CULTIVOS CELULARES

Los cultivos celulares permiten estudiar las clulas en condiciones de homogeneidad en ausencia de las interferencias de otras clulas constituyentes del tejido (con sus ventajas e inconvenientes)
Mioblastos transformados de ratn sin SBF (C2C12)

Mioblastos transformados de ratn en SBF (C2C12)

Tincin nuclear con DAPI). No expresan MHC

Tincin nuclear con DAPI) Prot. Especifica de msclo (verde, MHC)

Cultivo de tejidos (clulas) a) Esterilidad: Cabina de flujo laminar b) Material y tratamiento de superficies c) Condiciones de cultivo: Estufa de cultivo con CO2

Mantenimiento, subcultivo (pases) y criopreservacin (almacenaje de clulas): Microscopio de contraste de fases invertido, cmara de recuento celular (cuentaglbulos o hemocitmetro), colorante vital.

El pH de los medios de cultivo se controla con el sistema tampn CO3H2 CO3H- + H+ Al aumentar la presin parcial de CO2 aumenta el CO3H2 en la solucin. La acidez se visualiza con rojo fenol que vira al amarillo al bajar el pH y al morado al aumentar

Recuento de clulas en una cmara cuentaglbulos de Neubauer

(rmcc) (rmcc) (rmcc) (e) (e) (e) (e) (e) (e) (e) (e) (rmcc) (e) Aislamiento de clulas de tejidos: Explantes y cultivos primarios (Colagenasa, tripsina, EDTA) rmcc = requerido por muchas clulas en cultivo; e = esencial Eritropoyetina (cel. hematopoyticas) IL-2 (linfocitos T)

Control de los cultivos celulares

Contaminaciones Caracterizacin celular Patrn de isoenzimas DNA fingerprinting Anlisis citogentico

Seleccin de clulas de mezclas: Centrifugacin (tamao densidad) Adhesividad diferencial natural o inducida por Ab MolBiolCell

Los cultivos primarios tienen una vida limitada (unas 50 gener.) y luego envejecen. Ocasionalmente se producen espontneamente lneas inmortalizadas, particularmente en roedores

Senescencia celular replicativa: Acortamiento y desproteccin de los telmeros Transformacin celular espontnea
Las clulas tambin pueden inmortalizarse proporcionndoles la subunidad cataltica de la telomerasa (y anulando puntos de control del ciclo celular introduciendo genes oncognicos)

MolCellBiol

Fluorescente, carga No fluorescente, carga + Fibroblastos Mioblastos

Cel. Precursoras oligodendrocitos

FACS

Las clulas en cultivo pueden sincronizarse en diferentes puntos de su ciclo celular

A. Cultivos primarios Embrionarios o de tejidos adultos B. Lneas celulares a) Inmortalizadas: Expresan el gen de la subunidad cataltica de la telomerasa Se inactivan mecanismos de control de progresin en el ciclo celular (introduccin de genes promotores de tumores procedentes de virus oncognicos o desactivacin espontnea) Clulas de roedores: Telomerasa y desactivacin espontnea de mecanismos de control) b) Transformadas: Procedentes de tumores Clulas transformadas por virus oncognicos Pueden crecer en suspensin y formar capas mltiples y generan tumores cuando se inyectan en animales de experimentacin

MolCellBiol

C. Clulas troncales (clulas madre) -Embrionarias (primeras divisiones del zigoto) o tisulares (regeneracin de los tejidos) Clulas no diferenciadas Pueden proliferar indefinidamente Pueden diferenciarse dando otros tipos celulares (las embrionarias son totipotenciales, las tisulares pueden ser pluripotenciales o totipotenciales) Clulas troncales neurales --------- clulas hematopoyticas o musculoesquelticas Clulas de la mdula sea --------- clulas hematopoyticas, neumocitos o hepatocitos

Inmortalizacin de linfocitos B productores de un determinado anticuerpo (hibridomas)

HGPRT-, TK-

LOS CULTIVOS CELULARES COMO MODELO EXPERIMENTAL 1. Complejidad de los tejidos 2. Presencia de contaminantes inadvertidos (micoplasmas y virus) 3. Condiciones externas en relacin con las condiciones in vivo 4. Manipulacin gentica Introduccin de genes exgenos (transfeccin): --Microinyeccin --Microprecipitados DNA-fosfato clcico --Lipofeccin, --Electroporacin --Policationes (polietileniminas, PEI) Anulacin gnica 5. Prdida de mecanismos de regulacin (ausencia de factores, interrelacin con otras clulas o ME)
Hipoxantina (HGPRT, 6-S-G) Aminopterina (inb. sint. nucleot.) Timidina (5-BrdU) MolBiolCell

Linfocitos transformados (mieloma)

Mtodos de transfeccin

MolCellBiol

Tcnicas de observacin de la clula y sus componentes

Inmuno(histo)citoqumica, hibridacin in situ Tcnicas de fluorescencia y de observacin in vivo Tcnicas de microscopa electrnica Microscopa de campo prximo: AFM Microscopa amplificada por vdeo y ensayos de motilidad in vitro
INMUNOHISTOQUIMICA 1. 2. 3. 4. Anticuerpo 1 (policlonal de conejo) anti-Ig de conejo (p.ej. en cabra) unido a HRP (peroxidasa de rbano) Diaminobencidina (sustrato soluble de HRP que produce un precipitado marrn) Amplificacin de la seal: anticuerpo 1 biotinilado y complejos (estrept)avidinabiotina (ABC) en los que las molculas de biotina estn unidas a HRP
Cortes de hgado de rata

HIBRIDACIN in situ (ISH): Anlisis de la expresin gnica en tejidos intactos por deteccin de mRNAs

mRNA implicado en desarrollo de somitas en un embrin

MolCellBiol FISH (mltiple fluorescencia, pintado de cromosomas) MolBiolCell, Alberts y col. 4 Ed, Garland Science

X
El dsRNA inhibe la expresin del mRNA cuya secuencia contiene

MolBiolCell

Espejo dicroico

Inmunofluorescencia (indirecta) Ligandos fluorescentes (faloidina)

MolBiolCell

MolCellBiol

MolCellBiol

MolCellBiol

MolBiolCell, Alberts y col. 4 Ed, Garland Science

Microscopa de fluorescencia

Recuperacin de fuorescencia tras fotoblanqueo

Reactivos fluorescentes enjaulados (fotoactivacin) Dinmica de tubulina en el huso acromtico Rojo: Tub-rodamina Azul: Fluorocromo que se une a DNA (DAPI) Amarillo: Tub-fluorescena (enjaulada) Los genes que codifican GFP y otras protenas fluorescentes pueden mutarse para que produzcan variantes proteicas, generalmente con un nico aa diferente, que apenas tienen fluorescencia en condiciones normales de excitacin pero se puede inducir una fluorescencia intensa activndola con un pulso intenso de luz a una diferente (estudio del comportamiento in vivo de protenas expresadas como protenas de fusin) MolBiolCell

Prdida de fuorescencia en fotoblanqueo

Aequorea victoria

(a-c) Localizacin del rgano bioluminiscente de la medusa Aequorea victoria en el borde de la sombrilla; (d) La protena verde fluorescente , GFP, est formada por 238 aa , 11 lminas que se organizan en forma de tarro en cuyo interior los aminocidos 65, 66 y 67 (que se modifican autocatalticamente) generan la bioluminiscencia verde cuando la protena se excita con luz azul o UV; (e, f) Protenas bioluminiscentes de arrecifes de coral, de izquierda a derecha , AmCyan1, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, AsRed2, and HcRed1 (BD Biosciences) observadas en el tubo de ensayo o tras co-expresin con protenas celulares proporcionando bioluminiscencia a las clulas. (g) Espectros de excitacin y emisin de estas protenas fluorescentes de corales
e

Identificacin de protenas in vivo con GFP y otras protenas fluorescentes

Usos: Localizacin de clulas (que expresan el trans-gen de GFP u otra protena fluorescente) en un animal vivo co-expresin con otro gen para producir la protena quimrica fluorescente Tricomas de Arabidopsis observados mediante el microscopio electrnico de barrido (A) o tras transformar con un plsmido que contiene los genes de Talina-GFP (B)
MolCellBiol, Lodish y col.

Etiquetado de protenas con GFP

Gen de la protena que interesa

Se inserta el DNA que codifica el eptopo marcador, p. ej. de GFP

Vectores de localizacin subcelular Living colors (BD Biosciences) prara localizar in vivo orgnulos o estructuras subcelulares

Se introduce en la clula, p. ej. por transfeccin

Protena con el eptopo marcador, p. ej. GFP

Extraccin y purificacin de la protena con Ab contra el eptopo marcador

MolBiolCell

Fluorescencia verde, o localizacin con Ab contra el eptopo marcador GFP (para inmunohistoqumica)

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer): Estudio de interacciones moleculares en la clula usando variantes de protenas fluorescentes.El espectro de emisin de uno de los fluorocromos debe solapar con el de absorcin del segundo y encontrarse suficientemente prximo a l (1-10 nm). La luz absorbida por el primero se transmitir al segundo. Se excita el primer fluorocromo y se mide la emisin caracterstica del segundo

MolCellBiol

Enfoque de la fluorescencia Microsc. Confocal,

analgica (de barrido) y computacional (microscopio de desconvolucin, funcin de difusin puntual) MolBiolCell
>510 nm

laser azul 450-490 nm Fluorescena (verde) 520-560 nm

Bioqumica, Mathews y col.

Lmite de resolucin del ojo 0.3-0.6 mm. Microscopio ptico unos 200 nm (2.000 x). Microscopio electrnico 0.1 nm (cerca de 2.000 x adicional, 2-4 x 106 veces menor que el del ojo)
0.61. r = ---------n.sen r = lmite de resolucin (el lmite de deteccin puede ser menor, p.ej. en fluorescencia ) = longitud de onda (luz visible de menor , 450 nm; haz de electrones 0.005 nm) n = ndice de refraccin (aceite de inmersin, 1,33-1,5) = apertura angular (mxima 70 grados, sen 70 = 0.94; n.sen = apertura numrica )

En el SEM los electrones se enfocan mediante las lentes condensadora y objetivo sobre una muestra recubierta por metal. Las espirales de barrido desplazan el haz de electrones sobre la muestra y los electrones difractados se recolectan en un tubo fotomultiplicador de deteccin. El aire difracta los electrones por lo que en ambas tcnicas se requiere vaco elevado

Bioqumica, Mathews y col. 3 Ed, Addison Wesley

O cmara CCD

Microscopio electrnico de barrido

Bioqumica, Mathews y col. 3 Ed, Addison Wesley

Bioqumica, Mathews y col. 3 Ed, Addison Wesley

Bioqumica, Mathews y col. 3 Ed, Addison Wesley

Inmunomicroscopa electrnica y autorradiografa electrnica (pulso y caza)

Sntesis de insulina y acumulacin en vesculas de secrecin tras un pulso con leucina tritiada y caza con concentraciones elevadas de aminocido sin marcar (granos de plata)

MolBiolCell

Generacin de contrastes:
Clulas teidas: Reduccin de la amplitud de la luz de determinadas longitudes de onda Clulas sin teir: Diferencias en el ndice de refraccin y espesor. Los detalles estructurales pueden visualizarse utilizando cambios en la fase de la luz Observacin de clulas sin teir: A) Campo claro B) Contraste de fases: Claro-oscuros dependientes del ndice de refraccin C) Contrate de interferencia diferencial (DIC), ptica de Nomarski: Interferencias de luz polarizada (seccin ptica fina) D) Campo oscuro Cinematografa de tiempo pulsado
Procesamiento de imgenes digitalizadas con cmaras CCD (charge-coupled device) para extraer informacin latente. Resuelven las limitaciones del ojo humano que: 1) No puede ver con luz muy tenue y 2) No percibe diferencias pequeas de intensidad de luz en un fondo de luz brillante. El procesamiento permite acercarse a los lmites de resolucin y amplificar el contraste
MolBiolCell

MolCellBiol

C, seudorelieve

B, claro-oscuros

Ensayos de movilidad in vitro

Amplificacin por video del contraste de interferencia diferencial Pinzas pticas. Un rayo laser intenso enfocado sobre un objeto con un ndice de refraccin mayor que el del entorno, puede detener el objeto debido al cambio de direccin de los fotones al refractarse la luz. Las pinzas pticas tienen aplicacin en la caracterizacin de protenas motoras. Para ello se usan lseres infrarrojo. Cuando la de la luz es menor, la radiacin laser puede absorberse por el material biolgico y pude matar clulas, cortar o quemar material biolgico (bisturs pticos usados en microciruga)

Bioqumica, Mathews y col. , Addison Wesley

Microscopa de campo prximo: Microscopio de

fuerzas ( o de fuerza atmica), AFM. Punta: silicio o nitruro de silicio (fabricada con nanotecnologa) Interaccin sonda-muestra: Fuerza mecnica, corriente elctrica, radiacin electromagntica, flujo de calor Modos: a) contacto (de 1-100 nNewton) . La punta barre la superficie manteniendo una fuerza de interaccin con ella constante (recorre el relieve) b) Oscilante (frecuencia y/o amplitud de oscilacin) Puede medir la fuerza que percibe la punta al desplazarse sobre la superficie. Puede usarse para atrapar y desplazar molculas individuales actuando a modo de pinzas pticas moleculares. Usos: 1. Obtencin de imgenes superficiales a escala molecular 2. Determinar propiedades mecnicas de molculas proteicas individuales, tales como la energtica de plegamiento de dominios proteicos deformando (desplegando) la protena en cuestin