PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIO INMUNOHISTOQUIMICO

Prof. T.M. Laura Ochoa M.

Objetivos.
Conservar la inmunoreactividad de clulas y tejidos. Conservar la estructura secundaria y terciaria de las protenas. Conservar la localizacin de los antgenos. Preservar la morfologa. No provocar interferencia con los inmunoreactivos.

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La unin del antgeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) se deben a la formacin de mltiples enlaces no covalentes (enlaces H, interacciones electrostticas, de Van der Waals e hidrfobas) Se establecen mltiples interacciones

Determinantes antignicos.
Corresponde al rea especfica dentro del antgenos que se une al paratopo. Pueden ser LINEALES en cuyo caso su formacin esta dada por una secuencia aminoacdica o CONFORMACIONALES dada por la estructura secundaria o terciaria de la protena.

DETERMINANTES ANTIGNICOS

Tipos de Muestras para estudio IHQ.

Clulas de cultivo. Clulas en suspensin. Frotis citolgicos Frotis sanguneos. Cortes de criostato. Cortes en parafina Cortes de ultramicrtomo.
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Procesamiento de los lquidos.

Procesar inmediatamente Centrifugar durante 5 minutos a 2.500 rpm Con el pellet confeccionar varios frotis ( 35), secar parcialmente Fijadores: etanol 95, acetona al 80% en PBS mas formalina 1%, Cytospray. Lavar en PBS ICQ
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CITOLOGAS

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Frotis previamente teidos.

Marcar con lpiz diamante al dorso del portaobjeto las zonas sospechosas de mejor celularidad. Despegar el cubreobjeto. Retirar todo el medio de montaje en xilol Decolorar con alcohol cido Hidratar hasta el agua destilada ICQ
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Cortes por congelacin.

Transporte al laboratorio Suero fisiolgico (transporte inmediato) Hielo / Medio de transporte (horas) Congelado en tanque de nitrgeno lquido (das) Mejor preservacin antignicas que cortes en parafina. Morfologa deficiente.
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Cortes por congelacin.

Congelacin: debe ser realizada rpidamente para evitar la formacin de cristales de hielo.
Fijacin: Cualquier fijador. Acetona: buena conservacin de antgenos de membrana.
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Cortes en Criostato.
CORTE De 6 10 micrones o lo ms delgado que sea posible Montaje sobre portaobjetos pretratados. Evitar melladuras e irregularidades. Fijar en acetona fra por 15 minutos y secar. IHQ guardar cortes congelados a -70C

Cortes por congelacin.

VENTAJAS Excelente conservacin de reactividad antignica. DESVENTAJAS Morfologa deficiente Difcil almacenamiento de tejidos y de inmunotinciones Dificultades con enzimas endgenas
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Procesamiento de cortes en parafina para IHQ.

ETAPAS A CONSIDERAR

FIJACIN IMPREGNACIN / INCLUSIN CORTE Y MONTAJE

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Objetivos de la fijacin.
Detener los procesos de autlisis. Especialmente la accin de proteasas y nucleasas Conservar la cito-histoarquitectura de la muestra similar a su estado in vivo. Preparar al tejido para los procedimientos posteriores Anti-microbiano
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Obtencin de la muestra.
Muestras frescas deben ser cortadas en un tamao aproximado de 2cm2 x 4 mm de grosor. Fijadas a la brevedad

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Fijador ideal para IHQ.

No induzca cambios conformacionales en el antgeno (epitopo) No enmascare determinantes antignicos No provoque difusin, extraccin o desplazamiento de antgenos. Permita la penetracin de los inmunoreactivos Buena morfologa Baja toxicidad, estabilidad en su almacenamiento, barato.
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Fijacin con Formaldehido.

Ms popular de los fijadores Es un gas y su presentacin comercial es en solucin acuosa 37 - 40% La fijacin involucra una interaccin con protenas, especficamente con aminocidos bsicos, con formacin de puentes metilnicos. En algunos casos se produce un fenmeno de enmascaramiento progresivo de epitopos. Frecuentemente requiere el uso tcnicas de recuperacin de inmunoreactividad.

FORMALDEHDO

HIDRATO DE METILENO

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FORMALDEHDO

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Especies presentes en el Formaldehido.

Rompimiento de polmeros a unidades de hidrato de metileno. Proceso dura un par de das si se prepara en agua. Y es instantneo cuando se prepara en buffer a pH fisiolgico.

Componentes de la solucin de formaldehido.

METANOL 10% : Disminuye la velocidad de la polimerizacin del hidrato de metileno. Promueve la precipitacin del para formaldehdo. En la reaccin entre dos molculas de formaldehdo, una se reduce a metanol y la otra se oxida a cido frmico.
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FORMALINA al 4%
COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO EN SOLUCIN (FORMALINA) Hidrato de metileno Compuesto activo
Metanol 1% cido frmico Paraformaldehdo

Compuestos no deseados

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FORMALINA
Equilibrio de la solucin
Tiempo/ pH

Compuesto activo

Compuestos no deseados

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FIJACIN CON FORMALDEHIDO

Penetracin Hidrato de Metileno
Reaccin con grupos NH2

Formacin de Puentes metilnicos

Reaccin entre NH2 metilados

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PROTENA NATIVA EPITOPOS

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PROTEINA FIJADA CON FORMALDEHIDO

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Fijacin con Formaldehido.

Solucin de fijacin: Se debe utilizar en sus condiciones mas estables Neutralizada con carbonato de calcio Tamponada en PBS pH 7,2 7,4 Tiempo de fijacin Desde que la muestra es extrada hasta que es fijada. Muestra en el fijador. Ojo con los congelamientos previos.
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Condiciones de fijacin con Formaldehido

Temperatura / Tiempo de fijacin: T. A. 6 24 hrs 4 C 24 72 hrs Tamao de la muestra: 10 x 10 x 4 mm Volumen de fijador: 20 30 veces el volumen de la muestra

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Fijacin con Formaldehido.

EN MUESTRAS FIJADAS EN FORMALDEHIDO EN CONDICIONES PTIMAS SE PUEDEN OBTENER EXCELENTES RESULTADOS DE INMUNOTINCIN PARA LA MAYORA DE LOS ANTGENOS
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Fijacin con Ac. Pcrico.

Fijador de tipo coagulante, poco penetrante. Se emplea en mezclas fijadoras. La ms usada es la mezcla de Bouin. Provee buena morfologa. Su uso se recomienda para estudio de inmunoglobulinas, filamentos intermedio y hormonas.
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Fijacin con Bicloruro de Mercurio.

Poco penetrante. Se emplea en mezclas fijadoras: ZENKER; FORMOL SUBLIMADO; B5, etc. Aditivo y coagulante Excelente morfologa B5 recomendado especialmente para la fijacin de ganglios linfticos. Buena conservacin de antgenos intracitoplasmtico, pero no de membrana. Provee al tejido buena permeabilidad para los inmunoreactivos.
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Fijacin con etanol.

Poco penetrante Fijador coagulante Buena penetracin de inmunoreactivos Puede inducir a cambios conformacionales Endurece los tejidos Morfologa regular
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FIJACIN CON ACETONA Poco penetrante Fijador coagulante Principalmente indicado para frotis sanguneos y cortes en congelacin.

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Deshidratacin, aclaramiento e impregnacin. Agente aclarante en

buen estado (sin agua) Temperatura de las parafinas de impregnacin entre 56 - 62 C. Tiempo de impregnacin entre 30 45 minutos en cada parafina.
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PROCESADOR DE TEJIDOS AL VACIO

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Corte y Montaje.
Grosor recomendado:4 5 Montaje en portaobjetos o cubreobjetos Evitar cortes con melladuras, irregularidades, gruesos o desgarrados Evitar tocar el agua del bao con las manos con crema
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Corte y Montaje
Medios adhesivos:
ALBUMINA DE MAYER COLA FRA 1% POLI-L-LISINA ACUOSA 3,AMINOPROPYLTRIETH OXI-SYLANE.
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Corte y Montaje.
Realizar los cortes la misma semana que se realizar tcnica IHQ. Mantener guardados en oscuridad y en refrigerador. Libres del polvo. Mantener bloques de parafina almacenados en lugares frescos. La limpieza de los portaobjetos previa a la silanizacin, deber ser sin detergentes.
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Montaje.
Medios hidrfobos. Medios hidrfilos.

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Desparafinacin e Hidratacin.
Asegurar remover total de la parafina, con agentes de desparafinacin de buena calidad. Cambiar con regularidad los reactivos Hidratacin gradual.
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LA ELECCIN DEL MTODO DE PREPARACIN DE LA MUESTRA DEPENDE DEL PROPSITO DEL ESTUDIO INMUNOHISTOQUMICO.
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