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PRACTICA N 2

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS PARA EL AISLAMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO DE CLULAS


- PRACTICA DEMOSTRATIVA
Msc. William H Roldn

1. MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA EL CULTIVO DE CLULAS EN MONOCAPA E EN


SUSPENSIN
1.1. MEDIO DE CULTIVO ESENCIAL MINIMO (MEM)
Es uno de los medios ms utilizados de todos los medios de cultivo celular. MEM se puede
utilizar con una variedad de clulas de mamferos adherentes y en suspensin, incluyendo
HeLa, BHK-21, 293, HEP-2, HT-1080, MCF-7, fibroblastos y astrocitos de rata.
Este medio de cultivo fue desarrollado por Harry Eagle, basado en su formulacin anterior de
medio basal de Eagle (BME). Muchas otras modificaciones del MEM siguieron, incluso de
GlasgowsMEM, MEM , DMEM, Temins MEM. Este medio contiene las sales de Earle para su
uso en una incubadora de CO2, o con sales de Hanks para el uso sin CO2. Este medio de cultivo
no contiene factores de crecimiento, protenas o lpidos. Por lo tanto, se hace necesaria la
suplementacin con suero fetal bovino en un 10% de concentracin final. MEM usa un
sistema tampn bicarbonato de sodio (2.2 g/L) y por lo tanto requiere un entorno de CO2 al 5 o
10% para mantener el pH fisiolgico.

1.2. MEDIO ESENCIAL MNIMO MODIFICADO POR DULBECCO (DMEM)


Es un medio basal ampliamente utilizado para apoyar el crecimiento de una amplia gamma
clulas de mamfero, tales como fibroblastos primarios, neuronas, clulas gliales, clulas
HUVEC, y clulas de msculo liso. Tambin soporta el cultivo de diversas lneas celulares, tales
como HeLa, 293, COS-7, y PC-12.
El medio DMEM es nico de otros medios de cultivo, ya que contiene 4 veces la concentracin
de aminocidos y vitaminas que el medio esencial mnimo original de Eagle. El medio DMEM
ha sido formulado con bajo nivel de glucosa (1 g/L) y piruvato de sodio, pero se usa a menudo
con niveles ms altos de glucosa, con o sin piruvato de sodio. Este medio de cultivo no
contiene factores de crecimiento, protenas o lpidos, siendo necesaria la suplementacin con
suero fetal bovino en un 10% de concentracin final. DMEM usa un sistema tampn
bicarbonato de sodio (2.2 g/L) y por lo tanto requiere un entorno de CO2al 5 o 10% para
mantener el pH fisiolgico.
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1.3. MEDIO DE CULTIVO RPMI 1640


Conocido originalmente como el medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, este
medio de cultivo fue desarrollado originalmente para cultivo de clulas leucmicas humanas
en suspensin y en monocapa. Sin embargo, este medio tambin es adecuado para una
variedad de clulas de mamfero, incluyendo a clulas HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC,
astrocitos y carcinomas.
El medio RPMI 1640 es nico, ya que contiene el agente reductor glutation y altas
concentraciones de vitaminas. El medio RPMI 1640 que contiene biotina, vitamina B12, y
PABA, que no se encuentran en el medio esencial mnimo de Eagle o el medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM). Adems, el inositol, la colina y las vitaminas estn
presentes en concentraciones muy altas. El medio RPMI 1640 no contiene factores de
crecimiento, protenas o lpidos, siendo necesario la suplementacin de un 10% de suero fetal
bovino. Adems, el medio RPMI 1640 utiliza un sistema de tampn de bicarbonato de sodio
(2.0 g/L) y por lo tanto requiere un entorno de CO2 de 5 a 10% para mantener el pH fisiolgico.

2. SOLUCIONES TAMPONADAS PARA EL TRANSPORTE Y LAVADO DE CLULAS


2.1. SOLUCIN SALINA TAMPONADA CON FOSFATO DE DULBECCO (1954)
Es una solucin salina equilibrada utilizada para una variedad de aplicaciones de cultivo de
clulas, tales como clulas de lavado antes de la disociacin, las clulas que transportan o
tejida, diluyendo las clulas para el recuento, y la preparacin de los reactivos. Las
formulaciones con calcio y magnesio se utilizan generalmente como medios de transporte o
para la preparacin de reactivos.

2.2. SOLUCIN SALINA EQUILIBRADA DE HANK (HBSS)


Esta solucin se utiliza para una variedad de aplicaciones de cultivo de clulas, tales como
clulas de lavado antes de la disociacin, las clulas que transportan o muestras de tejido,
diluyendo las clulas para el recuento, y la preparacin de los reactivos. Las formulaciones con
calcio y magnesio se utilizan generalmente como medios de transporte, o para la preparacin
de reactivos.

2.3. SOLUCIN SALINA EQUILIBRADA DE EARLE (EBSS)


Esta solucin se utiliza para una variedad de aplicaciones de cultivo de clulas, tales como
clulas de lavado antes de la disociacin, las clulas que transportan o tejido, diluyendo las
clulas para el recuento, y la preparacin de los reactivos. Las formulaciones con calcio y
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magnesio se utilizan generalmente como medios de transporte o para la preparacin de


reactivos.

3. SOLUCIONES UTILIZADAS PARA EL DESPRENDIMIENTO DE CLULAS


3.1. SOLUCIN DE TRIPSINA 0.25% /EDTA 1MM
Contiene tripsina, una enzima proteoltica derivada de pncreas porcino que cliva la regin cterminal de los residuos aminocidos lisina o arginina de una cadena polipeptdica. Debido a su
fuerza digestiva, la tripsina se utiliza ampliamente para la disociacin celular, pasaje de cultivo
celular y la disociacin de tejido primario. La concentracin de tripsina requerida para la
disociacin vara con el tipo celular y las necesidades experimentales.

3.2. SOLUCIN DE COLAGENASA (50 A 200 UI/ML) EN HBSS


La colagenasa es una proteasa que cliva la unin entre un aminocido neutral (X) y la glicina en
la secuencia Pro-X-Gly-Pro, que se encuentra con alta frecuencia en el colgeno. La colagenasa
es nica entre las proteasas por su capacidad para degradar las fibrillas de colgeno nativo que
se encuentran comnmente en los tejidos conectivos tales como la piel, tendones, vasos
sanguneos y los huesos. La desagregacin por colagenasa es adecuada para el cultivo de
tumores humanos, clulas de rin de ratn, de cerebro fetal o adulto humano y epitelio. La
colagenasa es relativamente suave, disociando bien a las clulas a temperatura y pH
fisiolgicos y no requiere agitacin mecnica o equipo especial.

MEDIOESENCIAL MNIMO MODIFICADO POR DULBECCO (DMEM)


Componentes

Concentracin (mg/L)

mM

Glycine

30

0.40

L-Arginine hydrochloride

84

0.40

L-Cystine 2HCl

63

0.20

L-Glutamine

584

4.00

L-Histidine hydrochloride-H2O

42

0.20

L-Isoleucine

105

0.80

L-Leucine

105

0.80

L-Lysine hydrochloride

146

0.80

L-Methionine

30

0.20

L-Phenylalanine

66

0.40

L-Serine

42

0.40

Aminocidos

L-Threonine

95

0.80

L-Tryptophan

16

0.08

L-Tyrosine disodium salt dihydrate

104

0.40

L-Valine

94

0.80

Choline chloride

0.03

D-Calcium pantothenate

0.01

FolicAcid

0.01

Niacinamide

0.03

Pyridoxine hydrochloride

0.02

0.4

0.00

0.01

7.2

0.04

Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.)

200

1.80

Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O)

0.1

0.00

97.67

0.81

Potassium Chloride (KCl)

400

5.33

Sodium Bicarbonate (NaHCO3)

3700

44.05

Sodium Chloride (NaCl)

6400

110.34

Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O)

125

0.91

4500

25.00

15

0.04

Concentracin (mg/L)

mM

Glycine

10.00

0.13

L-Arginine

200.00

1.15

L-Asparagine

50.00

0.38

L-Aspartic acid

20.00

0.15

L-Cystine 2HCl

65.00

0.21

L-Glutamic acid

20.00

0.14

L-Glutamine

300.00

2.05

L-Histidine

15.00

0.10

L-Hydroxyproline

20.00

0.15

Vitaminas

Riboflavin
Thiamine hydrochloride
i-Inositol
Sales inorgnicas

Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.)

Otros Componentes
D-Glucose (Dextrose)
Phenol Red

MEDIO DE CULTIVO RPMI 1640


Componentes
Aminocidos

L-Isoleucine

50.00

0.38

L-Leucine

50.00

0.38

L-Lysine hydrochloride

40.00

0.22

L-Methionine

15.00

0.10

L-Phenylalanine

15.00

0.09

L-Proline

20.00

0.17

L-Serine

30.00

0.29

L-Threonine

20.00

0.17

L-Tryptophan

5.00

0.02

L-Tyrosine disodium salt dihydrate

29.00

0.11

L-Valine

20.00

0.17

Biotin

0.20

0.00

Choline chloride

3.00

0.02

D-Calcium pantothenate

0.25

0.00

Folic acid

1.00

0.00

Niacinamide

1.00

0.01

Para-AminobenzoicAcid

1.00

0.01

Pyridoxine hydrochloride

1.00

0.00

Riboflavin

0.20

0.00

Thiamine hydrochloride

1.00

0.00

Vitamin B12

0.01

0.00

i-Inositol

35.00

0.19

Calcium nitrate (Ca(NO3)2 4H2O)

100.00

0.42

Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.)

48.84

0.41

Potassium chloride (KCl)

400.00

5.33

Sodium Bicarbonate (NaHCO3)

2000.00

23.81

Sodium Chloride (NaCl)

6000.00

103.45

Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4) anhyd.

800.00

5.63

D-Glucose (Dextrose)

2000.00

11.11

Glutathione (reduced)

1.00

0.00

Phenol Red

5.00

0.01

Vitaminas

Sales inorgnicas

Otros Componentes

SOLUCIN DE TRIPSINA 0.25% /EDTA 1mM


Componentes

Peso (g/L)

Concentracin (mM)

Tripsina

2.5

0.105

EDTA tetra sdico 4H2O

0.38

1L

PBS (c.s.p)

BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) SEGN DULBECCO, 1954


Componentes

Peso (g/L)

Concentracin (mM)

NaCl

8.0

137.9

Na2HPO4

1.15

8.1

KH2PO4

0.2

1.47

KCl

0.2

2.6

MgCl2

0.047

0.49

CaCl2

0.1

0.9

SOLUCIN DE SALES BALANCEADAS (HBSS) SEGN HANKS, 1949


Componentes

Peso (g/L)

Concentracin (mM)

NaCl

8.0

137.9

Na2HPO4

0.05

0.34

KH2PO4

0.06

0.44

KCl

0.4

5.3

NaHCO3

0.35

4.16

MgCl2.6H2O

0.1

0.49

MgSO4.7H2O

0.1

0.40

CaCl2

0.14

1.26

TABLA N 1
LNEAS CELULARES Y MEDIOS DE CULTIVO RECOMENDADOS POR LA ATCC

TABLA N 2
LINEAS CELULARES UTILIZADAS PARA EL AISLAMIENTO DE DIFERENTES TIPOS DE VIRUS

REFERENCIAS:

Eagle H. Amino acid metabolism in mammalian cell cultures. Science. 1959; 130 (3373):
432-437.
LockartRz Jr, Eagle H. Requirements for growth of single human cells. Science. 1959; 129
(3344): 252-254.
Dulbecco R, Freeman G. Plaque production by the polyoma virus. Virology. 1959; 8(3): 396397.
Dulbecco R, Vogt M. Plaque formation and isolation of pure lines with Poliomyelitis
viruses. J. Exp. Med. 1954;98: 167-182.
Hanks JH Wallace RE. Relation of Oxygen and Temperature in the Preservation of Tissues
by Refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1949; 71: 196-200.
Moore GE, Gerner RE, Franklin HA. Culture of normal human leukocytes. JAMA. 1967;
199(8): 519-524.
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