por desmetilacin oxidatiya (colorantes tipo azur).
Las tinciones realizadas con colorantes de tipo Romanowsky, que ms frecuentemente se emplean en el diag-
nstico hematolgico, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinacin con la de May-Grnwald).
Tambin hay tinciones panpticas rpidas que producen una coloracin fcil y rpida de las estructuras celulares.
Las tinciones especiales slo se usan en circunstancias especficas. Son de dos clases:
Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las clulas y que, cuando son estimulados por una
luz ultravioleta, emiten una radiacin visible, de un color caracterstico. Los fluorocromos ms utilizados en esta clase de
tinciones son el naranja de acridina y el rojo neutro.
Tinciones citoquimicas: demuestran la presencia, ms o menos abundante, o la ausencia de deteminadas sustancias, localizadas
en el interior de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos.
Sirven para reconocer clulas leucocitarias (normales o anmalas) y, por tanto, para diferenciar unas clases de
leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante preparado a base de diaminobenzidina y de agua oxigenada,
descubre la presencia de peroxidasa endocelular, y por consiguiente permite atribuir el origen de unas clulas
leucocitarias inmaduras a la lnea granuloctica o a la monoctica.
3. DENOMINACIN DE LAS ESTRUCTURAS COLOREADAS.
Atendiendo a sus apetencias tintoriales, las estructuras celulares pueden nombrarse de las siguientes formas:
Estructuras acidfllas u oxifilas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza cida.
Si el colorante cido que captan es la eosina, se dice que son eosinfilas. Con las tinciones tradicionales adquieren
un color rosado.
Estructuras basfllas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina.
Con las tinciones tradicionales adquieren un color azulado. Si se tien de lila o prpura con colorantes de tipo azur,
se llaman azurfllas.
4. CAUSAS DE ERROR EN LAS TINCIONES REALIZADAS A FROTIS SANGUNEOS.
Si la tincin de una extensin sangunea es demasiado rosa, probablemente esto se deba a:
Un pH bajo del colorante.
Un tiempo de coloracin insuficiente.
Un lavado excesivamente prolongado.
Si la tincin es demasiado azul, posiblemente, esto est causado por: un grosor excesivo de la extensin, o un pH alto del
colorante.
Una coloracin excesivamente prolongada.
Un lavado insuficiente.
Si tras la tincin aparecen artefactos o/y precipitados en la extensin, probablemente esto se deba a:
Un empleo de portaobjetos sucios.
Una falta de filtracin del colorante.
Una coloracin excesivamente prolongada.
Un secado del colorante durante la tincin.
Un lavado insuficiente.
Muchos de estos errores pueden obviarse utilizando teidores automticos de las extensiones sanguneas.
Actualmente, no suelen emplearse en la prctica clnica.
5. TINCIN GIEMSA.
Las tinciones hematolgicas tipo Romanowsky utilizan azul de metileno y sus productos de oxidacin (azur A, azur
B y azur C) como colorantes bsicos, combinndolos con la eosina como colorante cido.
De este modo, obtenemos una tincin diferencial, es decir, una tincin que es capaz de discriminar entre las
distintas estructuras celulares segn se tian stas con el colorante cido, con el bsico o con la mezcla de ambos.
Segn la proporcin de azul de metileno y de eosina que compongan el colorante tendremos distintos mtodos de
tincin. Entre ellos, los ms conocidos son el mtodo de Giemsa, el de Wright, el de Leishman y el pan ptico de
Pappenheim.
Metdica
Es un extracto de las tcnicas de tincin hematolgicas de la casa Panreac.
Fundamento
Utilizamos como colorante la mezcla de azul de metileno y eosina propuesta por Giemsa.
Material necesario
Microscopio ptico.
Portas bien limpios.
Cristalizador.
Puentes de tincin.
Pipetas Pasteur con chupete.
Frascos lavadores.
Tubos de ensayo.
Reactivos
Colorante en solucin segn Giemsa de Panreac.
Solucin tampn pH 7,2 de Panreac.
Metanol.
Aceite de inmersin.
Muestra
Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. El anticoagulante de eleccin es la heparina o el EDTA, ya que el
citrato sdico y el oxalato potsico pueden dar preparaciones defectuosas.
Tcnica
Preparamos un frotis sanguneo segn la tcnica descrita con anterioridad.
Colocamos el frotis sobre el puente de tincin, en el cristalizador y en posicin horizontal.
Cubrimos el frotis con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y lo dejamos secar al aire. Con esto procedemos a fijar el frotis.
Diluimos en un tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno segn Giemsa con 2 ml de solucin tampn pH 7,2. Es
importante realizar esta dilucin en el momento de la tincin, ya que el colorante precipita y no es vlido para otro da.
Mezclamos suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frotis con la dilucin de colorante, dejndolo actuar
durante 25 minutos.
Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampn pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante.
Dejamos escurrir y secamos en posicin vertical.
Lectura de resultados
Una vez seca la tincin, echamos una gota de aceite de inmersin y examinamos al microscopio ptico con el
objetivo de 100 x.
Los eritrocitos se tien de color rosa asalmonado y las plaquetas de color violeta.
Los neutrfilos presentan el ncleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulacin de un color violeta
rojizo.
6. TINCIN DE WRIGHT.
Metdica
Extracto de las tcnicas de tincin hematolgica de la casa Panreac.
Fundamento
El colorante utilizado es una solucin de eosina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al 75%) y azur B (del 10
al 25%) junto con otros derivados del alcohol metlico.
Dada la presencia de metanol en la composicin del colorante, no es necesario un paso previo de fijacin antes de
la coloracin.
Slo si se van a guardar las extensiones sin teir de un da para otro precederemos a su fijacin para evitar el
deterioro del frotis.
Material necesario
Microscopio ptico.
Cristalizador.
Puentes de tincin.
Pipetas Pasteur con chupete.
Frasco lavador.
Guantes.
Tubos de ensayo.
Reactivos
Solucin de eosina-azul de metileno segn Wright.
Solucin tampn pH 7,2.
Aceite de inmersin.
Muestra
Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. Los anticoagulantes ms adecuados son la heparina y el EDTA.
Tcnica
Realizar un frotis sanguneo muy fino. Dejar secar al aire.
Sobre la extensin colocada horizontalmente en el puente de tincin verter 1 ml de eosina-azul de metileno. Dejamos actuar un
minuto y lavamos con solucin tampn pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posicin vertical.
Inmediatamente antes de su empleo y en un tubo de ensayo, diluimos 0,5 ml. de eosina-azul de metileno con 0,5 ml de solucin
tampn pH 7,2. Mezclamos bien y cubrimos con esta dilucin la extensin. Teimos durante 3-5 minutos y lavamos con agua
del grifo. Volvemos a lavar con solucin tampn pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posicin vertical.
Lectura de resultados
Depositamos una gota de aceite de inmersin y observamos con el objetivo de 100 x.
Las clulas se observan coloreadas de la misma manera que con la tincin de Giemsa.
7. TINCIN PANPTICO RPIDO.
Metdica
Extracto de la tcnica Panptico rpido de la casa QCA.
Fundamento
Este mtodo de tincin diferencial es un sistema que ana la policroma y la calidad que proporcionan los mtodos
clsicos (Giemsa y Wright) con una gran rapidez de ejecucin (15 segundos solamente).
Frente a las tcnicas de tincin descritas anteriormente, donde el colorante se extenda sobre el frotis, sta
presenta la peculiaridad de ser un mtodo de inmersin, donde el frotis se sumerge en la solucin colorante
durante un tiempo determinado.
Material necesario
Cubetas de Wertheim o similares.
Cestillo para portas.
Frasco lavador.

Reactivos
Solucin n 1: Solucin alcohlica de triarilmetano.
Solucin n 2: Solucin tamponada de xanteno.
Solucin n 3: Solucin tamponada de tiazina.
Agua destilada.
Muestra
Frotis sanguneo preparado recientemente y que se ha dejado secar al aire.
Tcnica
En tres cubetas de Wertheim o similares se disponen los colorantes solucin n 1, n 2 y n 3.
Colocamos los frotis en el cestillo para portas y lo sumergimos en la cubeta con la solucin n 1 durante 1 segundo. Repetimos
la inmersin cuatro veces (en total 5 segundos). Dejamos escurrir.
Sumergimos a continuacin otras cinco veces, cada una de un segundo de duracin, en la cubeta con la solucin n 2. Dejamos
escurrir.
Finalmente, sumergimos otras cinco veces de un segundo cada una en la cubeta con la solucin n 3. Lavamos con agua
destilada y dejamos secar.
Lectura de resultados
Depositamos una gota de aceite de inmersin sobre el frotis y observamos con el objetivo de 100 x.
Las coloraciones obtenidas en las clulas sanguneas son similares a las de la tincin de Wright y Giemsa. Sin
embargo, podemos variar la intensidad de la tincin modificando el nmero de inmersiones en los colorantes n 2 y
n 3, segn se desee destacar las tonalidades rosas o las azules.
Notas sobre el mtodo
Las cubetas con las soluciones colorantes, especialmente la del n 1, debern guardarse siempre bien tapadas, con el fin de
evitar una evaporacin excesiva que podra inducir a desviaciones de color respecto a las tinciones habituales.
Antes de agotar el contenido de una cubeta, debemos ir adicionando una nueva cantidad de solucin colorante para mantener,
da a da, un nivel apropiado del mismo. De vez en cuando se debe renovar todo el contenido de la cubeta.
En aquellos laboratorios con pequeo nmero de frmulas hemticas, las cubetas de Wertheim pueden ser sustituidas
ventajosamente por pequeos frascos de cristal con tapn a rosca.