EVALUACIN DE LA ADSORCIN DE COLGENO SOBRE EVALUACIN LA ADSORCIN DE COLGENO SOBRE MATRICES DEDE PLA-PGA-BIOCERMICO-QUITOSANO MATRICES DE PLA-PGA-BIOCERMICO-QUITOSANO MEDIANTE ESPECTROSCOPA

DE IMPEDANCIA MEDIANTE ESPECTROSCOPA DE IMPEDANCIA ELECTROQUMICA

3 4 5 N. D. Montaez , Montaez M.Gelves1,,M.Gelves H. A. Estupin , C. Vsquez , D.Y. Pea . Universidad Industrial de 2 3 4 N. D. , H. A. Estupin , C. Vsquez , D.Y. Pea5. 1 2

ELECTROQUMICA

Santander, Bucaramanga, Santander, Colombia. Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Santander, Colombia. Recibido marzo 2011 Aceptado Agosto 10, 2011 Recibido marzo 16,16, 2011 Aceptado Agosto 10, 2011
activation, spectroscopy.
Keywords

Resumen En este trabajo, mediciones de espectroscopa de impedancia electroqumica (EIE) han sido empleadas para evaluar la adsorcin de la protena de colgeno en una superficie polimrica PLAPGA-Biocermico-Quitosano. Se ha discutido de los resultados obtenidos que la resistencia a la transferencia de carga es directamente proporcional a la cantidad de protena de colgeno adsorbida (concentracin superficial) y que este proceso, depende en gran medida de la afinidad de la protena a los sitios bioactivos en la superficie polimrica, aumentando esta afinidad con un sobrepotencial de electrodo en el sistema estudiado. Palabras clave Adsorcin, electroactivacin, espectroscopa de electroqumica. colgeno, impedancia

Adsorption, collagen, electroelectrochemical impedance I. INTRODUCCIN

Abstract In this paper, electrochemical impedance spectroscopy measurements (EIA) have been used to evaluate the adsorption of the protein collagen in a PLA-PGA polymer surface-bioceramic-Chitosan. From the results obtained, tt has been discussed that the resistance to charge transfer is directly proportional to the amount of absorbed collagen protein (surface concentration) and that this process depends largely on the affinity of the protein to bioactive sites on the polymer surface, increasing the affinity with an electrode overpotential in the system studied.

1 Nerly D. Montaez, Ingeniera Qumica, Magister en Ingeniera de Materiales. Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Santander, Colombia (correo e.: ing.nerly.montanez@hotmail.com). 2 Marcela Gelves, Ing. Qumica, Estudiante de Maestra en Ingeniera de Materiales. Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Santander, Colombia (correo e.: marcegelvez@hotmail.com). 3 Hugo Estupin, Ingeniero Metalrgico, M.Sc. Doctor en Ingeniera Qumica-UIS. Profesor Escuela de Materiales Universidad Nacional de Colombia-Sede Medelln, Colombia (correo e.: ugodoc@gmail.com). 4 Custodio Vsquez, Ingeniero Metalrgico, M.Sc. Director Grupo de Investigaciones en Corrosin, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Santander, Colombia (correo e.: custodio@uis.edu.co). 5 Daro Pea, Ingeniero Metalrgico, M.Sc., Ph.D. Coordinador Grupo de Investigaciones en Corrosin, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Santander, Colombia (correo e.: darioyesid@hotmail.com).

n elemento fundamental en la reparacin de rganos o tejidos humanos, son los andamios o matrices para regeneracin de tejidos (scaffolds). Una opcin popular en la fabricacin de andamios son los polmeros reabsorbibles, fundamentalmente porque los polmeros son fciles de procesar en forma de una estructura tridimensional con una morfologa de poro, particular para aplicaciones en la ingeniera de tejidos. La biocompatibilidad de un material depende de la adherencia de biomolculas de inters a la superficie. El contacto de un tejido vivo con un material implantado se hace compatible con el entorno fisiolgico mediante la generacin de una capa adsorbida compuesta de protenas que estn presentes en ste. Los polmeros biodegradables y bioabsorbibles como el cido Polilctico PLA y cido poligliclico PGA son usados en diferentes aplicaciones biomdicas, como las suturas absorbibles, injertos de piel artificial, implantes ortopdicos y sistemas controlados de liberacin de medicamentos [1]. Estos polmeros por sus propiedades de biodegrabilidad y atoxicidad, los hace aptos para fabricar andamios tridimensionales [2]. II. METODOLOGA A. Materiales y Reactivos La solucin salina amortiguada por fosfatos PBS, empleada en la experimentacin, simulando fluidos corporales, se obtuvo a partir de NaCl 8,06 g, KCl 0,22 g, Na2HPO4 1,15 g, KH2PO4 0,20 g y H20 1000 ml con un pH de 7,4. El cido polilctico fue sintetizado por policondensacin del cido L-lctico (MERCK) al 98% con ZnCl2 como catalizador al 1.5% en peso, el tiempo total de sntesis fue de 57 horas [3]. El cido poligliclico (PGA) se prepar por policondensacin
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a partir de cido gliclico Carlo Erba al 70%, con 0,5% en peso de ZnCl2 como catalizador y un tiempo total de 25 horas de sntesis [4]. Ambos procedimientos se llevaron a cabo en un rotoevaporador con control de temperatura y presin de vaco. El cido Polilctico y el cido Poligliclico se caracterizaron mediante Espectroscopa por Infrarrojo de Transformada de Fourier (FTIR). El biocermico, compuesto por dos tipos de fosfatos de calcio [5], se obtuvo por precipitacin acuosa a partir de nitrato de calcio tetrahidratado y fosfato de Amonio (Ca(NO3)24H2O) dihidrogenado ((NH4)H2PO4) en concentraciones 1M y 0.48M respectivamente, basificando la solucin formada con hidrxido de amonio, la cual fue envejecida y calcinada hasta obtener el biocermico requerido [6]. El material obtenido fue caracterizado cualitativa y cuantitativamente mediante Difraccin de Rayos X en un difractmetro de polvo RIGAKU D/MAX IIIB a un voltaje de 40kV, corriente de 30 mA, muestreo de 0,02 (2) y un rango de medicin 2-70 (2). El quitosano empleado en la fabricacin de la matriz de regeneracin celular fue de Sigma Aldrich, referencia 417963-25G, con un grado de desacetilacin de 85%. Este polmero es un polisacrido biodegradable y atxico derivado de la quitina, la cual es una sustancia natural que presenta actividad antibacteriana y antifngica [6-7]. B. Electrodeposicin del Polmero sobre el Cristal de Cuarzo Cristales de cuarzo se emplearon como electrodo soporte para electrodepositar el compuesto polimrico de cido polilctico-cido poligliclico (85.5%) - biocermico (9.5%) y quitosano (5%), disueltos en acetona al 15% p/v. La electrodeposicin fue catdica a 9V durante 15 minutos empleando como nodo una lmina de acero inoxidable y como ctodo el cristal de cuarzo. C. Espectroscopa de Impedancia Electroqumica (EIE) Las mediciones de EIE se llevaron a cabo en una celda plana con un volumen de 155 cm3, con un serpentn conectado a un bao termostatado y recirculacin de agua. Se us un electrodo de referencia de calomel saturado, una barra de grafito como contraelectrodo y un cristal de Au-T recubierto con el compuesto polimrico como electrodo de trabajo. Las condiciones para las pruebas electroqumicas fueron: concentracin de colgeno (12.5, 20 y 27.5 g/ml) disuelto en PBS a pH 7.4, como electrolito,
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temperatura de 37C y 39.5C, sobrepotenciales de 0.37, 0 y 0.56V, obtenidos segn los picos de potencial mostrados en la prueba de voltametra cclica realizada. En la Fig. 1 se muestra el montaje realizado para los ensayos de espectroscopa de impedancia electroqumica.

Fig. 1. Fotografa del montaje para las mediciones electroqumicas.

Se ha demostrado que la resistencia a la transferencia de carga es inversamente proporcional a la masa adsorbida especfica en la superficie del electrodo. Una medida de la velocidad de reaccin y de la cantidad de protena adsorbida en una superficie es el inverso de la resistencia a la transferencia de carga R-1ct, que es directamente proporcional a la cantidad de protena adsorbida (mol.cm2) y a la densidad de carga superficial. La adsorcin de protenas puede ser descrita con las ecuaciones 1 y 2 que muestran el modelo de Langmuir, el cual permite relacionar la concentracin de protena de colgeno C y la cantidad de material adsorbido en la superficie [910-11].
( ) ( ) ( )

(1) (2)

Donde es el coeficiente de adsorcin y representa la mxima cantidad de protena que se puede adsorber en la superficie. Estos valores fueron obtenidos del intercepto y la pendiente de la curva de est relacionado con la afinidad contra C. de la protena de colgeno a ser adsorbida en la superficie del compuesto polimrico depositado sobre el electrodo a una temperatura dada. La energa libre de adsorcin se obtiene de la relacin mostrada en la ecuacin 3 [11], en donde M, es la concentracin molar de la protena en la solucin acuosa de PBS. ( ) (3)

N.D. Montaez, M. Gelves, H. A. Estupin, C. Vsquez, D.Y. Pea

III. RESULTADOS Y DISCUSIN A. Caracterizacin del Material Polimrico y Biocermico Obtenidos En la Fig. 2 se muestra el espectro FTIR para el cido polilctico sintetizado.
100

%T

Hidroxiapatita

whitlockita

95

90

85

Fig. 4. Difraccin de rayos X de la hidroxiapatita sintetizada

80

75

70

4000 3750 PLA(2010)

3500

3250

3000

2750

2500

2250

2000

1750

1500

1250

1000

750

Fig. 2. Espectro Infrarrojo PLA

500 1/cm

La caracterizacin de la hidroxiapatita por difraccin de rayos X mostr la presencia de fases cristalinas de hidroxiapatita y fosfato triclcico (whitlockita), este ltimo en mayor proporcin. No se presentaron fases amorfas, como lo muestra la Tabla I.
TABLA I. FASES DE LA HIDROXIAPATITA SINTETIZADA FASE Cristalinos Ca3(PO4)3OH Ca3(PO4)2 No Tarjeta Nombre PDF-2 010-76Hidroxilapatita 0694 000-55Whitlockita 0898 D.E=Desviacin Estndar Cuantitativo 31.2% (DE=0.4) 68.8% (DE=0.6)

En este espectro se observan los picos caractersticos de los grupos funcionales de la estructura del cido polilctico. Los grupos funcionales O-H, C-H, C=O, CH3, C-C, C-O, se ubican en las longitudes de onda de 3510, 3000, 1756, 1450, 1190 y 1086 respectivamente. Estos resultados son similares a los obtenidos en otros estudios [12]. En la Fig. 3 se muestra el espectro FTIR para el cido poligliclico sintetizado.
100 %T 97.5

95

92.5

90

87.5

85

82.5

80

77.5

75

72.5

70 4000 3750 PGA(2010 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 1/cm

Fig. 3. Espectro Infrarrojo PGA

B. Espectroscopa de Impedancia Electroqumica EIE La tcnica de EIE fue empleada para hacer la caracterizacin de la interfase polmero-electrolito y de los procesos superficiales relacionados con la adsorcin de la protena de colgeno en el recubrimiento de PLA-PGA-biocermico-quitosano. Se obtuvieron los correspondientes espectros de Bode y de Nyquist mostrados en las Fig. 5 y 6. En la Fig. 5 se muestra el espectro de adsorcin obtenido para colgeno 27.5 g/ml, 39C, y -0.37 V. La lnea continua, muestra los datos simulados de este espectro.

Los grupos funcionales O-H, C-H, C=O, CH3, CC, C-O, se ubican en las longitudes de onda: 3500, 2950, 1750, 1425, 1160 y 1090 respectivamente. Estos resultados son similares a los obtenidos por otros investigadores [13]. En la Fig. 4 se muestra el difractograma de rayos X obtenido de la muestra de hidroxiapatita sintetizada.

Fig. 5. Caracterizacin de la adsorcin de colgeno sobre el compuesto polimrico a una concentracin de 27.5 g/ml de protena en solucin, 39C y -0.37 V de sobrepotencial. a) Espectro de Nyquist, b) Espectro de Bode
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En la Fig. 6 se muestra los espectros para colgeno en solucin de PBS a concentracin de 27.5 g/ml, 37C y 0 Voltios de sobrepotencial vs el electrodo de referencia, adsorbido sobre el compuesto polimrico. Los datos simulados mediante el software Zview 3.2 se muestran en esta figura (lnea continua), los cuales fueron obtenidos a partir de un modelo planteado de circuitos equivalentes descrito ms adelante que representa el proceso electrdico de adsorcin de la protena sobre el polmero.

capacitancia medida a bajas frecuencias, representa la suma en serie de la de los procesos de electrodo de la interfase cristal-polmero y de los procesos de degradacin del polmero. La resistencia a la transferencia de carga relacionada con la adsorcin de protena-polmero-sln, es inversamente proporcional a la masa adsorbida especfica en la superficie del electrodo, R-1adsorc-prot (molcm2) y proporcional a la densidad de carga superficial. Los valores de cambio en la energa libre de Gibbs, variando el sobrepotencial aplicado y la temperatura, se muestran en la Tabla II.
TABLA II. DATOS CALCULADOS DEL CAMBIO DE ENERGA LIBRE DE GIBBS
RELACIONADOS CON LA ADSORCIN DE PROTENA DE COLGENO

T[K] 310,15 Fig. 6. Caracterizacin de la adsorcin de colgeno 27.5 g/ml, 37C, 0 V de sobrepotencial y su simulacin, puntos y lnea continua respectivamente. a) Espectro de Nyquist, b) Espectro de Bode 312,65

-0,37 V -G[J/mol] 37164,89 37809,21

0,00 V -G[J/mol] 29943,58 38150,13

0,56 V -G[J/mol] 47998,53 53801,23

Se muestra el comportamiento electroqumico en dos interfases compuestas de constantes de tiempo ( ) traslapadas, una a altas frecuencias y otra a baja frecuencias, donde t es el tiempo de relajacin del electrodo en la interfase, C es la capacitancia de la interfase respectiva y R es la resistencia a la transferencia de carga en la interfase. Con la presencia de estas dos constantes y con el uso de elementos de fase constante (CPE) en lugar de capacitores puros, se realiz un ajuste de los datos del espectro obtenido empleando el software Zview 3.2 [14], a partir de un modelo de circuitos equivalentes que relaciona estas dos constantes de tiempo con el proceso de adsorcin sobre el compuesto polimrico. El modelo planteado se muestra en la Fig. 7.

En la Fig. 8 se muestra el cambio de la energa libre de Gibbs con la temperatura. Los valores obtenidos para el cambio de la energa libre de Gibbs indican que la adsorcin de la protena de colgeno en el compuesto polimrico de PGA-biocermicoquitosano, es un proceso espontneo para todas las condiciones evaluadas. La espontaneidad de los procesos concuerda con la disminucin en el valor de la resistencia a la transferencia de carga al aumentar la concentracin de colgeno.

Fig. 7. Modelo de circuito equivalente que representa el proceso de adsorcin de protena de colgeno sobre el compuesto polimrico

Fig. 8. Cambio de energa libre de Gibbs de adsorcin con la temperatura y sobrepotencial de -0,37 V, 0 V y 0.56 V

En este modelo, Rpbs-prot es la resistencia del electrolito (PBS + protena), Rads y CPE adsorc.prot es la resistencia de la transferencia de carga y la capacitancia relacionada con la adsorcin de la protena polmero-solucin medida en la doble capa electroqumica a altas frecuencias. La resistencia y la
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Parmetros termodinmicos importantes como la entropa y la entalpa de adsorcin, son obtenidos a partir de la pendiente y el punto de corte de la grfica . Los datos de entalpa y entropa correspondientes a los ensayos de adsorcin de colgeno sobre el compuesto polimrico, se muestran en la Tabla III.

N.D. Montaez, M. Gelves, H. A. Estupin, C. Vsquez, D.Y. Pea

TABLA III. PARMETROS TERMODINMICOS CALCULADOS A PARTIR DE LA VARIACIN DE LA ENERGA LIBRE DE GIBBS CON LA
TEMPERATURA RELACIONADOS CON LA ADSORCIN DE PROTENA DE COLGENO

Potencial (V) -0,37 0,00 0,56

H [J/mol] 42769 98816 67188

S[J/mol*K] 257,7 3282 2321

Se determin un modelo para correlacionar la cantidad de protena adsorbida (1/Rct) con la concentracin de protena (Cprot), potencial aplicado (Pa), interaccin concentracin de protenapotencial aplicado (ecuacin 4). As mismo, el error experimental obtenido fue de 9,72025E-10. (
C:Potencial aplicado CC AC A:Concentracin de Prot 0 4 8 12 Standardized effect 16 20 24

La variacin de la entalpia del sistema muestra que este es un proceso endotrmico resultado del exceso energtico requerido para el rompimiento de interacciones intramoleculares implicados en la interaccin protena-polmero. Para un sobrepotencial de 0 Voltios y 0,56 Voltios, hay una disminucin en la espontaneidad del proceso de adsorcin. Un mejor comportamiento se presenta con un sobrepotencial de -0,37 Voltios. El aumento de la entropa representa la variacin de la entropa de adsorcin a partir del desarrollo de molculas de protena, a la vez que la adsorcin es impulsada por el aumento de la entropa conformacional de la protena. En la Fig. 9 se muestran micrografas de los recubrimientos antes y despus de la adsorcin, en donde la morfologa correspondiente a la adsorcin de protena de colgeno, presenta forma de fibrillas en la superficie de los recubrimientos (fig. 9 b) y d)).

Standardized Pareto Chart for 1/Rct

(4)

+ -

Fig. 10. Diagrama de Pareto para anlisis de las interacciones entre las variables

IV. CONCLUSIONES La resistencia a la transferencia de carga es directamente proporcional a la cantidad de protena de colgeno adsorbida (concentracin superficial). El proceso de adsorcin depende en gran medida de la afinidad de la protena a los sitios bioactivos en la superficie polimrica, aumentando esta afinidad con un sobrepotencial de electrodo en el sistema estudiado. La adsorcin de la protena de colgeno en el compuesto polimrico de PGA-biocermicoquitosano, es un proceso espontneo para todas las condiciones evaluadas, presentndose una adsorcin ms espontanea con el sobrepotencial aplicado de 0,37 Voltios. AGRADECIMIENTOS Los autores extienden sus agradecimientos a COLCIENCIAS y a la Vicerrectora de Investigaciones y extensin de la UIS por la financiacin de esta investigacin y a los Ingenieros Ivn Sotomonte y Andrea Contreras por su valiosa colaboracin. REFERENCIAS
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Fig. 9. Micrografas de la superficie de los compuestos polimricos a (20x). a) y c) Cristales con compuesto polimrico antes de adsorcin. b) Cristal con compuesto polimrico con adsorcin a 20 g/ml, 37C, 0V. d) Cristal con recubrimiento con adsorcin a 12,5 g/ml, 37C, 0V

Se realiz un anlisis estadstico que mostr cuatro efectos significativos en la variable de respuesta 1/Rct (Fig. 10). El potencial aplicado present un efecto negativo sobre la variable de respuesta, con el cual, a mayor sobrepotencial aplicado, menor es la respuesta de 1/Rct. Igual efecto se present con la interaccin entre la concentracin de protena y el potencial aplicado.

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Custodio Vsquez Q. M.Sc Ingeniera Metalrgica Universidad Industrial de Santander, profesor titular laureado. Grupo de Investigaciones en Corrosin GIC, UIS.

Daro Yesid Pea. Especialista en Docencia Universitaria. Ingeniero Metalrgico, M.Sc Ingeniera Metalrgica, Universidad Industrial de Santander, Ph.D en Corrosin UMIST, profesor asociado Escuela de Ingeniera Metalrgica y Ciencia de Materiales, Grupo de Investigaciones en Corrosin GIC, UIS.

BIOGRAFA
Marcela Gelves, Ing. Qumica, Estudiante de Maestra en Ingeniera de Materiales, Grupo de Investigaciones en Corrosin GIC, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Santander, Colombia.

Nerly Deyanira Montaez S. Ingeniera Qumica, Magister en Ingeniera de Materiales, Grupo de Investigaciones en Corrosin GIC, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Santander, Colombia.

Hugo A. Estupin D. M.Sc Ingeniera Metalrgica, Doctor en Ingeniera Qumica, Grupo de Investigaciones en Corrosin GIC, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Santander, Colombia.

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