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Electroforesis
La electroforesis es una tcnica que se basa en la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico.
Tipos:
De frente mvil (en solucin)
En papel
Slice
Agarosa (DNA)
La movilidad del DNA depende de: Factores extrnsecos a la partcula [agarosa] o [poliacrilamida] Voltaje Buffer
Tiempo
Temperatura pH
Relacin carga/masa
Conformacin
Tamao
Factores extrnsecos
% agarosa
Rango separacin
poliacrilamida
0,5 0,8 1 1,2 1,5
1-5 pb a 500 pb
700 pb a 25 Kpb 500 pb a 15 Kpb 250 pb a 12 kpb 150 pb a 6 kpb 80 pb a 4 kpb
Poliacrilamida
Alta resolucin NO para fragmentos grandes Difcil de armar
Agarosa
Baja resolucin (poros grandes) SI fragmentos grandes Fcil de armar Si el % es muy bajo el gel es frgil
Voltaje aplicado
V tpico = 10 V / cm de gel
y geles de 10 15 cm
100 V 130 V
Mejor resolucin
OJO,
difusin
Buffer de corrida
Tiempo
Depende del tamao de los fragmentos a separar A tiempo resolucin OJO! (Que no se caiga la muestra del gel)
Temperatura
Temperatura y la
pH
Evitar modificaciones en la carga y conformacin del DNA y las protenas
Factores intrnsecos
Lineal
Densidad a la muestra
Loading Buffer
Colorantes de corrida (ubicar frente de corrida)
Azul de bromofenol (corre como DNA 300 pb)
Revelado
Autorradiografa
BrEt
(tumorignico)
- Se intercala cada 2,5 pb - Fluoresce naranja a la luz UV - Detecta hasta 10ng de DNA ds - En la agarosa o post-corrida Genera SC(+). Afecta movilidad CCC. Retrasa 15% lineal Visualizacin durante corrida - Fluoresce amarillo - Poca afinidad gel (bajo background) - Detecta hasta 20 pg DNA ds - Seguro (no tumorignico) - Caro
Agentes intercalantes
SyBR Gold
cualitativos
sintticos
Sintticos comerciales
48,5 kb 3,53 kb
100% 7,28%
Intensidad similar
100% 7,28%
500 ng 36,4 ng
Alcalino (c/NaOH)
Para cDNA
Para RNA
- Agregar al gel membrana de DEAE-celulosa - Colocar trozo de gel en bolsa de dilisis - Kits de slica gel - Usar low melting point agarosa (funde entre 25-35 grados). Extraccin con fenol. - Corte en gel durante la corrida, seguir con UV y levantar cuando DNA cae en el pocillo
Tipos de Electroforesis
Electroforesis
De zona o en gel
17
Soportes
(Electroforesis de zona o de gel)
18
Soportes
19
20
Carga neta y pH
21
Punto Isoelctrico
22
Isoelectroenfoqu e
23
MOLCULAS
Tamao-Forma (Protenas)
24
MOLCULAS SDS-PAGE
25
SDS-PAGE
26
Electroforesis Bidireccional
27
Azul de Coomasie
28
Electroforesis de ADN
29
Tamao vs Movilidad
30
Fuente de poder
31
32
33
Corrida Electroforesis
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36
37
Revelado
38
Transiluminador UV
39
40
Registro Fotogrfico
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43
44
Revelado
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46
47