Replicacin del ADN

La divisin celular requiere de la duplicacin del material gentico

mitosis meiosis

mitosis

Mecanismo general

La misma estructura del ADN sugiri un mecanismo de replicacin de la informacin

Cada hebra sirve como molde para replicar la complementaria

Propiedades

Semiconservativa: cada nueva molcula esta formada por una hebra parental y una recin sintetizada
Experimentos de Meselson y Stahl

Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de inicio denominado origen de replicacin A cada lado de la burbuja de replicacin se forma una horquilla de replicacin

Direccin de la sntesis: 5

Semidiscontinua: Una de las hebras no puede ser sintetizada de continuo

Consecuencia de la direccionalidad

Replicacin en procariotas

Mecanismo

Inicio
Reconocimiento de orgenes de replicacin. Separacin de hebras. Posicionamiento de maquinaria transcripcional.

Elongacin
Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicacin. Replicacin semiconservativa, semidiscontinua, coordinada.

Terminacin
Reconocimiento de seales de terminacin. Desensamble de replisomas.

ADN polimerasas:
Pol I Pol II Pol III (replicasa) Pol IV y V

Necesitan 3 OH libre

Maquinaria enzimtica
ADN polimerasas: Sntesis de ADN Primasas: Generacin 3OH libres Ligasas: Unin los fragmentos de Okazaki Helicasas: Separacin de hebras Topoisomerasas: Mantenimiento del grado de superenrollamiento SSBs: Mantenimiento de simples hebras

Inicio

Reconocimiento del origen y apertura de las hebras

Elongacin

Primasa:
Sintetiza fragmentos de ARN (cebadores) que provean los 3 OH libres Puede comenzar sin necesidad de cebador

Replisoma

Terminacin

Replicacin en eucariotas

Los mecanismos son similares Ms de un origen de replicacin por cromosoma Es ms complejo

Proteins Functions

RPA PCNA RFC Pol /primase Pol / FENI DNA2 DNA ligase I Mcm2-7

Single-stranded DNA binding; stimulates DNA polymerases; facilitates helicase loading Stimulates DNA polymerases and RFC ATPase DNA-dependent ATPase; primer-template DNA binding; stimulates DNA polymerases; PCNA loading RNA-DNA primer synthesis DNA polymerase; 3'-5' exonuclease Nuclease for removal of DNA/RNA primers Nuclease for removal of DNA/RNA primers Ligation of DNA DNA helicase; primosome assembly, licensing factor

ADN polimerasas

Ocurre durante la fase S Una nica vez por ciclo celular

Horquilla eucariota

Telmeros
Son secuencias repetidas que se encuentran en los extremos de los cromosomas lineales Entre otras funciones resuelven los problemas de replicar este tipo de cromosomas

Telomerasa
Enzima capaz de resolver el problema de acortamiento de los extremos Ribonucleoprotena

Mantenimiento de la informacin hereditaria

Errores durante la replicacin:

Las ADN polimerasas no son 100% fieles Los errores son reparados en un alto porcentaje de las veces Cuando los errores escapan los mecanismos de reparacin ocurren cambios en la secuencia del ADN: Mutaciones

Las mutaciones tambin pueden ocurrir por fenmenos post replicacin (mutgenos fsicos, qumicos, etc.)

Mecanismos de reparacin

Las propias replicasas son capaces de reparar sus errores durante la elongacin:
actividad correctora de prueba (proofreading) Implica una actividad exonucleasa 3 5

Mecanismos de reparacin

Replicacin de ADN in-vitro: PCR

Permite la amplificacin de un fragmento de ADN de inters Algunas aplicaciones:

Clonado acelular de molculas de ADN Deteccin de secuencias sin purificacin previa Anlisis de expresin gnica Secuenciacin de cidos nucleicos Amplificacin de ADN para su posterior clonacin celular Aplicaciones en medicina:
Diagnostico de enfermedades hereditarias/infecciosas Diagnstico parental (amniocentesis, vellosidades corinicas) Tipado de tejidos para transplantes Deteccin de clulas tumorales Estudios de asociacin genotipo-fenotipo

Tcnicas forenses: huellas genticas (Identificacin de polimorfismos)

Identificacin individual Tests de paternidad

Filogenia Anlisis de gentica poblacional

Reaccin de replicacin in-vitro:

Molde ADN polimerasa: Taq polimerasa (termoestable) Cebadores:

3 OH libre Definen la regin a amplificar

dNTPs (A, C, G, T) Condiciones para el funcionamiento de la enzima:

Buffer Mg++ (cofactor de la enzima)

Procedimiento
Desnaturalizacin del ADN (94C) Agregado e hibridacin de los cebadores (50C65C dependiendo de los cebadores) Elongacin (72C) Repeticin de estas etapas (25-35 ciclos)

Luego de terminados los ciclos se obtienen millones de molculas de la regin blanco La hace una tcnica extremadamente sensible

Ventaja: se puede amplificar ADN partiendo de muy poco material Desventaja: Contaminaciones

Variantes del mtodo

rt- PCR:
Se usa una transcriptasa reversa para pasar una muestra de ARN a ADN obteniendose ADN copia (ADNc) Se realiza un PCR para amplificar el ADNc de inters Estudios de expresin gnica Clonado de genes eucariotas (eliminacin de intrones)

PCR cuantitativo (real time PCR, qPCR):

Se diferencia en que en cada ciclo de amplificacin se cuantifica la cantidad de ADN obtenida Permite inferir la cantidad de molculas de molde que exista originalmente en la muestra:
Cuantificacin de la expresin gnica Cuantificacin de microorganismos

Secuenciacin de ADN
Mtodo de Sanger (nobel en 1980) Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs) para terminar una reaccin de sntesis de ADN invitro

Realizando 4 reacciones independientes (una para cada base) se puede inferir la secuencia original

Secuenciacin automtica

Sigue el mismo principio A diferencia del mtodo anterior cada ddNTP se marca con una molecula fluorescente diferente Esto permite realizar una unica reaccion en la cual estan presentes los 4 ddNTPs marcados Los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis capilar La deteccin se realiza en un punto fijo al final de la corrida

Secuenciacin de genomas
Cada reaccin de secuencia es capaz de leer unas 500 pb Como se obtuvo la secuencia continua del conjunto de los cromosomas humanos? Cada cromosoma tiene en promedio 150Mb (genoma completo 109)

Construccin de biblioteca de ADN genmico fragmentado al azar Lectura de secuencias individuales Las secuencias individuales son solapadas y ensambladas (contigs) Para asegurarse de que todas las secuencias estn representadas se leen unas 10 veces la cantidad de bases del genoma

La velocidad de produccin de las secuencias ha ido en aumento. Recientemente se dio un salto en este sentido con el desarrollo de los secuenciadores de prxima generacin No usan terminacin de cadena Se coloca una base cada vez y se detecta cual fue incorporada a cada molcula que se esta secuenciando Producen en una nica reaccin de secuencia millones de lecturas de fragmentos diferentes (paralelizacin) 109 1011 bases por corrida (menos de 1 da) De esta forma se secuencio el genoma entero de Watson en menos de 1 mes a un bajo costo