DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS INFECCIONES POR Mycoplasma pneumoniae

L. Matas et al

Pgina 1 de 6

DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS INFECCIONES POR Mycoplasma pneumoniae

Lurdes Matas y Vicen Ausina Servicio de Microbiologa. Hospital Universitari Germans Tries i Pujol, Badalona

Mycoplasma pneumoniae es una bacteria de la familia Mycoplasmataceae de la clase Mollicutes caracterizada especialmente por carecer de pared celular. La clase Mollicutes ha evolucionado a partir de clulas tipo Clostridium , mediante sucesivas deleciones genticas, hasta las clulas actuales que presentan requerimientos nutricionales especficos y tienen un tamao menor que la mayora de bacterias. De hecho, son las bacterias ms pequeas con capacidad de divisin autnoma y vida libre. La ausencia de pared celular condiciona muchas de las caractersticas del microorganismo, como son su polimorfismo, que no se tian mediante la tincin de Gram, su resistencia a los antibiticos -lactmicos y su elevada sensibilidad a las variaciones de pH, temperatura, tensin osmtica y a los detergentes. En la membrana celular se encuentran los principales determinantes antignicos, tanto proteicos como glucolipdicos. La protena P1 es una adhesina de especial importancia para la patogenia del microorganismo y tambin es la diana de los principales anticuerpos que produce la respuesta inmunitaria del hospedador. Mycoplasma no puede ser observado con el microscopio ptico. Para su cultivo en el laboratorio es muy exigente, requiriendo un medio rico en esteroles y con precursores de aminocidos y nucletidos preformados, lo cual se consigue por la adicin de suero y extracto de levadura. Cuando crece no enturbia el medio lquido y para observar las colonias que forma en medio slido hace falta microscopio. Mycoplasma pneumoniae es un patgeno primario de las mucosas, mientras que otras especies de Mycoplasma no patgenas colonizan la superficie de la mucosa respiratoria. Se transmite de persona a persona por va area pero, debido a su gran sensibilidad a los cambios de temperatura y humedad, necesita un contacto prximo y continuado. Produce infecciones del tracto respiratorio, generalmente en forma de neumona de la comunidad o infecciones de las vas respiratorias altas. INFECCIONES PRODUCIDAS POR Mycoplasma pneumoniae Epidemiologa Mycoplasma pneumoniae es un patgeno exclusivamente humano y de distribucin universal. Es responsable de un 15-20% de las neumonas adquiridas en la comunidad. Esto supone una frecuencia de 2 casos/1000 personas/ao en algunos estudios. Las infecciones se producen sin variaciones estacionales importantes, pero suele presentarse en ciclos epidmicos cada 3-5 aos, que se relacionan con el otoo y la primavera. Tambin produce infecciones de vas respiratorias altas, siendo el segundo agente causal despus del virus influenza A, cuando se determina la etiologa de estos procesos por tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Si bien se sigue considerando a M. pneumoniae como un patgeno primario, su aislamiento debe ser valorado cuidadosamente, puesto que pueden persistir en el tracto respiratorio durante un periodo variable de tiempo despus de una infeccin clnicamente resuelta por el tratamiento antibitico.

DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS INFECCIONES POR Mycoplasma pneumoniae

L. Matas et al

Pgina 2 de 6

Cuadro clnico Mycoplasma pneumoniae produce infecciones del aparato respiratorio, principalmente en forma de neumona que, por sus peculiares caractersticas de presentacin clnicoradiolgica se denomina neumona atpica primaria. Los sntomas se presentan de manera gradual en varios das, y consisten en fiebre, tos no productiva, cefalea y mialgias. A menudo, se acompaa de faringitis, rinitis, otitis y traqueobronquitis. La exploracin fsica se caracteriza por la parquedad de sntomas, auscultndose ligeros subcrepitantes, aunque los pacientes pueden presentar crepitantes francos, roncus y sibilantes. En la radiografa de trax se observan infiltrados retculonodulillares parahiliares o peribronquiales que pueden ser uni o bilaterales. Puede observarse la presencia de un pequeo derrame pleural en uno de cada cuatro o cinco pacientes. En los anlisis complementarios suele encontrarse una discreta leucocitosis en un 30% de los pacientes. Los nios con alteraciones inmunolgicas como la anemia de clulas falciformes, con anesplenia funcional o con sndrome de Down, pueden desarrollar una infeccin respiratoria grave y de evolucin fulminante. La hipogammaglobulinemia es tambin un factor de riesgo para las infecciones del tracto respiratorio y de sus complicaciones a nivel articular. Se han descrito otro tipo de infecciones, aunque en menor frecuencia. Generalmente, acompaan a un cuadro respiratorio, pero pueden aparecer en ausencia absoluta de sntomas de esta localizacin. En la tabla 1 se relacionan las principales manifestaciones y complicaciones extrapulmonares.
Tabla 1. Infecciones extrapulmonares por Mycoplasma pneumoniae. Sistema central Piel Articular Cardiaca Sistema hematopoytico Renal Gastrointestinal Otros nervioso Meningoencefalitis, neuritis ptica, parlisis nervios craneales, parlisis ascendente (Sndrome Guillain-Barr), ataxia y psicosis Erupcin eritematosa papular o vesicular. Sndrome de Stevens-Johnson Mialgias, artralgias y poliartropatias Artritis sptica (especialmente en caso de hipogammaglobulinemia) Pericarditis, miocarditis y derrame pericrdico Anemia hemoltica asociada con aglutininas frias Prpura trombtica trombocitopnica Glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial, nefropata IgA Vmitos, diarreas y hepatitis colestsica. Pancreatitis Otitis externa, otitis media y miringitis Rabdomiolisis Conjuntivitis, uvetis anterior, retinitis y neuritis ptica Abscesos tubo-ovricos

Patogenia e inmunidad Mycoplasma pneumoniae es un patgeno extracelular cuya supervivencia depende de su capacidad de adhesiva a las clulas del epitelio respiratorio. Para ello, ha desarrollado una organela consistente en una estructura con forma de punta, que acumula un conjunto de protenas y adhesinas, especialmente la denominada P1, una protena de 170 kDa responsable de la interaccin entre el micoplasma y las clulas del epitelio respiratorio. La prdida de esta protena P1 comporta la prdida de adhesividad y, consecuentemente, de su capacidad patgena. Mycoplasma pneumoniae no libera toxinas y las lesiones que

DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS INFECCIONES POR Mycoplasma pneumoniae

L. Matas et al

Pgina 3 de 6

produce se relacionan con el perxido de hidrgeno que genera durante su actividad metablica. Acta conjuntamente con molculas endgenas de las clulas del tracto respiratorio y los principales efectos citopticos que se observan consisten en la prdida de la actividad de los cilios y la destruccin final del conjunto de la capa epitelial. La respuesta inflamatoria local consiste en la produccin de un infiltrado inflamatorio peribronquial y perivascular formado, principalmente, por linfocitos y clulas plasmticas. La respuesta inmune se manifiesta por la rpida produccin de anticuerpos frente a los antgenos proteicos y glucolipdicos del microorganismo. En la primoinfeccin, la dinmica de produccin de anticuerpos se inicia con un incremento de IgM, que se acompaa de IgG a las dos semanas. La IgA se produce de manera ms precoz y efmera que la IgM. En las reinfecciones se genera una respuesta por IgG e IgA que, tras opsonizar el micoplasma, facilita su fagocitosis y su posterior lisis con ayuda del complemento. Se ha sugerido que la falta de respuesta inmunolgica protectora contra la reinfeccin es debida a que los eptopos inmunodominantes son diferentes de los dominios que condicionan la adherencia. Diagnstico En la neumona producida por M. pneumoniae se detecta, en las pruebas analticas generales, una moderada leucocitosis, as como la presencia de crioaglutininas entre una y dos semanas despus de la infeccin. La presencia de crioaglutininas es inespecfica, puesto que nicamente aparece en un 50% de los pacientes con neumona por M. pneumoniae y porque tambin se produce en otras infecciones bacterianas y vricas. La presentacin radiolgica de la neumona atpica primaria es muy variable. Se observa afectacin bilateral en tan slo un 20% de los pacientes. El diagnstico microbiolgico, en la prctica habitual, se ha basado, generalmente, en la demostracin de anticuerpos especficos. Varios factores contribuyen a esta situacin. En primer lugar las tcnicas de cultivo son caras, laboriosas, lentas y no son abordables para la mayora de laboratorios de diagnstico clnico. Adems, en los cultivos de muestras respiratorias, bien sean aspirados nasofarngeos, exudados farngeos o esputos, la presencia de otras especies de micoplasma comensales obliga a realizar pruebas de identificacin para M. pneumoniae. Las tcnicas rpidas para deteccin de antgeno tampoco han tenido gran aceptacin, debido a su baja sensibilidad y especificidad. La aplicacin de tcnicas de PCR, bien por tcnicas convencionales, bien en sistemas de PCR en tiempo real, ha cambiado algunos de los conceptos epidemiolgicos y clnicos que se tenan sobre este micoplasma. Las principales ventajas de estas tcnicas radican en su sensibilidad, su rapidez, en la posibilidad de obtener resultados en un da, as como su posible aplicacin sobre muestras con elevado inculo de bacterias acompaantes, en las cuales es muy difcil aislar micoplasma por cultivo. Los mejores rendimientos de PCR se obtienen en muestras de esputo, pero generalmente se realizan en exudado farngeo, debido a la escasa productividad de la tos que acompaa a la neumona de esta etiologa. Aunque algunos autores prefieren el exudado farngeo al aspirado nasofarngeo por la mayor frecuencia de inhibiciones de la PCR en estas muestras, no existen datos concluyentes que demuestren el superior rendimiento de ninguna muestra en concreto. El estudio combinado de diferentes muestras, como siempre ocurre, permite un mayor nmero de detecciones. La persistencia de micoplasma en las muestras respiratorias, ha sugerido la necesidad de delimitar un nmero de copias/mL que permita diferenciar la infeccin clnica de la colonizacin residual. Actualmente, el desarrollo de tcnicas de PCR mltiple, que permiten detectar micoplasma junto a otros patgenos respiratorios como Chlamydophila pneumoniae, puede ser de utilidad en la prctica habitual de los laboratorios de diagnstico clnico.

DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS INFECCIONES POR Mycoplasma pneumoniae

L. Matas et al

Pgina 4 de 6

En la actualidad, la serologa continua siendo el mtodo diagnstico ms ampliamente aplicado para el diagnostico de las infecciones por M. pneumoniae. Las particulares consideraciones que merece este apartado hacen que lo individualicemos del resto de mtodos diagnsticos. DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS INFECCIONES PRODUCIDAS POR Mycoplasma pneumoniae Tcnicas serolgicas disponibles Las primeras determinaciones de la respuesta inmunolgica especfica frente a M. pneumoniae se realizaron por la tcnica de fijacin del complemento (FC), utilizando como antgenos, bien un extracto lipdico de M. pneumoniae, bien una suspensin de lisado bacteriano. La complejidad antignica de este microorganismo, en comparacin con los virus, condiciona un mayor nmero de resultados inespecficos. Tambin se observan reacciones cruzadas con los antgenos glucolipdicos de otros micoplasmas. La tcnica de FC determina principalmente IgM y, en menor medida, IgG. La demostracin de un incremento en cuatro veces el ttulo entre una muestra de la fase aguda y una de la fase de convalecencia, o bien ttulos superiores o iguales a 1/32, proporciona una sensibilidad del 90% y una especificidad del 88%. La complejidad y las mltiples variables a controlar con la tcnica de FC han contribuido a que la mayora de laboratorios busquen otras alternativas de diagnstico serolgico. Las tcnicas de inmumofluorescencia (IF) son relativamente fciles de realizar y permiten un resultado cuantitativo. Sus principales limitaciones son la subjetividad en la interpretacin de los resultados obtenidos y la reactividad cruzada con el factor reumatoide. Las tcnicas de aglutinacin pasiva utilizan un soporte, como el ltex o la gelatina, para una mezcla de antgenos especficos de M. pneumoniae. Detectan conjuntamente IgG e IgM, permitiendo tambin su cuantificacin. La aglutinacin de partculas de gelatina es de muy fcil realizacin y considerable especificidad, si bien, para conseguir una mxima sensibilidad se recomienda realizar la determinacin en dos muestras seriadas. En un estudio comparativo con tcnicas de PCR, Templeton et al. (2003), observaron que una muestra de suero de la fase inicial permita detectar el 50% de las infecciones, y que la sensibilidad alcanzaba el 66%, si se dispona de una muestra de la fase de convalecencia, siempre que se valorasen aglutinaciones a ttulos iguales o superiores a 1/320. Las tcnicas de enzimoinmunoanlisis (EIA) se han impuesto en la mayora de laboratorios clnicos. Para la preparacin de los reactivos necesarios se utiliza una gran diversidad de preparados antignicos (protenas purificadas, pptidos sintticos, mezcla de antgenos crudos, glucolpidos purificados), que permiten la deteccin de IgG o de IgM, y en diferentes presentaciones (tcnicas de captura-, microplacas, en soporte de membrana). Las pruebas de EIA parecen muy sensibles para la deteccin de anticuerpos especficos, presentando, como siempre, la ventaja de ser automatizables y de necesitar un volumen de suero reducido. Las presentaciones en soporte de membrana permiten determinaciones cualitativas de IgM, generalmente en presentaciones unitarias de fcil realizacin, y que permiten obtener resultados de manera muy rpida. Tambin existen presentaciones en soporte de membrana que permiten detectar tanto IgG como IgM, y que han demostrado buena sensibilidad y especificidad. En cualquier caso, para alcanzar una buena sensibilidad diagnstica con las tcnicas de EIA, sigue siendo necesario disponer de una muestra de suero del periodo de convalecencia.

DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS INFECCIONES POR Mycoplasma pneumoniae

L. Matas et al

Pgina 5 de 6

La deteccin de IgA se considera como el mejor indicador de infeccin aguda, sin embargo, Csng et al. (2004), utilizando reactivos comercializados, encontraron un 68,5% de positividad para esta inmunoglobulina en donantes de sangre. Principales condicionantes de la respuesta inmunolgica a M. pneumoniae Una vez revisadas las tcnicas serolgicas disponibles, y para evaluar los resultados que se obtienen en funcin de la tcnica aplicada, es conveniente tener presente la dinmica de produccin de anticuerpos frente a esta bacteria. La respuesta inmunolgica en la primera infeccin por M. pneumoniae se produce rpidamente, alcanzando la mxima concentracin de anticuerpos en unas 3-6 semanas para, seguidamente, disminuir gradualmente durante meses o aos. Las IgM especficas anti-Mycoplasma aparecen durante la primera semana de la infeccin y preceden, en unas 2 semanas, a las IgG. A menudo, los anticuerpos estn presentes en el momento de la sintomatologa clnica, debido al largo periodo de incubacin. Es decir, estamos frente a una bacteria que en la primera infeccin, que acostumbra a suceder en el nio pequeo, produce una respuesta inmunolgica clsica sin dejar inmunidad permanente. En la reinfeccin no hay respuesta de IgM, sino una rpida elevacin de IgG que se acompaa de produccin de IgA. Adems, se ha observado que, si se produce IgM, puede persistir durante meses o aos, de modo que en el adulto joven la deteccin de IgM puede no responder a una infeccin reciente. As, en la primoinfeccin las tcnicas de deteccin de IgM tienen una buena sensibilidad y especificidad, mientras que, en las reinfecciones, la falta de deteccin de IgM especfica no permite descartar una infeccin aguda por M. pneumoniae. Otros factores que debemos tambin tener en cuenta para el diagnstico etiolgico de estas infecciones por serologa, es el hecho de que, al tratarse por lo general de una patologa no grave, incluso se le ha denominado la neumona del paseante ( walking pneumonia), no requiere ingreso del hospitalario en la mayora de los enfermos, y su recuperacin, relativamente rpida, dificulta el cumplimiento de recogida de una segunda muestra, especialmente en nios pero tambin en adultos. Estos patrones epidemiolgicos clsicos deben ser replanteados debido al cambio de costumbres y a las posibilidades diagnsticas de las nuevas tcnicas de PCR. Actualmente, sabemos que la primoinfeccin se da cada vez con ms frecuencia en nios de 3-4 aos o incluso menores, cuando antes se crea muy rara por debajo de los cinco aos. Tambin se encuentra una frecuencia mayor de la esperada en personas de edad avanzada. Asimismo, contribuye al problema diagnstico de esta entidad el hecho de que en el adulto, con frecuencia, ocurran infecciones asintomticas o muy leves, que tal vez puedan relacionarse con un cierto grado de inmunidad debida a infecciones previas. Con todas las premisas anteriores, en el momento de plantear el diagnstico de las infecciones por M. pneumoniae en el laboratorio, se deben seleccionar las tcnicas no slo por criterios funcionales (posibilidad de automatizacin, respuesta minuto, etc.) sino tambin adecundolas al grupo poblacional. Las tcnicas de EIA para deteccin especfica de IgM no deberan ser aplicadas en las infecciones de los nios mayores ni de los adultos, dado que las reinfecciones no condicionan una buena respuesta de IgM. Adems, los reactivos comercializados deben ser valorados cuidadosamente, sobre todo por lo que respecta a su especificidad. Tampoco resulta prctico plantear el diagnstico en base a la demostracin de IgG, con seroconversin o incremento significativo del ttulo, puesto que ello nos obliga a un diagnstico muy tardo que, en una patologa generalmente leve, es de muy difcil cumplimiento. Con cierto pragmatismo, y con criterios de oficio, parecen ms tiles las

DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS INFECCIONES POR Mycoplasma pneumoniae

L. Matas et al

Pgina 6 de 6

tcnicas que detectan tanto IgG como IgM, puesto que permiten el diagnstico de la primera infeccin ya en el momento de la consulta, especialmente en los nios pequeos. Un porcentaje considerable de casos quedarn diagnosticados ya con la primera muestra de suero, pero adems, la dinmica de produccin de anticuerpos, permite, a menudo, confirmar un diagnstico dudoso simplemente repitiendo la determinacin dos o tres das despus. nicamente en casos seleccionados ser necesario esperar 2-3 semanas para observar seroconversin o incremento significativo del ttulo de anticuerpos. BIBLIOGRAFA W AITES KB, T ALKINGTON DF. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human patogen. Clin Microbiol Rev 2004; 17:697-728. AUSINA V, RODRIGO C. Infecciones causadas por micoplasmas. En: Farreras-Rozman (eds). Medicina Interna, 15 ed. Madrid: Elsevier Espaa SA, 2004; pp 2362-2365. TALKINGTON DF, SHOTT S, FALLON MT, SCHWARTZ SB, T HACKER WL. Analysis of eight commercial enzyme immunoassay tests for detection of antibodies to Mycoplasma pneumoniae in human serum. Clin Diagn Lab Immunol 2004; 11:862-867. MICHELOW IC, OLSEN K, LOZANO J, DUFFY LB, MCCRACKEN GH, HARDY RD. Diagnostic utility and clinical significance of naso- and oropharyngeal samples used in a PCR assay to diagnose Mycoplasma pneumoniae infection in children with community-acquired pneumonia. J Clin Microbiol 2004; 42:3339-3341. TEMPLETON KE, SCHELTINGA SA, GRAFFELMAN AW, VAN SCHIE JM, CRIELAARD JW, SILLEKENS P, ET AL. Comparison and evaluation of real-time PCR, real-time nucleic acid sequence-based amplification, conventional PCR, and serology for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae. J Clin Microbiol 2003; 41:4366-4371. CSANGO PA, PEDERSEN JE, HESS RD. Comparison of four Mycoplasma pneumoniae IgM-, IgG- and IgA-specific enzyme immunoassays in blood donors and patients. Clin Microbiol Infect 2004; 10:1094-1098. W AITES KB, BBAR CM, ROBERTSON JA, T ALKINGTON DF, KENNY GE. Laboratory diagnosis of mycoplasmatal infections. Cumitech 34; Washington: ASM Press, 2001. RAZIN S, YOGEV D, NAOT Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiol Mol Biol Rev 1998; 62:1094-1156. MATAS L, DOMNGUEZ J, DE ORY N, GARCA N, GAL P, CARDONA PJ, ET AL. Evaluation of Meridian ImmunoCard Mycoplasma test for the detection of Mycoplasma pneumoniae. Scand J Infect Dis 1998; 30:289-293.