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PROPIEDADES TERAPUTICAS DEL COLGENO TIPO II
Lic. Javier Gonzalo.
CITOQUINAS Y SU PROTAGONISMO EN LAS RESPUESTAS INFLAMATORIAS
Las citoquinas son pequeas molculas protenicas producidas por clulas y son los
mayores intermediarios en la comunicacin intercelular local requerida para una respuesta
integral frente a una variedad de estmulos en los procesos inmunolgicos e inflamatorios.
Mediante la unin a su receptor en la clula target en sus inmediaciones, estas molculas de corta
vida media cumplen un rol importante en las actividades biolgicas, incluyendo la proliferacin
celular, activacin, muerte, y diferenciacin. Se ha visto en sistemas experimentales que algunas
citoquinas tienen actividad pro-inflamatoria, tal como la interleuquina-1 (IL-1) y el Factor de
Necrosis Tumoral-alfa (TNFo); y otras que ejercen predominantemente efectos anti-inflamatorios
como ser Interleuquina-10 (IL-10) y Factor de Crecimiento Transformante-beta (TGF|). Sin
embargo, es ahora sabido que varias citoquinas cuya actividad predominante es pro-inflamatoria
(ej. INF) pueden tambin, en algunos casos, tener propiedades anti-inflamatorias. De forma
similar, IL-10 y TGF pueden tener propiedades pro-inflamatorias en ciertas condiciones
experimentales. Las rutas parcrinas o autcrinas que involucran citoquinas tanto con propiedades
pro- o anti-inflamatorias forman redes complejas, y pueden determinar si la inflamacin crnica
ocurre o no [1].
Jerarqua de citoquinas
La multiplicidad en la expresin de citoquinas en condiciones de inflamacin crnica, hace
parecer imposible que bloqueando una sola citoquina podra afectar la inflamacin. De todos
modos, mediante experimentos en modelos animales y explantos de tejidos con artritis reumtica,
se ha demostrado que existe una jerarqua en la expresin de citoquinas (Figura 1) [1].

Figura 1. Jerarqua de las citoquinas en las reacciones de respuesta inflamatoria.
- Lleva a aumentar la vascularizacin, infiltracin de leucocitos, edema, enzimas catablicas.
- Lleva a daos del tejido, lo que tambin acta como estmulo inflamatorio.
- Se establece un ciclo desregulado de la inflamacin, el cual se mantiene.

Mediante experimentos se ha demostrado que un estmulo inflamatorio induce le produccin
de TNFo, y que inmediatamente sta induce a la produccin de IL-1, y tambin otros mediadores
pro-inflamatorios (incluyendo otras citoquinas). Adems IL-1 induce su propia produccin, TNFo, y

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otras citoquinas pro-inflamatorias. Tanto TNFo como IL-1, luego de un perodo de tiempo
determinado, comienzan a inducir la expresin de citoquinas anti-inflamatorias. Estas
observaciones llevan a la conclusin que TNFo e IL-1 pueden ser descriptas como reguladores
maestros (master regulators) de las respuestas inflamatorias, y que bloqueando la actividad de
estos mediadores se podra inhibir la inflamacin en la artritis reumtica [1].
INTRODUCCIN A LOS MODELOS ANIMALES QUE SE UTILIZAN PARA EL DESARROLLO DE
EXPERIMENTOS
Artritis
La Artritis Inducida por Colgeno (CIA) es un modelo experimental que comparte varias
caractersticas clnicas y patolgicas con la artritis reumtica (RA). CIA se ha utilizado para el
estudio de la patognesis de RA [2]. La importancia de las clulas T en la patognesis de RA y CIA
ha sido bien establecida [3], y se han realizado varios estudios para determinar las citoquinas y
otros factores involucrados en el desarrollo de la artritis. CIA esta mediada por la accin sinrgica
entre clulas T reactivas contra el Colgeno de Tipo II (CII) y anticuerpos contra CII [4]. Se ha
demostrado previamente que anticuerpos IgG anti-CII y respuestas de clulas T contra CII
estaban potenciadas en pacientes con RA, particularmente en el fluido sinovial, sugiriendo un rol
de reactividad anti-CII en la patognesis de RA [5, 6].
Otro modelo utilizado en animales bien establecido es la Artritis Adyuvante (AA) el cual,
como en el caso que se mencion anteriormente, tambin comparte muchas similitudes con la RA
[2].
Otro mecanismo se basa en que una simple inyeccin de fragmentos de pared celular
streptoccocal (SCW) en ratas susceptibles induce la inflamacin aguda de las articulaciones,
seguida por el desarrollo de una enfermedad proliferativa y degradativa crnica [7].
Induccin de la Tolerancia Oral
La induccin de la tolerancia oral esta mediada por 2 mecanismos principales,
dependiendo de la dosis del antgeno administrado. La ingesta de antgenos de forma repetida en
dosis altas puede inducir a delecin clonal y/o anergia [8, 9]. Por el contrario, dosis relativamente
bajas de antgenos pueden inducir a una supresin activa por la expansin de clulas reguladoras
capaces de secretar interleukina-4, interleukina-10, y/o TGF| |10, 11|. En particular, las clulas
secretoras de TGF| parecen representar un subgrupo nico de clulas reguladoras, las cuales han
sido denominadas clulas Th3. El TGF| endgeno est asociado con la supresin de respuestas
inmunolgicas patolgicas en enfermedades experimentales de respuesta autoinmune,
incluyendo CIA [12]. La administracin de anticuerpos anti- TGF| revierte la proteccin contra la
enfermedad por antgeno oral [11]. Por el contrario, el co-tratamiento con TGF| y CII potencia el
efecto de tolerancia oral con CII para CIA [13].
La supresin bystander ocurre cuando una respuesta inmunolgica frente a un eptope
suprime la respuesta hacia otro. Este es un mecanismo de regulacin de gran importancia en la

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autoinmunidad, donde la respuesta de supresin puede ser provocada por la administracin va
oral del antgeno [14]. Durante el curso de induccin de la supresin bystander, las clulas de las
placas de Payer (PP) y el TGF| secretado por las clulas Th3 juegan importantes roles [15], los
cuales quedaran evidenciados en los ensayos que se explicarn luego.
La condicin de artritis crnica por SCW ha sido identificada como una respuesta
inmunolgica mediada por monocitos y clulas T [16], por lo que podra ser modulada
potencialmente por un agente inmunosupresor tal como el TGF| [17].
El Factor Transformante de Crecimiento beta (TGF|)
Los miembros de la familia del Factor Transformante de Crecimiento beta (TGF|) son
factores pleiotrpicos producidos por una variedad de clulas, y cuya actividad depende del
contexto donde son producidos [18]. Adems de tener efectos en la proliferacin celular,
diferenciacin, regulacin de la matriz y reparacin de tejido; TGF| es principalmente un factor
inmunorregulador [18]. El TGF| es un estimulador de la produccin componentes de la matriz
extracelular, tales como colgeno de tipo II y proteoglicanos (PG), en los condrocitos y regula
negativamente la produccin de enzimas degradativas de la matriz [19]. Altas concentraciones de
TGF| estn almacenadas en los cartlagos [20].
Como el TGF| es uno de los factores anablicos involucrados en la mantencin de la
integridad del cartlago, podra tambin ser un buen candidato como agente reparador del
cartlago. De hecho, por ejemplo, en la osteoartritis (OA), enfermedad degenerativa de las
articulaciones que se caracteriza por la degradacin de los cartlagos y la fibrosis sinovial; la
expresin de TGF| en los cartlagos est disminuida [21]. Este aspecto tambin se analizar ms
adelante.
EVIDENCIA DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL TGF| EN MODELOS ANIMALES
a.- En el ensayo realizado por Christoph Schramm y colegas [22] se utilizaron ratones
transgnicos que tienen interrumpida la ruta de sealizacin del TGF| en las clulas T para
estudiar los efectos inmunorreguladores del TGF| en el mantenimiento de la homestasis de las
articulaciones en CIA. Los ratones transgnicos expresan en sus clulas T un receptor TGF|
dominante negativo de tipo II, bajo el control del promotor CD2 (humano). A este receptor le falta
el dominio quinasa intracelular, que es responsable de la fosforilacin del receptor de tipo I y la
subsecuente activacin de la cascada de seales. Los receptores truncados compiten con los
endgenos en la superficie celular, llevando a un bloqueo de la transduccin de seales mediadas
por TFG|. En este caso la induccin de CIA se realiz mediante la utilizacin de colgeno tipo II de
pollo (va inyeccin).
Encontraron una mayor incidencia de CIA en los ratones transgnicos, e ndices ms altos
de artritis clnica e histolgica, con una produccin incrementada de citoquinas Th1 por las clulas
de los ganglios linfticos. Estos descubrimientos muestran la importancia de los efectos
regulatorios del TGF| endgeno de las clulas T en el mantenimiento de la integridad de la
articulacin.

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Resultados
En 4 experimentos independientes en donde se analiz la fase aguda de artritis, la
incidencia de artritis total en los ratones transgnicos fue de 57%, comparado con slo el 35% de
la camada wild-type (wt). La artritis normalmente se desarroll dentro de los primeros 10 das
luego de la inyeccin de CII y dur, por lo menos 4 semanas, donde se alcanz un estado estable;
y se sacrificaron los ratones. El ndice de artritis clnica fue significativamente ms alto en los
ratones transgnicos respecto de los wt. (Figura 2b). En los experimentos de largo plazo, donde se
analiz la fase de curacin de la enfermedad, se alcanz un plateau de la actividad de la
enfermedad en los ratones transgnicos luego de 12 semanas. A partir de all la artritis crnica
desarrollada se mantuvo estable las 10-12 semanas posteriores sin mostrar sntomas de mejora.
(Figura 2a).

Figura 2.Incremento de la severidad clnica e histolgica de la artritis en los ratones transgnicos con la ruta TGF| interrumpida en las
clulas T. (a) Tiempo de curso de la severidad de la artritis luego de la inyeccin de induccin a CIA (da 0). Este experimento involucr 6
ratones wt y 8 transgnicos. (b) El mximo ndice clnico de artritis fue significativamente ms alto en los ratones transgnicos que en
los wt (valorE; **P=0.001). (c) Anlisis histolgico de cambios inflamatorios y degradativos en ratones con ndice clnico de al menos
grado 1. Los ratones transgnicos tuvieron ndices histolgicos significativamente ms altos que los wt (valorE; *P<0.05). TG, tg,
transgenico; WT, wt, wild-type.

Los cambios degenerativos e inflamatorios fueron mucho ms severos en los ratones
transgnicos que en los wt. (Figura 2c). En estos ltimos se observaron cambios inflamatorios
menores y la superficie de cartlago lisa sin destruccin significativa. En cambio, en los
transgnicos, se observaron cambios inflamatorios severos, incluso tambin en el tejido blando
peri articular, y se observaron numerosos neutrfilos en el espacio articular en articulaciones
pequeas y grandes.
De los animales afectados se removieron los ganglios linfticos, y a partir de all se
removieron clulas y se cultivaron en presencia de CII. Se observ una incrementada proliferacin
celular en el cultivo de clulas provenientes de los animales transgnicos, comparado con los
cultivos provenientes de animales wt. (Figura 3a). Luego de la co-estimulacin de estos cultivos
con CD3/CD28, una capacidad proliferativa incrementada se observ en los cultivos provenientes
de ratones transgnicos comparado con los provenientes de animales wt, luego de 20 semanas de

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la induccin de la artritis. (Figura 3b). Las citoquinas Th1 tales como IFN y TNFo fueron
expresadas en mayor medida luego de la co-estimulacin, y de la estimulacin con CII (Figuras 3c y
d).

Figura 3.Incremento en la proliferacin y en la prduccin de citoquinas Th1 en los cultivos de clulas de ganglios linfticos de los ratones
transgnicos. (a) Proliferacin celular 5 semanas despus de la induccin de la artritis. Las clulas fueron estimuladas in vitro con
50mg/ml de CII y cultivadas durante 48 horas (valor+E). En este experimento se utilizaron 10 ratones transgnicos y 11 wt. (b)
Proliferacin de las clulas de ganglio linftico luego de 20 semanas de la induccin de la artritis. Las clulas fueron estimuladas con
anticuerpos anti-CD3/CD28. Fueron includos 8 ratones transgnicos y 6 wt. (c,d) Se determinaron los niveles de citoquinas de los
sobrenadantes de los cultivos de las clulas de ganglios linfticos luego de 20 semanas de la induccin de artritis mediante la tcnica de
ELISA, en (c) las clulas se estimularon con CII y en (d) se co-estimularon con anticuerpos anti-CD3/CD28. Cpm, cuentas por minuto; TG,
transgenicos; TNF, factor de necrosis tumoral; WT, wild-type.


A partir de estos resultados se demuestra la importancia del TGF| endgeno de las clulas
T en el mantenimiento de la integridad de las articulaciones in vivo.
Tambin se ha demostrado una produccin incrementada de las citoquinas Th1, como
TNFo e INF en los cultivos celulares provenientes de clulas de ratones transgnicos luego de la
induccin de la artritis. Estas citoquinas estn involucradas en la patognesis de la artritis y
pudieron ser elevadas tanto por haber una inflamacin ms severa en los ratones transgnicos, o
bien por una diferenciacin espontnea in un cambio de citoquinas observado en las clulas T con
la ruta de seales interrumpida.
b.- En otro ensayo para evaluar los efectos del TGF| como un agente teraputico contra la
artritis realizado por Mary E. Branders y colegas [17], se administr diariamente, va inyeccin
intraperitoneal, TGF|1 a ratas Lewis en dosis de 0,1; 1,0 y 5,0 g/100g rata, comenzando un da
antes de la inyeccin de SCW, para iniciar la artritis. Los animales tratados con SCW, pero que no
se les suministr TGF|1, sufrieron hinchazn aguda crnica de las articulaciones y deformaciones,
caractersticas tpicas de la artritis inducida por SCW (Figura 4). Sin embargo, cuando se
administraron 5,0g/100g rata diariamente durante la evolucin de la respuesta de la artritis, los
animales mostraron una fase inflamatoria aguda muy debilitada, y virtualmente no mostraron fase
inflamatoria crnica.

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Figura 4. Modulacin de la artritis inducida por SCW por el TGF|1. Los animales fueron inyectados con SCW en el da 0. Algunos
animales no recibieron tratamiento adicional (crculos); otros fueron tratados con el suministro diario de TGF|1 de 0,1g (tringulos
invertidos); 1,0g (cuadrados) o 5,0g (tringulos); comenzando el da anterior a la inyeccin. Cada punto representa el valor medio del
conjunto para cada grupo de animales (n=3-5). No se muestran los datos de los grupos control, los que mostraron un valor=0 durante
todo el experimento. El ensayo se repiti por triplicado arrojando resultados similares.

Luego evaluaron si el TGF|1 puede no solo prevenir, sino tambin suprimir los eventos de
inflamacin crnicos. Para ello, la administracin de TGF|1 (5g/animal por da) comenz en el da
10, posterior al tratamiento de las ratas con SCW, y se continu durante 18 das. Usaron un grupo
control. Una vez que comenz la administracin diaria de TGF|1 los ndices del grupo tratado
comenzaron a divergir de los correspondientes al grupo no tratado. El TGF|1 suprimi
efectivamente la fase crnica de la artritis [17]. (Figura 5).

Figura 5. Efecto del tratamineto con TGFb1 en la fase crnica de la artritis. Las ratas Lewis fueron inyectadas el da 0 con SCW, y a partir
del da posterior se fue determinando su Indice de artritis (AI). En al da 10, a la mitad de los animales (crculos negros) se les comenz a
administrar una dosis diaria de 5g de TGF|1/animal. Los crculos blancos representan los ndices de los animales a los cuales no se les
suministr tratamiento.

El tratamiento con TNF|1 mostr suprimir el aumento en el nmero de los leucocitos
circulantes, sugiriendo esto que la inhibicin de leucocitos podra ser importante para prevenir la
artritis. Este efecto no se observ durante la fase aguda, pero se observ consistentemente en la
fase crnica y fue dependiente de la dosis de TGF|1 administrada [17]. (Figura 6).

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Figura 6. Alteracin en el nmero de glbulos blancos circulantes (WBCs) luego del tratamiento con TGFb1. La figura muestra el
recuento total de WBCs de los animales control y los inyectados con SCW en el da 32 del proceso.

Se mostr en este estudio que TGF|1 inhibe efectivamente el desarrollo de las
condiciones artrticas inducidas en ratas y la degradacin del tejido conectivo, va efectos
inmunorreguladores. Estos datos sugieren que el TGF| es efectivo para controlar el proceso de la
enfermedad, mientras que produce mnimos efectos secundarios a pesar de su presencia en
cantidades no fisiolgicas [17].
Segn los autores este es el primer estudio que aborda el potencial teraputico del TGF|
para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crnicas.
EFECTO REPARADOR DEL CARTLAGO MEDIADO POR TGF|
La inyeccin de TGF-| en las articulaciones de las rodillas de murinos produce un aumento
en la produccin de PG en los cartlagos de dichas articulaciones. [23]. Adems en modelos
experimentales de murinos con artritis reumatoidea, la inyeccin de TGF| protegi a los cartlagos
de la perdida de PG [24]. Tambin, se ha demostrado que TGF| contrarresta los efectos anablicos
del factor interleukina-1 (IL-1), el cual es un potente inductor de la degradacin del cartlago [25].
Estos datos sugieren que TGF| tiene gran potencial como herramienta para estimular la
reparacin del cartlago daado.
En ensayos in vitro, condrocitos transfectados con adenovirus que codifican la expresin
de TGF| produjeron una elevada cantidad de PG y colgeno [26]. En este caso, Esmeralda N Blaney
Davidson y su equipo, evaluaron si la sobreexpresin adenoviral del TFG| en la membrana sinovial
puede reparar in vivo el cartlago daado.
Ya en estudios previos, van Beuningen y colegas [27] demostraron in vivo que TGF|
contrarresta los efectos deletreos sobre el cartlago producidos por IL-1 relacionados con la
sntesis de PG; pero la va de administracin de TGF| fue mediante inyeccin. En este estudio [28]
primero produjeron un dao en los cartlagos mediante la inyeccin de IL-1, y subsecuentemente
la sobreexpresin de TGF| mediada por adenovirus. De este modo pudieron evaluar si TGF| era
capaz de reparar los cartlagos daados.
Como resultado de la sobreexpresin del TGF| luego de la inyeccin de IL-1 restaur casi
completamente el contenido de PG que se encontraba considerablemente reducido (96% frente al

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control). Estos datos muestran que la sobreexpresin del TGF| puede estimular la reparacin del
cartlago. (Figura 7).

Figura 7. Efecto de la expresin adenoviral del factor TGF| sobre la sntesis de proteoglicanos (PG) y el contenido en el cartlago. El
contenido de PG fue determinado mediante la intensidad de la tincin con safranina en el cartlago. El valor del contenido de PG de las
articulaciones de rodilla no tratadas fue tomado como el 100%. Luego de la exposicin frente a IL-1, se observ una clara reduccin del
contenido de PG (p < 0,05). Seguido de esto, se indujo la expresin adenoviral de TGF| y se observ que el contenido de PG en los
cartlagos era casi normal.
.
Habiendo visto ya los mecanismos inmunomoduladores ejercidos por el TGF|, y la
importancia que estos tienen en el mantenimiento de la integridad de los cartlagos en las
articulaciones, ahora podemos analizar el efecto que produce el Colgeno de Tipo II (CII) sobre el
TGF| cuando es ingerido por va oral, en determinadas concentraciones; y como se traduce esto
en la salud de los cartlagos en las articulaciones y del tejido sinovial.
MECANISMO DE ACCIN DEL COLGENO II BOVINO (CII) EN LA MODULACIN DE LA
ACTIVIDAD DE CITOQUINAS MODELO ANIMAL
Este experimento realizado por Wan-Uk Kim y colegas [29], tiene como objetivo presentar
y evaluar una estrategia de tratamiento novedosa para la induccin de tolerancia oral mediante la
ingesta de CII contenido en partculas nanomtricas de polmero(PLGA-CII), y lo compara con la
ingesta de CII solo. A los fines prcticos, lo que nos interesa mostrar a nosotros es el efecto que
produce el CII en el desarrollo de la artritis; atendiendo la comparacin que hacen los autores, y
confirmando la eficacia que posee el CII para el tratamiento de CIA en ratones.
Proteccin contra CIA por la administracin de CII
Se observa en la figura 8 que los ratones alimentados con una dosis simple de 3,0mg de
PLGA-CII conteniendo 40g de CII (n=20) tuvieron un ndice significativamente menor de artritis
comparado con los ratones alimentados solo con solvente. Adems, tambin se puede observar
que los ratones alimentados con CII tambin desarrollan una mejora muy notable respecto de los
sntomas de la enfermedad.

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Figura 8. Efecto de la administracin de CII en la severidad e incidencia de la artritis. Se utilizaron 78 ratones que fueron divididos en 4
grupos. Un grupo de ratones (n=20) fue alimentado con PLGA-CII, en el da 14 posterior a la inmunizacin con CII (da 0). Otro grupo
(n=20) fue alimentado con 20g de CII (en los das -3, -5, -7, -12 y -14). Como controles se utiliz un grupo (n=19) a los que se administr
solamente solvente; y a otro grupo (n=19) que se le administr PGLA sin CII. A, Indice de artritis, B, Incidencia de artritis y C, Nmero de
extremidades con artritis fueron determinados 5 semanas despus de la inmunizacin.

Los mismos autores remarcan que la incidencia de artritis y el nmero de extremidades
con artritis tendi a ser menor en el grupo alimentado con PLGA-CII que en el grupo tratado con
CII; pero esta tendencia no tuvo alcanzo un valor estadstico significativo.
En otro tipo de experimento se administraron distintas cantidades de PLGA-CII (0,375-
12mg), conteniendo entre 5-160g de CII; a grupos de 12-15 animales. Como se observa en la
figura 9, un efecto supresor fue evidente, incluso, con la menor dosis testeada. Este efecto alcanz
su punto mximo con PLGA-CII en una concentracin de 3mg, y se mantuvo alto con las
concentraciones de 6 y 12mg, demostrando con esto que existe una relacin entre dosis de PLGA-
CII y la disminucin del efecto de la artritis.

Figura 9. Dependencia del efecto de supresin de artritis respecto a la dosis de CII. Varias cantidades de PLGA-CII (0,375-12mg),
conteniendo entre 5-160g de CII se administraron a grupos de 12-15 animales. Los valores son las medias y la SD. * = P < 0.05; ** =
P < 0.01; *** = P < 0.001.

Supresin de respuestas autoinmune contra CII en ratones tratados con PLGA-CII
Para investigar el efecto de PLGA-CII sobre respuestas inmunes especficas sobre CII, se
midieron los anticuerpos IgG contra CII en suero y respuestas proliferativas de clulas T contra CII
en ganglios linfticos 4 semanas despus de la inmunizacin. Como era de esperar los niveles de
anticuerpos IgG contra CII circulante fueron significativamente ms bajos en los ratones
alimentados con PLAG-CII o CII solo (Figura 10A). Adems, el ensayo de respuesta de las clulas T

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contra CII en los ganglios linfticos mostr que los ratones alimentados con CII o PLGA-CII tuvieron
un grado de estimulacin menor contra CII comparado con los otros grupos. (Figura 10B).

Figura 10. Supresin de la respuesta autoinmune debida a la administracin de CII. A, Niveles de anticuerpos IgG contra CII circulantes
en ratones alimentados con solvente solo (n = 19), 3.0 mg de PLGA (n = 19), 20g CII (n = 20), y 3.0 mg PLGA-CII conteniendo 40g CII (n
= 20), determinados 4 semanas posteriores a la inmunizacin. Las cajas representan los percentiles 25
0
y 75
0
; las barras verticales
muestran los valores mnimos y mximos; las barras horizontales en negrita muestran las medianas; los signos + muestran los
promedios. B, Respuestas de las clulas T en las clulas de ganglios linfticos. Los ganglios linfticos poplteos e Inguinales fueron
removidos de los ratones 4 semanas despus de la inmunizacin primaria. Grupos de clulas de ganglios linfticos de 4 o 5 ratones
fueron cultivadas con o sin CII (40g/well). Los valores provienen de 5 experimentos independientes. ** = P < 0.01; *** = P < 0.001.



Estas observaciones claramente muestran que la administracin de PLGA-CII o CII
suprimen efectivamente respuestas inmunolgicas especificas contra CII en CIA.
Inhibicin de la progresin de artritis debida a PLGA-CII
Para determinar el efecto del tratamiento con PLGA-CII sobre la progresin de la
enfermedad luego de la inmunizacin, se le administr PLGA-CII a ratones con artritis reciente
(n=16). Para este experimento se alimentaron ratones con una sola dosis de 3mg de PLGA-CII
luego de 3 semanas de la inmunizacin primaria. Los ratones control (n=18) fueron tratados
solamente con solvente. Aunque el tiempo de curso de la enfermedad no mostro diferencias
considerables entra los dos grupos, los ratones tratados con PLGA-CII mostraron una baja
considerable en la medida del ndice de artritis desde la semana 4 a la 8 luego de la inmunizacin.
(Figura 11A). Adems, los niveles de anticuerpos IgG contra CII, luego de 4 semanas posteriores a
la inmunizacin, fueron significativamente menores en ratones tratados con PLGA-CII comparados
con los tratados solamente con solvente. (Figura 11B).

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Figura 11. Supresin de la progresin de la enfermedad por PLGA-CII. Se administr PLGA-CII (n = 16) 3 semanas despus de la
inmunizacin primaria (flecha). Los ratones control fueron tratados solo con solvente (n = 18). A, Reduccin del valor del ndice de
artritis en los ratones alimentados con PLGA-CII. B, Niveles de anticuerpos IgG contra CII en ratones alimentados con PLGA-CII vs ratones
control, determinados 4 semanas despus de la inmunizacin primaria. * = P < 0.05; ** = P < 0.01; *** = P < 0.001.


Modulacin de la expresin de mRNA de citoquinas en el tejido, por PLGA-CII
Los mecanismos primarios por los cuales esta mediada la tolerancia oral son, supresin,
anergia y supresin activa [10, 30-32]. En particular, bajas dosis relativas de antgenos,
administradas repetidamente pueden inducir expansin y/o activacin de las clulas secretoras de
TGF|, las cuales han demostrado actuar como antagonistas de las respuestas pro inflamatorias
[31, 32]. Aqu se analiz si PLGA-CII (y CII solo) pueden inducir a las clulas secretoras de TGF|
en las placas de Peyer. Como se muestra en la figura 12, la expresin del mRNA de TGF| en las
placas de Peyer fue aumentada 6 veces con 20g de CII y ms potente aun con un simple
tratamiento de 3mg de PLGA-CII. El PLGA solo, increment ligeramente la expresin del mRNA
de TGF| , pero el solvente solo no la afect para nada. Por el contrario, la expresin del mRNA de
TNFo en los ganglios linfticos, 4 semanas despus de la inmunizacin primaria, se vio
fuertemente disminuida por el tratamiento con CII o PLGA-CII, pero no con el tratamiento con
PLGA solo o solvente solo.

Figura 12. Modulacin de citoquinas mediada por CII. La evaluacin de los niveles de expresin de mRNA de TGF| y mRNA de TNFo se
llevaron a cabo mediante Transcriptasa Reversa Reaccin en Cadena de Polimerasa (RT-PCR) 14 das despus de la primera
administracin de CII y cuatro semanas despus de la inmunizacin respectivamente. Arriba, expresin de mRNA de TGF| en clulas de
placas de Peyer (izquierda) y expresin de mRNA de TNFo en clulas de ganglios linfticos (derecha) de ratones tratados con solvente
solo (calles 1 y 5), una sola vez con 3mg de PLGA (calles 2 y 6), 6 veces con 20g de CII (calles 3 y 7), y una con 3 mg de PLGA-CII

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conteniendo 40g de CII (calles 4 y 8). Abajo, niveles de mRNA expresados como el nmero de veces que se increment en relacin a los
niveles de expresin de mRNA de clulas provenientes de ratones alimentados con solvente. Estos valores corresponden a uno de 3
experimentos similares.


Discusin
En este estudio se comprob que, tanto el PLGA-CII como la administracin de CII solo
reducen fuertemente los niveles circulantes de anticuerpos IgG anti-CII y respuestas de clulas T
contra CII en las clulas de los ganglios linfticos; y adems pueden prevenir el progreso de la
enfermedad y la produccin de anticuerpos anti-CII en ratones con artritis reciente.
Un aspecto importante de este estudio consiste en el modo de accin del CII (ya sea
encapsulado o solo). Los anlisis de RT-PCR revelaron que la expresin del mRNA TGF| en las
clulas de las placas de Peyer fue mucho ms alta en los ratones alimentados con CII que en los
ratones control. Por el contrario, la expresin de mRNA de TNFo en las clulas de ganglios
linfticos fue drsticamente reducida en los ratones alimentados con CII. Estas observaciones
sugieren que la administracin CII puede mejorar la progresin de la artritis mediante la
estimulacin de las clulas secretoras de TGF| en las placas de Peyer, inhibiendo as las clulas
secretoras de TNFo.
Tambin se encontr que los ratones tratados con CII mostraron una expresin alta de
mRNA de TGF| y baja expresin de mRNA de TNFo en los ganglios linfticos mesentricos,
comparado con los otros grupos de ratones, sugiriendo que los cambios en citoquinas descriptos
anteriormente no solo se limitan a las placas de Peyer.
Como conclusin del estudio, se pudo determinar que la administracin oral de CII produjo
la supresin del desarrollo de la artritis, como as tambin de las respuestas autoinmunes contra
CII; y produjo adems una fuerte induccin en la expresin de mRNA de TGF| en las clulas de las
placas de Payer. Todo esto sugiere que la administracin va oral de CII puede ser una estrategia
efectiva para el tratamiento de la artritis.
PRUEBA Y CONFIRMACIN DE EFECTIVIDAD EN MODELOS HUMANOS
A partir de varios experimentos realizados con animales [29,27, 10], de administracin de
CII va oral; se han observado mejoras notables respecto a los sntomas de la enfermedad, y no se
han observado efectos secundarios indeseables. Estas fueron razones suficientes y fundamentales
como para realizar estudios seguros en humanos.
Aqu haremos referencia a dos estudios independientes, que muestran la efectividad de la
ingesta va oral de CII por pacientes que padecen artritis.
a.- Para este estudio [33] se eligieron 10 pacientes que padecen la enfermedad y se les
quitaron los medicamentos inmuno-supresores o modificadores de la enfermedad, que
habitualmente toman; los cuales consisten en metotrexato, 6-mercaptopurina, azatioprina; y se
les suministr, va oral, 0,1mg diario de colgeno de tipo II (de pollo) durante un mes. Luego se
aument la dosis a 0,5mg por los siguientes 2 meses.

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Seis de los 10 pacientes (>50%) manifestaron respuestas clnicas substanciales de mejora
[rigidez matinal, caminatas de 15 minutos, fuerza de agarre, tasa de sedimentacin de eritrocitos
(ESR)]; y que perduraron por lo menos dos meses despus del periodo tratamiento. No se
observaron efectos adversos.
Basados en esta primera fase del estudio, se realiz una segunda fase de pruebas, en
donde se utiliz un control con placebo, para demostrar la eficacia del tratamiento.
Para esta prueba de fase II, se tomaron 60 pacientes con artritis reumtica severa. Al igual
que en el caso anterior, se les quitaron los medicamentos inmuno-supresores que tomaban
habitualmente, y aleatoriamente se les suministr un tratamiento idntico al de la fase I, o un
placebo indistinguible, para tomar oralmente durante 90 das.
Al finalizar el estudio, 59 de los 60 pacientes fueron considerados evaluables; de los cuales
28 recibieron CII, mientras que 31 recibieron placebo. En un principio, los parmetros
demogrficos, clnicos y de laboratorio eran similares para ambos grupos. (Tabla 1).
Caractersticas
Tratamiento con
Colgeno (n=28)
Tratamiento
con Placebo
(n=31)
Edad (aos=SD) 50.3 = 11.9 55.1 = 12.9
Sexo (% mujeres) 71 68
Duracin de la enfermedad (aos=SD) 9.8 = 6.2 10.3 = 8.1
Factor reumatoide [%, (nmero testeado)] 74 (27) 82 (28)
HLA-DR 4+ [%, (nmero testeado)] 46 (28) 62 (29)
Anticuerpo colgeno II [%, ttulo mayor a o igual
a 2)
32 13
Prednisona (%, menor que o igual a 10 mg/da) 25 48
Quita de immunosupresivos (%) 64 58
Tabla 1.
Se observ una significativa mejora en el nmero de articulaciones hinchadas, en el
nmero de dolores de articulaciones o tendones, caminatas de 15 minutos; al cabo de 1,2 y 3
meses en el grupo de los pacientes tratados con CII comparado con los pacientes tratados con el
placebo, excepto por el nmero de dolor en articulaciones al cabo del mes 2.







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En la siguiente tabla se ilustran los resultados:
Variable Grupo
Valor
nominal
inicial
(=SE)
Diferencia
frente al
valor inicial
al cabo de 1
mes
Diferencia
frente al
valor inicial
al cabo de 2
meses
Diferencia
frente al
valor inicial
al cabo de 3
meses
Articulaciones hinchadas (en nmero) Colgeno 11.8 = 0.9 -2.7=0.5** -4.1 = 1.0* -3.1 = 1.1*
Articulaciones hinchadas (en nmero) Placebo 12.0 = 0.8 2.0 = 1.4 0.9 = 1.6 1.3 = 1.4
Articulaciones sensibles a la presin o dolor en el
movimiento pasivo (nmero)
Colgeno 15.8 = 1.3 -4.1 = 1.1* -6.7 = 1.5 -5.4 = 1.8*
Articulaciones sensibles a la presin o dolor en el
movimiento pasivo (nmero)
Placebo 15.6 = 0.8 1.1 = 1.4 -1.1 = 1.7 -0.1 = 1.6
Indice de hinchazn de la articulacin Colgeno 13.3 = 1.1 -3.4=0.8** -4.8 = 1.2* -3.1 = 1.4*
Indice de hinchazn de la articulacin Placebo 13.2 = 0.9 2.4 = 1.8 0.9 = 1.6 4.3 = 2.1
Indice de sensibilidad o dolor de la articulacin Colgeno 17.5 = 1.3 -5.0=1.2** -7.6 = 1.7* -5.7 = 2.0*
Indice de sensibilidad o dolor de la articulacin Placebo 17.2 = 1.0 1.6 = 1.8 -0.5 = 2.1 3.0 = 2.4
Caminata de 15 min (s) Colgeno 13.2 = 0.6 0.0=0.3** 0.25=0.5** 0.5=0.6**
Caminata de 15 min (s) Placebo 14.9 = 0.9 1.9 = 0.6 3.8 = 1.2 20.8 = 7.5
Fuerza de agarre (mmHG)
Derecha Colgeno 105 = 9 0.1 = 6.0 6.3 = 7.8 -0.9 = 8.5
Derecha Placebo 87 = 8 -7.3 = 6.2 -8.3 = 8.4 -16.4 = 8.8
Izquierda Colgeno 106=10 0.6 = 5.6 6.6 = 7.4* -0.3 = 8.8
Izquierda Placebo 95 = 8 -8.9 = 5.8 -9.3 = 10.1 -13.8 = 9.7
Duracin de la rigidez matinal (min) Colgeno 155=51 64.8=106 51.2 = 100 56.4 = 92
Duracin de la rigidez matinal (min) Placebo 210=55 130=76 168=108 195=100
Evaluacin del paciente (%)
Ausente o leve Colgeno 21 41 23* 36*
Moderado Colgeno 54 33 46* 25*
Severo o muy severo Colgeno 25 26 31* 39*
Ausente o leve Placebo 16 21 15 19
Moderado Placebo 35 31 23 10
Severo o muy severo Placebo 48 48 62 71
Evaluacin del mdico
Ausente o leve Colgeno 18 41 35 32
Moderado Colgeno 46 33 38 29
Severo o muy severo Colgeno 36 26 27 39
Ausente o leve Placebo 6 21 27 19
Moderado Placebo 42 31 12 13
Severo o muy severo Placebo 52 48 62 68
ESR (mm/hora) Colgeno 39 = 6 5.1 = 2.9 4.9 = 2.8 1.7 = 3.9
ESR (mm/hora) Placebo 34 =5 9.8 = 5.0 7.8 = 5.6 3.2 = 2.8

La estabilidad o mejora de la enfermedad slo se observ en los pacientes sometidos al
tratamiento con CII, mientras que en los pacientes sometidos al placebo se observ una tendencia

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al deterioro de las articulaciones. No se observaron efectos adversos en los parmetros medidos
en el laboratorio, incluyendo el factor reumatoide, o los anticuerpos anti-colgeno II. No hubo
evidencia de sensibilizacin al colgeno, ni tampoco a los anticuerpos anti-colgeno II.
Este ensayo proporciona evidencia que la administracin oral de pequeas cantidades de
CII heterlogo nativo solubilizado es seguro y puede mejorar las manifestaciones clnicas de la
artritis reumtica. Los valores de la lnea de base fueron determinados con el 64% de los pacientes
tratados con CII, que estaban bajo tratamiento de drogas inmunosupresoras (usualmente
metrotexato), y se observ una mejora de la enfermedad. Aunque podra suponerse que el
tratamiento a largo plazo con CII pudiera generar alguna respuesta de tipo alrgico, esto no fue
observado en estudios realizados con modelos animales.
b.- Se estudiaron 94 pacientes de la provincia de Crdoba 81 mujeres y 13 varones con un
promedio de edad de 64 aos [34].

Criterios de inclusin:

Diagnstico de Artrosis de acuerdo a los criterios del Colegio Americano de Reumatologa (12)
Tratamiento con AINEs y corticoesteroides (dosis igual o menor a 10mg/da de prednisona) de
acuerdo a las necesidades del paciente
Consentimiento escrito de los pacientes, quienes fueron informados sobre los eventuales riesgos
y beneficios de este tipo de tratamiento.

Criterios de exclusin:

Todos los pacientes que hubieran padecido o padeciesen: insuficiencia cardaca, disfuncin
heptica (GOT>55mUl/ml), insuficiencia renal (creatinina>2,0mg/dl), enfermedades malignas o
procesos infecciosos agudos o crnicos
Embarazo
Pacientes con daos articulares irreversibles de las articulaciones afectadas.

A los pacientes estudiados se les administr CBII (suministrado por Laboratorio Qumica
Luar) por va oral en una dosis de 500 microgramos /da en ayunas de 30 minutos antes de
cualquier ingesta durante tres meses.

Todos los pacientes fueron examinados al mes 0, 1, 2 y 3 despus del inicio del
tratamiento. La eficacia del tratamiento se evalu de acuerdo a los criterios del Colegio Americano
de Reumatologa. Para cada articulacin afectada, se realiz una evaluacin global de la actividad
de la enfermedad y de la eficacia del tratamiento por parte del paciente y del mdico.

Se evalu en rodilla: dolor, rigidez, crepitacin, osteofitos, calor no palpable, crecimiento
seo, dolor seo y FR; en cadera: dolor, osteofitos femorales o acetabulares, reduccin del espacio
interarticular (sup. axial y/o medial); en manos: dolor, rigidez en minutos, malestar, deformidad,
inflamacin, N de articulaciones afectadas; en columna: dolor y movilidad.

La eritrosedimentacin globular se determin por el mtodo de Westergreen y el Factor
Reumatoideo por aglutinacin de ltex e inmuno-turbidimetra.


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Preparacin y manejo del CBII: El CBII nativo se purifica de trqueas de bovinos jvenes
utilizando un procedimiento esencialmente idntico al descripto por Trentham y col. Las trqueas
lavadas, desgrasadas y picadas fueron tratadas con pepsina en medio cido con el objeto de cortar
los telopptidos (fragmentos peptdicos de los extremos del colgeno que no forman parte de la
caracterstica triple hlice de la protena) y extraerlo del tejido. El CBII solubilizado fue purificado
por ciclos sucesivos de precipitacin con NaCl y solubilizacin en cido actico, siendo finalmente
solubilizado en cido actico al 0,1 M para su posterior utilizacin. La pureza y tipo de colgeno
obtenido fueron analizados por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes (SDSPAGE), transferencia a membranas de nitrocelulosa e inmuno-tincin con
anticuerpos especficos.

Resultados
Se estudiaron 94 pacientes con artrosis los cuales todos cumplieron los tres meses de
tratamiento.

El dolor se evalu con la siguiente escala:


Artrosis de Columna:

50 casos (100%): 44 mujeres (88%) y 6 varones (12%).
Edad Promedio: 64 aos.
Dolor (Valor Inicial promedio): 2,81
Desviacin Estndar: 0,48
Dolor (valor a los 3 meses promedio): 0,77
Desviacin Estndar: 0,96



Luego de 3 meses en tratamiento, en el 50% de los casos el dolor de columna estuvo
ausente y en el 76% de los casos se present como leve o mnimo.

Si se agrupan los valores de nivel de dolor en grupos por edad, podemos observar que en
la franja de pacientes de ms de 65 aos, el promedio de disminucin de dolor es

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aproximadamente de un nivel (1,3); en cambio en la franja de edades desde 35 (para mujeres) y
desde 48 (para hombres) hasta 65 aos, el promedio de disminucin del dolor es de ms de 2
niveles (2,3)

Artrosis de Cadera
27 casos: 24 mujeres y 3 varones.
Edad Promedio: 65 aos.
Dolor (Valor Inicial promedio): 2,77
Desviacin Estndar: 0,41
Dolor (valor a los 3 meses promedio): 0,78
Desviacin Estndar: 0,78
Luego de 3 meses de tratamiento, en el 44% de los casos el dolor de cadera estuvo ausente y en el
78% de los casos se present como leve o mnimo.



Artrosis de Rodilla
37 casos: 34 mujeres y 3 varones.
Edad Promedio: 68 aos.
Dolor (Valor Inicial promedio): 2,76
Desviacin Estndar: 0,43
Dolor (valor a los 3 meses promedio): 0,78
Desviacin Estndar: 0,81
De todos los casos, solamente un paciente no modific el grado de dolor.
Luego de 3 meses en tratamiento, en el 46% de los casos el dolor de rodilla estuvo ausente y en el
76% de los casos se present como leve o mnimo.


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Artrosis de Mano
8 casos: 7 mujeres y 1 varn.
Edad Promedio: 59 aos.
Dolor (Valor Inicial promedio): 2,37
Desviacin Estndar: 0,52
Dolor (valor a los 3 meses promedio): 0,5
Desviacin Estndar: 0,76
Solamente en 2 casos se mantuvo la cantidad de articulaciones afectadas, en todos los dems,
disminuy.


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Se puede concluir que la reduccin del dolor en los pacientes es significativa, considerando los
valores de Desviacin Estndar en cada caso.


Cabe destacar que todos los pacientes disminuyeron la ingesta de AINEs durante el tratamiento.




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CONCLUSIN

En este review, a partir de los ensayos analizados, queda demostrada la eficacia
teraputica de la administracin oral de CII por su efecto inmunomodulador, el cual actuara sobre
el metabolismo del condrocito accionando sobre citoquinas especficas, principalmente el TGF|.
ste induce la inhibicin de la actividad de las enzimas responsables de la digestin de la matriz
extracelular; deteniendo y revirtiendo el proceso de deterioro del cartlago.

Es importante destacar que hay una relacin directa entre la cantidad de colgeno
administrada con la induccin del factor TGF|, y de ste con los efectos supresores de la artritis.
En los experimentos que se han analizado aqu con pacientes las dosis que se utilizaron (0,1mg/da
y 0,5mg/da) estn dentro de un rango en el cual no se observaron efectos adversos. La dosis
contenida de CII en el producto COVADENIL est dentro del rango que demostr ser seguro para
los pacientes.

La tolerancia oral ha demostrado en los ensayos clnicos en curso ser segura, atxica y bien
aceptada por los pacientes ante la eventualidad de un tratamiento crnico en artritis.
A pesar de algunos aspectos conceptuales que an quedan por dilucidar, la tolerancia oral se
presenta como una alternativa promisoria para el tratamiento sencillo (va oral) y de menor
toxicidad que los actualmente utilizados.


.













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