MTODOS DE SECUENCIACIN DE ADN

BIOINGENIERA

CONTENIDO
OBJETIVO ............................................................................................................................................. 2 INTRODUCCIN ................................................................................................................................... 2 SECUENCIACIN DE CIDOS NUCLEICOS ............................................................................................ 2 MTODO DE DEGRADACIN QUMICA ............................................................................................... 2 Desventajas del mtodo de Maxam-Gilbert ................................................................................... 4 MTODO ENZIMTICO ........................................................................................................................ 4 Ventajas del mtodo enzimtico .................................................................................................... 6 SECUENCIACIN AUTOMTICA .......................................................................................................... 6 CONCLUSIN ....................................................................................................................................... 8 BIBLIOGRAFA ...................................................................................................................................... 8

OBJETIVO Conocer cmo se llevan a cabo los distintos mtodos de secuenciacin de cidos nucleicos, quien los invent y en que se basa cada uno de ellos. INTRODUCCIN Inicialmente, se pensaba que la secuenciacin de los cidos nucleicos era mucho ms difcil que la de las protenas, y muy poco progreso se hizo hasta 1960. Esto se debi, en parte, a la falta de substratos puros del tamao adecuado, con los cuales desarrollar los mtodos y en parte, a la composicin de los cidos nucleicos. Se esperaba que la interpretacin de los resultados de la secuenciacin de los cidos nucleicos (cuatro monmeros) fuera ms difcil que el de las protenas (20 aminocidos), y se tendran que aislar productos de degradacin ms grandes para poder traslaparlos y deducir sus secuencias. Por otro lado, el hecho de tener cuatro componentes solamente, se pensaba, hara ms fciles los anlisis finales. Al inicio, la dificultad predominante fue la interpretacin de los resultados, pero a medida que las tcnicas se fueron mejorando y que se fueron estudiando molculas ms largas, la cuestin del anlisis empez a ser ms importante. Hoy, la secuenciacin de cidos nucleicos es ms rpida y simple que la secuenciacin de protenas. SECUENCIACIN DE CIDOS NUCLEICOS La estrategia bsica de la secuenciacin de cidos nucleicos es idntica a la que se utiliza en la secuenciacin de protenas. sta involucra: 1. La degradacin especfica y el fraccionamiento de los polinucletidos de inters a fragmentos suficientemente pequeos para ser secuenciados. 2. La secuenciacin de los fragmentos pequeos. 3. El ordenamiento de los fragmentos a travs de la repeticin de los pasos anteriores, usando un procedimiento de degradacin que produce una serie de fragmentos de polinucletidos que traslapan el punto de corte en la primera serie. MTODO DE DEGRADACIN QUMICA El mtodo de secuenciacin qumica fue propuesto por Maxam y Gilbert, fue publicado en febrero de 1977, 10 meses antes de que Sanger publicara el mtodo de secuenciacin enzimtica. En un artculo de la revista PNAS el Maxam y Gilbert describieron el procedimiento de la siguiente manera: Desarrollamos una nueva tcnica para secuenciar una molcula de ADN marcado radioactivamente en un extremo, cortndolo con agentes qumicos.

En este mtodo, un fragmento de ADN de cadena doble o sencilla se marca en los extremos 5 o 3 de una o ambas hebras con 32P. Despus, la muestra de ADN se divide en cuatro alcuotas y se fragmenta en cuatro reacciones qumicas distintas. Posteriormente, los fragmentos de ADN generados pueden ser separados por electroforesis en cuatro carriles distintos con base en su tamao. Conociendo el nucletido en el que se realizaron los cortes, se puede inferir la secuencia de la molcula original. Las reacciones qumicas que se utilizan para fragmentar la molcula de ADN son las siguientes: 1. Corte de las purinas. Las purinas adenina y guanina se metilan con dimetil sulfato (DMS). Despus, la reaccin es tratada en condiciones alcalinas; la molcula de ADN se fragmenta en las purinas metiladas. Como resultado, se obtiene una serie de bandas oscuras que corresponden a las guaninas (las cuales se metilan 5 veces ms rpido), y bandas claras corresponden a las adeninas. Para interpretar fcilmente el patrn de bandas generadas, se puede comparar contra un tratamiento que favorezca el corte de las adeninas. 2. Corte de adeninas. Esta reaccin es una variacin de la anterior. Las purinas metiladas se tratan inicialmente con un cido diluido. Esto favorece el corte de las adeninas metiladas. Despus de un tratamiento alcalino las guaninas tambin son cortadas. Este tratamiento genera una serie de bandas oscuras y claras que tambin corresponden a las adeninas, y las guaninas, respectivamente. 3. Corte de pirimidinas. Esta reaccin utiliza el reactivo hidracina, que corta las bases citosina y timina. Posteriormente, se trata con piperidina para completar la reaccin. 4. Corte de citosina. La presencia de NaCl 2M inhibe la reaccin de hidracina con tiamina, y el tratamiento posterior con piperidina, produce solamente fragmentos que terminan en citosina. En la siguiente imagen se muestran enumerados en cada uno de los carriles del gel, los distintos tipos de cortes antes mencionados.

Fig. 1 Cortes por el mtodo de Maxam y Gilbert.

Desventajas del mtodo de Maxam-Gilbert La baja resolucin obtenida cuando se report la tcnica no se debi a un factor inherente al mtodo de Maxam-Gilbert, si no a una limitante de los geles de acrilamida. En un inicio, se consideraba un logro poder diferenciar el tamao de 250 fragmentos y determinar la secuencia de ese tamao. El anlisis de una secuencia en geles de acrilamida era complicado, ya que no se poda separar los fragmentos grandes. Otro problema que comnmente afecta la resolucin de las bandas obtenidas en el gel es el ensanchamiento de bandas cuyas secuencias favorecen la formacin de estructuras secundarias. Para mejorar la resolucin del gel se ha reportado que el uso de geles de acrilamida muy delgados, en conjunto con un voltaje alto de corrimiento, produce bandas ms delgadas y mejor separadas. MTODO ENZIMTICO En Diciembre de 1977 se public el trabajo de Sanger, Nicklen y Coulson en el que propusieron un nuevo mtodo para determinar la secuencia de bases en una molcula de ADN. Sanger y Coulson haban ya publicado dos aos antes, un mtodo de secuenciacin (mtodo ms-menos) a partir del cual haban logrado obtener dos secuencias de 70 bases del bacterifago X174. La dificultad en la interpretacin de los resultados y algunos

errores que podan ocurrir en la secuencia hicieron que Sanger y sus colaboradores siguieran trabajando para mejorar los mtodos de secuenciacin de cidos nucleicos. El mtodo de Sanger se basa en el uso de la ADN polimerasa para sintetizar cadenas de ADN con una terminacin especfica. Con este mtodo se generan fragmentos de ADN de todos los tamaos posibles que se puedan distinguir entre s, por el tipo de marcaje que llevan o por la incorporacin de un terminador especfico. Las enzimas del tipo de la ADN polimerasa requieren de un templado de ADN de cadena sencilla, y realizan la sntesis de la hebra complementaria extendindola a partir de un iniciador en direccin 5 a 3. Entre los componentes de la reaccin se incluyen nucletidos que no tienen un grupo hidroxilo en su extremo 3 (ddNTP), para poder obtener una terminacin especifica en las cadenas. Una vez que el ddNTP se incorpora como el residuo terminal, evita que la cadena de ADN sintetizada contine extendindose. La incorporacin de los ddNTPs es al azar, de tal forma que se obtienen fragmentos de todos los tamaos posibles que terminan en un residuo especfico. En este mtodo la estrategia es hacer cuatro reacciones diferentes de sntesis de ADN, utilizando un ddNTP distinto en cada tubo. Con la mezcla del nucletido normal (dNTP) y su terminador (ddNTP), se pueden generar fragmentos complementarios de diferentes tamaos que terminan en el mismo nucletido.

Fig. 2 Reacciones diferentes de sntesis de ADN.

Despus, estos fragmentos se pueden separar en un gel de electroforesis con cuatro carriles distintos, para determinar la secuencia del templado.

Fig. 3 Separacin por electroforesis y determinacin de la secuencia.

Ventajas del mtodo enzimtico Las reacciones de secuenciacin del mtodo enzimtico se pueden realizar en unas horas, en cambio las del mtodo de Maxam-Gilbert tardan al menos un da. Las reacciones del mtodo de Sanger son ms puras, con menos contaminantes que puedan afectar la resolucin del gel. SECUENCIACIN AUTOMTICA Hoy en da los protocolos de secuenciacin estn controlados por secuenciadores automticos, que proporcionan gran rapidez y comodidad, incrementando la eficiencia de la secuenciacin. La mayor parte de los datos de secuenciacin se han obtenido a partir de los secuenciadores automticos.

El proceso se realiza mediante la secuenciacin enzimtica, es decir con la sntesis de cadena de ADN. Una ADN polimerasa del bacterifago T7, que se ha modificado qumicamente para eliminar parte de actividad exonuclesica en sentido 3 -5, sintetiza la cadena a partir de un oligonucletido, de manera que va incorporando los nucletidos complementarios del fragmento a secuenciar. Los oligonucletidos utilizados se separan en cuatro fracciones y en cada una de ellas los cebadores estn marcados en su extremo 5 con un fluorcromo de un color diferente. Posteriormente, a cada una de estas fracciones se le aade un nico ddNTP y se realiza una incubacin. Todos aquellos fragmentos que hayan incorporado el mismo ddNTP estarn marcados por un color idntico. A continuacin, las cuatro reacciones se mezclan y se someten a una electroforesis en un gel de piliacrilamida. Cada banda observada corresponde a un conjunto de fragmentos del mismo tamao, y est marcada con el fluorcromo correspondiente al cebador que se ha utilizado en la sntesis de los fragmentos. La electroforesis se realiza de forma continua en un solo carril, y el color de la banda se determina cuando el fluorcromo es excitado por un rayo lser situado en la base del gel, produciendo una seal que la recibe un fotomultiplicador y se transmite a un ordenador que representa un cromatograma.

Fig. 4 Esquema de la secuenciacin por el mtodo automtico de electroforesis capilar con la secuencia obtenida.

CONCLUSIN El anlisis ms detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucletidos. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes mtodos para obtener la secuencia de nucletidos del ADN, sin embargo, actualmente los mtodos ms utilizados son el de secuenciacin automtica y el mtodo enzimtico ya que las aportaciones de Maxam y Gilbert con el mtodo qumico sirvieron como pauta para que las tcnicas posteriores a desarrollar se mejoraran de tal forma que estudiar el genoma se volviera menos complejo.

BIBLIOGRAFA Necochea, R. y Canul, J.C. (2004). Secuenciacin de cidos nucleicos. Instituto de biotecnologa-UNAM. Cuernavaca, Mor. Consultado en: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf Fecha de consulta: 15/02/2014. Lleonart, M.E., Snchez, R., Martn- Duque, P. y Ramn, S. (1997). Tcnicas de hibridacin, clonacin y secuenciacin de cidos nucleicos en el diagnostico anatomopatolgico. Revista Espaola de Patologa, Vol. 30, N 3. Consultado en: http://www.conganat.org/seap/revista/v30-n3/13.pdf Fecha de consulta: 15/02/2014. Grief, G. (2012). Mtodos de secuenciacin de cidos nucleicos. Instituto Pasteur Montevideo. Consultado en: http://www.chlaep.org.uy/descargas/curso_tb_mico_bacterias/metodos_de_secu enciacion_de_acidos_nucleicos.pdf Fecha de consulta: 15/02/2014. Gonzlez, M.I. y Rodriguez, A.M. (2011). Metodos experimentales para el estudio de los genomas. Universidad de A. Corua. Consultado en: http://ruc.udc.es/dspace/bitstream/2183/9867/1/CC_30_art_2.pdf Fecha de consulta: 15/02/2014.