VALIDACIN DEL MTODO PARA EL ANLISIS DE COCANA, OPIACEOS Y SUS PRINCIPALES ADULTERANTES POR CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRA

DE MASAS (GC- MS), EN EL INSTITUTO NACIONAL DE MEDICINA LEGAL Y CIENCIAS FORENSES

GERSON OSWALDO BUENO GARCIA JOSE DARIO SALAZAR GRISALES

UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGAS ESCUELA DE QUMICA QUMICA INDUSTRIAL PEREIRA 2012

VALIDACIN DEL MTODO PARA EL ANLISIS DE COCANA, OPICEOS Y SUS PRINCIPALES ADULTERANTES POR CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRA DE MASAS (GC- MS), EN EL INSTITUTO NACIONAL DE MEDICINA LEGAL Y CIENCIAS FORENSES

Estudiantes: GERSON OSWALDO BUENO GARCIA Cdigo: 1112763364 JOSE DARIO SALAZAR GRISALES Cdigo: 1088257147

TRABAJO DE GRADO Requisito final para optar al ttulo de Qumico Industrial

Directores: Norma Patricia Durn Vctor Hugo HernndezMuoz

UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGAS ESCUELA DE QUMICA QUMICA INDUSTRIAL PEREIRA 2012

TABLA DE CONTENIDO

1. 2. 3. 4.

INTRODUCCIN ...................................................................................................... 10 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................... 12 JUSTIFICACIN ...................................................................................................... 14 OBJETIVOS ............................................................................................................. 16 4.1. OBJETIVO GENERAL........................................................................................... 16 4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS ................................................................................. 16

5.

MARCO TEORICO ................................................................................................... 17 5.1 SUSTANCIAS DE ABUSO. .................................................................................... 17 5.2 PANORAMA GENERAL ........................................................................................ 19 5.3 SITUACIN ACTUAL. ............................................................................................ 20 5.4 CROMATOGRAFIA DE GASES............................................................................. 22 5.4.1 VENTAJAS DE LA CROMATOGRAFIA DE GASES (GC) . ............................. 24 5.4.2 DESVENTAJAS DE LA CROMATOGRAFA DE GASES................................ 25 5.4.3 DESCRIPCION DEL CROMATGRAFO DE GASES ..................................... 26 5.4.3.1 SISTEMAS DE INYECCIN DE MUESTRA. ........................................... 27 5.4.3.2 COLUMNAS. ............................................................................................. 31 5.4.3.3 HORNOS O ESTUFAS. ............................................................................ 31 5.4.3.4 DETECTORES. ......................................................................................... 33 5.4.4 ESPECTROMETRA DE MASAS (EM) ............................................................ 33 5.4.4.1 CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRA DE MASAS (CG EM) ............................................................................................... 36 5.4.5 APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA .............................................. 38

5.4.5.1 ANLISIS CUALITATIVO .......................................................................... 38 5.4.5.2 ANLISIS CUANTITATIVO ....................................................................... 39

5.4.6 APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA EN EL CAMPO FORENSE (ESTUPEFACIENTES) ............................................................................................. 40 5.5 VALIDACIN ..................................................................................................... 41 IDONEIDAD DEL SISTEMA CROMATOGRFICO. ................................... 41 PRECISIN................................................................................................ 43

5.5.1 5.5.2

5.5.3 EXACTITUD. .................................................................................................. 45 5.5.5 6. LINEALIDAD Y RANGO. ............................................................................ 49

METODOLOGA ....................................................................................................... 52 6.1 PREPARACIN DE ESTNDARES ...................................................................... 52 6.2 PREPARACIN DE LA MUESTRA ........................................................................ 54 6.3 ESTANDARIZACIN DEL MTODO CROMATOGRAFICO .................................. 54 Sistema de idoneidad ............................................................................................... 54 6.4 VALIDACIN DEL MTODO ................................................................................. 54 6.4.1 Selectividad ..................................................................................................... 55 6.4.2 Especificidad.................................................................................................... 55 6.4.3 Repetibilidad .................................................................................................... 55 6.4.4 Precisin Intermedia ........................................................................................ 55 6.4.5 Lmite de Deteccin ......................................................................................... 55 6.4.6 Linealidad para cocana ................................................................................... 55 6.4.7 Exactitud .......................................................................................................... 56 7.1 Estandarizacin del mtodo ................................................................................... 56 Condiciones cromatogrficas .................................................................................... 56 7.1.1 Estabilidad Estndar Interno Tetracosano .................................................... 57 7.1.2 7.2 Sistema de idoneidad ................................................................................. 58

VALIDACION ..................................................................................................... 61 Especificidad .............................................................................................. 61

7.2.1

7.2.2 7.2.3 7.2.4

Selectividad ................................................................................................ 63 Repetibilidad ............................................................................................... 64 Precisin intermedia ................................................................................... 65

7.2.4.1 Precisin intermedia Morfina ..................................................................... 65 7.2.4.2 7.2.4.3 7.2.4.4 7.2.7 Precisin intermedia Herona............................................................... 67 Precisin intermedia Cocana .............................................................. 68 Precisin intermedia Cocana con relacin de reas ........................... 70

Lmite de deteccin .................................................................................... 72 Lmite de deteccin Herona ................................................................ 72 Lmite de deteccin Cocana ............................................................... 74 Lmite de deteccin Morfina ................................................................. 76

7.2.5.1 7.2.5.2 7.2.5.3

7.2.6 LINEALIDAD .................................................................................................... 77 7.2.7 8 9 10. Exatitud ...................................................................................................... 79

CONCLUSIONES ..................................................................................................... 81 BIBLIOGRAFA......................................................................................................... 82 ANEXOS ............................................................................................................... 84

NDICE DE TABLAS

Tabla 1. Parmetros test ANOVA .................................................................................... 45 Tabla 2. Parmetros t-student......................................................................................... 51 Tabla 3. Condiciones cromatogrficas ........................................................................... 56 Tabla 4. Estabilidad estndar interno con los tiempos de retencin. ................................ 57 Tabla 5. Criterios de aceptacin para los parmetros cromatogrficos ............................ 58 Tabla 6. Resultados de los parmetros cromatogrficos................................................ 58 Tabla 7. Resultados de los parmetros cromatogrficos.................................................. 59 Tabla 8. Tiempos de retencin de cada sustancia analizada individualmente. ................. 61 Tabla 9. Datos obtenidos para los tiempos de retencin de cada sustancia en mezcla ... 63 Tabla 10. Datos obtenidos para el anlisis de repetibilidad. ............................................. 64 Tabla 11. Datos obtenidos para el anlisis de precisin intermedia para morfina. ........... 65 Tabla 12. Datos obtenidos para el anlisis ANOVA para morfina .................................... 66 Tabla 13. Datos obtenidos para el anlisis de precisin intermedia para herona ............ 67 Tabla 14. Datos obtenidos para el anlisis ANOVA para herona. ................................... 68 Tabla 15. Datos obtenidos para el anlisis de precisin intermedia para cocana ............ 68 Tabla 16. Datos obtenidos para el anlisis de ANOVA para cocana ............................... 70 Tabla 17. Datos obtenidos para el anlisis de precisin intermedia para cocana con relacin reas cocana/tetracosano. ................................................................................ 70 Tabla 18. Datos obtenidos para el anlisis ANOVA para cocana relacin reas. ............ 72 Tabla 19. Datos obtenidos de reas para cada concentracin de herona. ...................... 72 Tabla 20. Datos obtenidos de la desviacin de las reas para cada concentracin de herona. ........................................................................................................................... 73 Tabla 21. Datos obtenidos de reas para cada concentracin de cocana....................... 74 Tabla 22. Datos obtenidos de la desviacin de las reas para cada concentracin de cocana. ........................................................................................................................... 75 Tabla 23. Datos obtenidos de reas para cada concentracin de morfina. ...................... 76 Tabla 24. Datos obtenidos de la desviacin de las reas para cada concentracin de Morfina ............................................................................................................................ 77 Tabla 25. Datos obtenidos para linealidad cocana. ......................................................... 77 Tabla 26. Datos obtenidos para el anlisis ANOVA de linealidad. ................................... 78

Tabla 27. Datos obtenidos para el anlisis t-student de linealidad. .................................. 78 Tabla 28. Datos obtenidos para el calculo de exactitud ................................................... 79

NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructura qumica de la cocana. ..................................................................... 17 Figura 2. Esquema bsico de un cromatgrafo. ............................................................... 26 Figura 3. Esquema de un puerto de inyeccin por vaporizacin instantnea tpico .......... 28 Figura 4. Vlvula rotatoria de seis vas ............................................................................ 28 Figura 5. Efecto de la temperatura sobre los cromatogramas. a) Temperatura programada. b) Isotermo ...................................................................................................................... 32 Figura 6. Fuente de ionizacin ......................................................................................... 34 Figura 7. Reaccin global para producir el ion molecular. ................................................ 36 Figura 8. Curva lmite deteccin herona ......................................................................... 73 Figura 9.Curva de extrapolacin a cero para el blanco para herona. .............................. 73 Figura 10. Curva lmite de deteccin cocana. ................................................................. 74 Figura 11. Curva de extrapolacin a cero para el blanco para cocana. ........................... 75 Figura 12. Curva lmite de deteccin morfina. .................................................................. 76 Figura 13. Curva de extrapolacin a cero para el blanco para morfina. ........................... 76 Figura 14. Curva linealidad cocana. ................................................................................ 78

NDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Especificidad..................................................................................................... 84 Anexo 2. Sistema idoneidad - Resolucin y factor de selectividad ................................... 84 Anexo 3. Sistema idoneidad Platos Tericos ................................................................ 85 Anexo 4. Repetibilidad ..................................................................................................... 86 Anexo 5. Precisin intermedia Morfina............................................................................. 88 Anexo 6. Precisin intermedia Herona ............................................................................ 88 Anexo 7. Precisin intermedia Cocana ........................................................................... 89 Anexo 8. Precisin intermedia Cocana Relacin reas .................................................. 89 Anexo 9. Lmite de deteccin Herona ............................................................................. 90 Anexo 10. Lmite de deteccin Morfina ............................................................................ 90 Anexo 11. reas Cocana y tetracosano para el lmite de deteccin ................................ 90 Anexo 12. Relacin de reas de cocana y tetracosano para el calculo del Limite de deteccin de cocana ....................................................................................................... 90 Anexo 13.Linealidad cocana curva cuantificacin ........................................................... 91

1. INTRODUCCIN

En el presente trabajo se pretende la identificacin de cocana, opiceos y sus principales adulterantes, por medio de la estandarizacin y validacin de una metodologa analtica por Cromatografa de Gases acoplado a Espectrometra de Masas (CG-MS), en muestras solidas incautadas. Esta validacin se lleva a cabo de acuerdo a la norma ISO IEC 17025:2005, la cual establece que para laboratorios de ensayo y calibracin se debe validar los mtodos no normalizados, los mtodos que disea o desarrolla, los mtodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, as como las ampliaciones y modificaciones de los mtodos normalizados, para confirmar que los mtodos son aptos para el fin previsto. Para desarrollar esta validacin, se determinan los siguientes parmetros: idoneidad del sistema cromatogrfico, especificidad, selectividad, precisin (repetibilidad y precisin intermedia), lmite de deteccin, lmite de cuantificacin, para cocana, herona y morfina.

Estas sustancias son de gran impacto para la sociedad ya que representan una amenaza para la sociedad y para la institucionalidad democrtica, no slo en nuestro pas, sino en la comunidad internacional. Por eso Colombia ha venido planteando y exigiendo una lucha decidida e integral, fundada en el principio de corresponsabilidad. El problema demanda acciones de la comunidad internacional por ser un fenmeno transnacional y complejo, a fin de dar solucin a actividades como el contrabando y el desvo de insumos qumicos, el cultivo, el procesamiento, la distribucin, el consumo de drogas, el lavado de activos y el comercio clandestino de armas.

En el plano interno, los compromisos adquiridos en virtud de la mencionada convencin se presentan en el Plan Nacional de Lucha contra las Drogas: Colombia 1998 - 2002, con base en los principios de la Constitucin de 1991 que busca impulsar los postulados de equidad, apertura democrtica, descentralizacin, autogestin, convivencia ciudadana y planeacin participativa.

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Es as como las acciones que Colombia viene realizando para solucionar este problema responde a la poltica trazada por el Gobierno Nacional y al desarrollo de los compromisos adquiridos por el pas con la comunidad internacional.

En el plano internacional el marco de referencia lo constituyen la Convencin de las Naciones Unidas contra el Trfico Ilcito de Estupefacientes y Sustancias Sicotrpicas, suscrita en Viena en 1988, la Estrategia Antidrogas en el Hemisferio y el Plan Mundial de Accin, aprobado durante la Sesin Especial de la Asamblea General de las Naciones Unidas de junio de 1998.

A estas acciones poltico-militares se suma la comunidad cientfica, Organismos como la DEA (US DrugEinforcementAdministration) de EE.UU. establecen las formas de anlisis y muestran los casos que se van presentando de consumo de mezclas de drogas y las innovaciones de los consumidores, es por ello que desde hace ms de una dcada se han desarrollado o mejorado varias tcnicas y mtodos de anlisis simultneos para estas sustancias ilcitas como lo son las sustancias de abuso en muestras clnicas y forenses con diferentes matrices.

La Cromatografa de Gases en combinacin con la Espectrometra de Masas es una buena opcin para el anlisis de estas sustancias ya que esta tcnica sigue siendo accesible, sencilla, menos costosa y de alta reproducibilidad, la cual ha presentado mejores resultados, debido a esto los mtodos basados en esta tcnica analtica se estn implementando alrededor del mundo para ayudar a los entes judiciales de cada pas.

El soporte tcnico cientfico en la investigacin forense requiere la validacin de los mtodos analticos, los informes de investigacin de laboratorio se garantizan por medio de los parmetros descritos anteriormente; estos resultados pueden ser solicitados por las autoridades dentro de una investigacin judicial.

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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Una de las epidemias sociales de mayor y ms rpida extensin de nuestro siglo es el problema mundial que se presenta con el uso indebido de las drogas; dicho fenmeno representa una grave amenaza para la salud y el bienestar de los seres humanos a la vez que resquebraja las bases econmicas, culturales y polticas de la sociedad. La trascendencia actual y las lamentables consecuencias del uso indebido de drogas sobrepasan los limites convencionales de la salud humana; no slo trae consigo el deterioro personal, familiar y de comunidades completas, sino que a dicho fenmeno se asocian factores vinculados al trfico ilcito, contribuyendo a distorsionar la economa y las finanzas de los estados, la aparicin de nuevas figuras delictivas, la mafia y el crimen organizado se convierte en un serio obstculo para el desarrollo armnico de las relaciones internacionales. [1] Colombia sufre los problemas que originan las drogas y el trfico de las mismas, desde hace dcadas; para luchar contra este fenmeno los gobiernos colombianos han decretado leyes que buscan terminar con este flagelo para la sociedad, ms concretamente la ley 30 del ao 1986, la cual penaliza las acciones delictivas relacionadas con la produccin, distribucin y comercializacin de estupefacientes. Debido a que la pena que impone la ley 30 para las personas que sean encontradas culpables de infringir esta ley, varia dependiendo de la cantidad y del tipo estupefaciente, se debe realizar un anlisis que le brinde a la justicia las pruebas necesarias para dictar la condena pertinente o la absolucin segn sea el caso.

Uno de los organismos encargados de realizar los anlisis de estupefacientes en Colombia es el Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses. Los laboratorios para anlisis del Instituto deben contar con un amplio grupo de recursos fsicos, locativos, instrumentales y humanos, que le permitan asegurar la obtencin de resultados altamente confiables. Si las medidas que se realizan en el mbito de anlisis no estn respaldadas por un adecuado proceso de muestreo, de calibracin, de instrumentos, de control en la calidad y manejo adecuado de reactivos y personal capacitado, etc.; no se podra

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garantizar de alguna manera el reporte de resultados veraces y su propsito principal, la produccin de informes periciales de excelente calidad como respaldo para impartir justicia[2].

Para garantizar que los resultados de los estudios realizados sean confiables, los mtodos utilizados deben estar validados como se indica en la norma ICONTEC 17025, Cul es la metodologa y parmetros a evaluar que se deben utilizar para la validacin de un mtodo analtico para la determinacin de cocana y opiceos con sus principales adulterantes, por medio de la Cromatografa de Gases acoplado a Espectrometra de Masas (GC - MS)?

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3. JUSTIFICACIN

El concepto de calidadha ido evolucionando desde su implementacin, en sucesivas generaciones desde una estrategia bsica para la satisfaccin del cliente con una mejora continua delservicio que se presta.Las mejoras en los servicios prestados se consiguen y se garantizan mediante un Sistema de Gestin de Calidad, que consiste en un conjunto de polticas, procedimientos y herramientas que hacen posible gestionar sta de una manera eficaz y eficiente para conseguir los objetivos que se han planteado.

Un laboratorio, el cual se constituye como una organizacin, para demostrar su competencia tcnica al realizar ensayos y calibraciones debe implementar un Sistema de Calidad con base en la norma ISO IEC 17025:2005;por medio de esta se establece requisitos para los factores que afectan la exactitud y la confiabilidad de los resultados, en los laboratorios de ensayo y calibracin.

La confiabilidad en los anlisis de laboratorio juega un papel decisivo en un proceso penal. Slos resultados obtenidos no son fiables, se pueden producir errores al momento de dictaminar una sentencia por parte de los jueces. Mediante la validacin se puede asegurar que un mtodo es adecuado para el propsito que ha sido diseado, es decir, resolver un problema analtico particular, dando validez a los resultados emitidos por el laboratorio.

En este caso se requiere tener validado un mtodo para determinar sustancias prohibidas en la ley 30 del ao 1986 [3], de las cuales, unas de las principales soncocana y opiceos, debido al grave problema social que acarrean los temas relacionados con la comercializacin y el consumo de las mismas.

La tcnica que se utilizar para la determinacin de estas sustancias ilcitas esla Cromatografa de Gases acoplada a Espectrometra de Masas, ya que es el procedimientoanalticoms confiable y especifico actualmente, recomendado por la comunidad cientfica internacional.

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Por tales razones, este trabajo pretende establecer los parmetrosde validacin para la tcnica instrumental de Cromatografa de Gases acoplado a Espectrometra de Masas) [4], para el anlisis de cocana, opiceos y sus principales adulterantes, en muestras slidas incautadas, en el Laboratorio de Estupefacientes del Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses - Regional Occidente, a fin de obtener datos de alta calidad, por medio del uso de mediciones analticas que sean precisas, confiables y adecuadas para tal fin.

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4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

Validar el mtodo para la determinacin de cocana, opiceos y sus principales adulterantes en muestras slidas incautadas, por Cromatografa de Gases acoplado a Espectrometra de Masas (CG-MS), en el Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses- Regional Occidente de la ciudad de Pereira.

4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

Estandarizar las condiciones cromatogrficas y de manejo de muestras, que permitan obtener los mejores resultados para la deteccin de los analitos de inters.

Desarrollar un mtodo de anlisis que proporcione el rigor estadstico para la determinacin de cocana, opiceos y sus principales adulterantes en muestras slidas incautadas, por Cromatografa de Gases acoplada a

Espectrofotometra de Masas.

Determinar de manera experimental y para las condiciones del equipo AGILENT GC 6890 N con Detector de Masas AGILENT 5973 C, los valores de los siguientes parmetros: Exactitud, linealidad, selectividad,

especificidad,lmite de deteccin, lmite de cuantificacin, repetibilidad, reproducibilidad y precisin intermedia.

Documentar los resultados de ensayo con los cuales se determinaron los parmetros estadsticos mediante un Reporte de Validacin que de un mejor soporte analtico y mayor credibilidad al Laboratorio, al momento de emitir un Informe Pericial y sustentarlo ante un estrado judicial.

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5. MARCO TEORICO

5.1 SUSTANCIAS DE ABUSO [5].

Las sustancias de abuso son sustancias psicoactivas o psicotrpicas, capaces de alterar el estado de conciencia, el humor, los sentimientos, la conducta, las motivaciones y los procesos del pensamiento del individuo que las consume, traducindose clnicamente en estimulacin o depresin del sistema nervioso central o modificando la percepcin. El uso inapropiado de cualquiera de estos compuestos por lo general ocurre de manera

intencional, pero en ocasiones pudiera desarrollarse inadvertidamente por el sujeto. Casi siempre, aquellas sustancias que afectan el comportamiento y que adems producen efectos placenteros, tienden a consumirse en exceso. La autoadministracin de estas drogas de abuso, en forma repetida o episdica, interfiere con la salud y el desempeo social y laboral del individuo. A continuacin se nombran algunas de las sustancias deabuso mas utilizadas

Cocana Es un alcaloide extrado de las hojas de la Erithroxilon coca o de sus diferentes variedades, o mediante sntesis a partir de la ecgonina o de sus derivados. Es una base aminoalcoholica estrechamente relacionada con la tropina (aminoalcohol de la atropina) y tiene la estructura fundamental de los anestsicos locales sintticos. La cocana es la benzoilmetilecgonina; es un ester del acido benzoico y una base que contiene nitrgeno, cuya estructura qumica es:

Figura 1. Estructura qumica de la cocana.

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Es cristalina, incolora o blanca (cocana clorhidrato) o un polvo cristalino inodoro que funde entre 36 y 98 grados Celcius, su solucin saturada es alcalina a la prueba de tornasol. Se empleo en medicina como anestsico tpico al 1 o 2%

La dosis mortal por va endovenosa para el adulto es de un gramo por toxicidad directa sobre el miocardio. La dosis promedio de abuso por la va inhalatoria o por va oral se estima entre (8,7-14) mg pero puede ser del orden de los 200 mg. Una dosis disipa el hambre, imparte una sensacin de bienestar, aumenta la resistencia fsica, al disminuir la sensacin de fatiga. Existe una correlacin entre los efectos

sicolgicos (euforia, placidez y anorexia) y los fsicos (taticardia, hipertermia, aumento de tensin arterial). El uso prolongado se asocia con enflaquecimiento, insomnio, ansiedad, ideas referenciales, sensacin de parestesias (insectos que reptan bajo la piel) y alucinaciones en particular visuales. Opiceos La amapola o adormidera es la fuente del opio; corresponde al papaversomniferum la especie mas importante de la familia de las papaverceas, que son plantas herbceas; sus tallos, y flores poseen un sistema de canales muy desarrollados por el cual fluye el ltex; de sus semillas (maw-seeds) que no contienen opio, se obtiene aceite. Se ha cultivado ampliamente en China, Irn, Laos y en general en el sudeste asitico; en Amrica se haba conocido su existencia en Mjico y Guatemala. En Colombia empez a demostrar su cultivo con fines de narcotrfico desde 1991. Por sus caractersticas su hbitat es por encima de los 2000 metros en tierras paramunas, lo que de por s encierra un serio problema ecolgico por la deforestacin. De su ltex se pueden obtener cerca de 25 alcaloides tales como morfina, codena, tebana, papaverina, haceina, narcitina, y por acetilacin de la morfina esta puede transformarse en herona. Esos alcaloides son fuente de drogas medicinales de gran importancia y uso preciso, ora como analgsico, antitusivos, antiespasmdicos o antidiarreicos y tambin con fines de narcotrfico, el opio, la morfina y la herona. Todos los derivados naturales y no naturales de los opiceos inducen dependencia psquica y fsica, tolerancia, sndrome de abstinencia y con alguna frecuencia muerte por sobredosis. Farmacolgicamente, adems de sus efectos analgsicos, llevan a sopor y es constante la depresin respiratoria; su uso en medicina tiene precisas y preciosas

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indicaciones, pero su abuso es nefasto. En el consumidor de opiceos suelen presentarse miosis, constipacin, depresin respiratoria y trastornos menstruales que llevan hasta la amenorrea en mujeres consumidoras crnicas.

5.2 PANORAMA GENERAL [6].

El narcotrfico es un fenmeno transnacional, dinmico y mvil que demanda compromisos globales y especficos para combatirlo. La globalizacin del narcotrfico hace cada vez ms compleja la represin debido a los imperativos de libre circulacin, rapidez y multilateralismo del comercio mundial, por tanto, se debe adoptar un verdadero equilibrio de responsabilidades de todos los pases que de algn modo hacen parte de la cadena de drogas ilcitas. En trminos generales, los efectos del narcotrfico han sido devastadores en los mbitos sociales, econmicos y polticos por lo que abordarlo es un reto nacional e internacional. El resultado mas notable lo ha realizado Colombia al reducir las reas cultivadas, sin embargo, es altamente importante atacar las ganancias financieras como rea de gran vulnerabilidad para los narcotraficantes. Segn estimaciones de Naciones Unidas, el comercio de las drogas ilcitas alcanzan una suma mayor a la del valor de la industria internacional del petrleo y del gas, y el doble de la automotriz. El Fondo Monetario Internacional, FMI, calcula que las transacciones de lavado de dinero equivalen del 2% a 5% de Producto Interno Bruto global, lo cual representa cerca del 8% del valor total del comercio internacional. Una parte sustancial de este dinero proviene del narcotrfico. Las multimillonarias ganancias de este comercio se lavan diariamente en el sistema financiero internacional.

En lo relativo al consumo mundial, las estimaciones por parte del Programa de las Naciones Unidas para la Fiscalizacin de Drogas, PNUFID muestran que sigue en aumento. Se estiman 200 millones de consumidores, equivalente al 3,4 % de la poblacin mundial o al 4,7% de la poblacin de 15 aos. La sustancia mas consumida es la cannabis, seguida por estimulantes de tipo anfetamnico, cocana y los opiceos.

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5.3 SITUACIN ACTUAL [7].

Durante los ltimos aos Colombia ha librado una lucha decidida e integral contra el fenmeno de las drogas ilcitas. Han sido muchos los costos econmicos y humanitarios que ha realizado el pueblo colombiano para enfrentar el problema del narcotrfico. Los esfuerzos y gastos financieros han sido enormes; de los primeros dan testimonio los mltiples instrumentos legales puestos en prctica y los compromisos internacionales asumidos, los permanentes operativos policiales y militares y las muchas decisiones adoptadas; de los segundos resultan de sumar las ingentes y cada vez mayores cantidades de recursos oficiales dedicados a este fin, el impacto que sobre muchas de las actividades econmicas ha tenido la industria de las drogas ilcitas, el deterioro de la moral de funcionarios pblicos que sucumben ante la coaccin o la corrupcin y, lo que es ms lamentable, las vidas de policas, soldados, jueces, periodistas y dems personas de bien que han cado en esta lucha.

El fenmeno de las drogas ilcitas representa una clara amenaza para las sociedades y para la institucionalidad democrtica, no slo en el pas sino en la comunidad internacional. Por eso Colombia ha venido planteando y exigiendo una lucha decidida e integral, fundada en el principio de la corresponsabilidad. El problema demanda acciones de la comunidad internacional por ser un fenmeno transnacional y complejo, a fin de dar solucin a actividades como el contrabando y el desvo de insumos qumicos, el cultivo, el procesamiento, la distribucin, el consumo de drogas, el lavado de activos y el comercio clandestino de armas.

Es as como las acciones que Colombia viene realizando para solucionar este problema responde a la poltica trazada por el Gobierno Nacional y al desarrollo de los compromisos adquiridos por el pas con la comunidad internacional. En el plano interno, los compromisos adquiridos en virtud de la mencionada convencin se presentan en el Plan Nacional de Lucha contra las Drogas: Colombia 1998 - 2002, con base en los principios de la Constitucin Poltica de 1991 que busca impulsar los postulados de equidad, apertura democrtica, descentralizacin, autogestin, convivencia ciudadana y planeacin participativa. Con base en las anteriores disposiciones, Colombia ha establecido nuevos mecanismos bilaterales para reforzar la cooperacin en materias como el intercambio de

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informacin, la realizacin de operaciones de control de reas martimas y areas y la asistencia judicial, entre otros.

En la Cumbre Iberoamericana de Jefes de Estado y de Gobierno en Oporto, Portugal, celebrada en octubre de 1998, Colombia obtuvo el apoyo incondicional de todos los pases para el proceso de paz que inicio. Dentro de este esfuerzo, el Gobierno continuar con los compromisos internacionales de cooperacin, relacionados con la erradicacin de cultivos ilcitos, los cuales se consideran que han sido eficaces. Sin embargo, el propsito es que este objetivo vaya acompaado de un fortalecimiento al programa de sustitucin de cultivos, sin precedentes, que ofrezca una solucin definitiva a este problema, pues ms all de constituirse en un compromiso internacional, obedece a la conviccin moral de que el pas no puede encontrar en el narcotrfico la base para su crecimiento econmico.

En el plano internacional el marco de referencia lo constituyen la Convencin de las Naciones Unidas Contra el Trfico Ilcito de Estupefacientes y Sustancias Psicotrpicas suscrita en Viena en 1988, la Estrategia Antidrogas en el Hemisferio y el Plan Mundial de Accin aprobado durante la Sesin Especial de la Asamblea General de las Naciones Unidas de junio de 1998. En consecuencia, el Plan Nacional de Lucha contra las Drogas: Colombia 1998- 2002 constituye el marco sobre el cual el Estado colombiano est afrontando, con el concurso de las entidades gubernamentales, no gubernamentales, la comunidad organizada y la poblacin en general, de una manera integral las causasy manifestaciones del problema de la droga. El Plan Nacional de Lucha contra las Drogas: Colombia 1998-2002 tiene como objetivo fundamental reducir progresiva y sistemticamente las causas y manifestaciones del problema de las drogas en forma articulada a la poltica de paz. Fundamentada en los principios de integralidad, corresponsabilidad, consenso, autonoma, multilateralidad y contenido social. El Plan propone diferentes reas de intervencin frente a las cuales se han formulado seis objetivos estratgicos producto de los anlisis de las manifestaciones, de las causas estructurales y de los factores asociados, as como de los campos de accin hasta ahora identificados en los diferentes esfuerzos de planificacin y de experiencias obtenidas.

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5.4 CROMATOGRAFIA DE GASES

La cromatografa se introduce en los mtodos de separacin en 1903 y su posterior desarroll y evolucin se produce hacia 1930. La primera persona que defini la cromatografa fue el botnico ruso Miguel Tswett (1872-1913) en 1906 y eligi el trmino cromatografa procedente de las palabras griegas khromatos (color) y graphos (escrito) ya que utiliz el trmino cromatografa para describir la separacin de pigmentos vegetales en distintas zonas coloreadas. Aunque la mayor parte de las separaciones que se realizan actualmente son de compuestos incoloros, el trmino inicial cromatografa se ha mantenido [8]. Segn la Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada (IUPAC) la cromatografa es un mtodo fsico de separacin en los cuales los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una que permanece inmvil (fase estacionaria) mientras que la otra (fase mvil) se mueve en una direccin determinada a travs de la primera. Este tipo de proceso cromatogrfico es llamado elucin [8]. La separacin entre dos sustancias empieza cuando una es retenida ms fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse ms rpidamente en la fase mvil. Las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenmenos de interaccin que se dan entre las dos fases y que pueden ser: Adsorcin: Es la retencin de una especie qumica por parte de los puntos activos de la superficie de un slido quedando delimitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. Absorcin: Es la retencin de una especie qumica por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera, absorcin pura, o a reaccionar qumicamente con la misma, absorcin con reaccin qumica, considerando ambas como un fenmeno msico y no superficial [8][9].

Existen diversos tipos de cromatografa y para su clasificacin se puede atender a diversos criterios. Uno de stos es segn la forma de las fases, mvil y estacionaria, se ponen en contacto, de modo que podemos distinguir dos tipos de cromatografa, plana, cuando la fase estacionaria se deposita sobre una superficie abierta (papel, lmina de

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plstico, vidrio o metal) y en columna cuando la fase estacionaria se deposita en el interior de un tubo estrecho o columna (vidrio, acero, slice, etc) [10]. En funcin de la naturaleza de las fases existen distintos tipos de cromatografa, en general nos encontramos tres tipos: Cromatografa de gases (GC), cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) y cromatografa de lquidos (LC), en funcin de que la naturaleza de la fase mvil sea gas, fluido supercrtico o liquido, respectivamente. A su vez, en funcin del tipo de fase estacionaria y de las interacciones que se establecen entre los componentes a separar y ambas fases, nos encontramos una variedad de modalidades que incluyen cromatografa liquido-liquido (LLC), cromatografa en capa fina (TLC), cromatografa liquido-slido (LSC), cromatografa de intercambio inico (IEC), cromatografa de exclusin por tamaos (SEC), cromatografa de afinidad (AC), cromatografa de fases enlazadas (BPC) y cromatografa en capa fina de alta resolucin (HTLC) [10].

En cromatografa de gases (GC), la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de un gas inerte, y a diferencia de la mayora de los tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases: la cromatografa gas - slido (GSC) y la cromatografa gas-lquido (GLC). La cromatografa gas - lquido tiene gran aplicacin en todos los campos de la ciencia y su denominacin se abrevia normalmente como cromatografa de gases (GC) [10].

La cromatografa gas - slido se basa en una fase estacionaria slida en la cual se produce la retencin de los analitos como consecuencia de la adsorcin fsica. La cromatografa gas - slido ha tenido una aplicacin limitada debido a la retencin semipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos de elucin con colas (una consecuencia del carcter no lineal del proceso de adsorcin), de modo que esta tcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular. Es por ello que se trata slo brevemente en la final de este tema. La cromatografa gas - lquido se basa en la distribucin del analito entre una fase mvil gaseosa y una fase lquida inmovilizada sobre la superficie de un slido inerte. El

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concepto de cromatografa gas - lquido fue enunciado por primera vez, en 1941, por Martin y Synge, quienes fueron tambin los responsables del desarrollo de la cromatografa de distribucin lquido -lquido. Ms de una dcada tuvo que pasar, sin embargo, antes de que la importancia de la cromatografa gas - lquido se demostrara experimentalmente. Tres aos ms tarde, en 1955, apareci en el mercado el primer aparato comercial para cromatografa gas - lquido. Desde entonces, las aplicaciones de esta tcnica han crecido de una forma espectacular. Se ha estimado que unos 200.000 cromatgrafos de gases estn actualmente en uso por todo el mundo [10].

5.4.1VENTAJAS DE LA CROMATOGRAFIA DE GASES (GC) [9].

En muy poco tiempo la cromatografa de gases, se ha convertido en la tcnica principal para la separacin y anlisis de compuestos voltiles. Ha sido usada para analizar gases, lquidos y slidos (este ultimo usualmente se disuelven en solventes voltiles). Tanto material orgnico como inorgnico pueden ser analizados, y el peso molecular puede estar en un rango de 2 hasta 1.000 Daltons. Las principales ventajas de la cromatografa de gases son: alta resolucin, velocidad, sensibilidad, sencillez y resultados cuantitativos. Alta Resolucin: La CG puede generar miles de platos tericos en unos pocos minutos. Los ismeros con puntos de ebullicin muy prximos que no pueden 22 separarse por destilacin se separan fcilmente mediante la cromatografa de gases. Adems la CG se presta a usos mas variados que la mejor columna de destilacin, ya que la columna cromatogrfica puede sustituirse fcilmente. Esto permite la separacin selectiva debido a solubilidades diferentes, aun cuando los puntos de ebullicin estn muy cercanos. Como hay numerosas columnas, se puede escoger entre ellas, lo que confiere variedad a la gama de muestras que pueden manejarse. Velocidad: Normalmente, el anlisis por CG tarda unos minutos; muchas separaciones tiles se completan en 10 minutos. Con altas presiones se han terminado anlisis completos en apenas unos segundos. Sin embargo, en la mayora de los anlisis de laboratorio este ahorro en tiempo no reduce apreciablemente el tiempo total involucrado en la toma de la muestra, el anlisis cromatogrfico y el clculo de los resultados. En consecuencia no se ha destacado mucho la rapidez de estos anlisis. Basta sealar que la CG permite lograr rpidamente buenos datos analticos.

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Sensibilidad: Una de las razones principales por las que se usa ampliamente la CG en los anlisis es la sensibilidad conseguida. El detector de conductividad trmica puede fcilmente medir microgramos. El detector de ionizacin de llama fcilmente mide nanogramos (10-9 g), y los detectores mas selectivos como el de captura de electrones y el detector fotomtrico de llama alcanzan los picogramos (10-12g). Debido a esta sensibilidad, la CG es un mtodo preferido para el anlisis de trazas, particularmente plaguicidas, herbicidas y contaminantes orgnicos en el aire y del agua. Otra ventaja de esta extrema sensibilidad es la pequeez de la muestra requerida. Para completar un anlisis bastan unos microlitros. En una aplicacin forense de la CG fue suficiente una partcula de pintura para identificar el color y modelo de automvil comprometido en un accidente. Sencillez: Tanto las tcnicas como el instrumental de la cromatografa de gas son relativamente sencillos y fciles de comprender. Con solo unos pocos das de trabajo de laboratorio los estudiantes son capaces de obtener datos analticos significativos. Resultados Cuantitativos: Una ventaja importante de la CG es que permite obtener muy buenos resultados cuantitativos. Sin embargo, la exactitud es funcin de muchos factores. Se puede obtener buena exactitud en una amplia gama de concentraciones de la muestra, desde miligramos hasta nanogramos.

5.4.2 DESVENTAJAS DE LA CROMATOGRAFA DE GASES

La cromatografa de gases presenta alguna limitaciones o desventajas, dentro de las cuales las principales son: solo se pueden manipular muestras voltiles, por lo cual se hace necesario una preparacin adecuada o tratamiento especial para compuestos poco voltiles, generalmente los de peso molecular superior a 300 uma, compuestos sensibles a una elevacin de la temperatura incluso moderada (determinados compuestos de inters biolgico). A menudo la cromatografa de gases se emplea para confirmar de la presencia o ausencia de un compuesto en una muestra determinada. Esto se lleva a cabo por comparacin del cromatograma de la sustancia pura con el de la muestra, siempre que las condiciones para la obtencin de ambos sean idnticas. Una de las dificultades de esta comparacin es que puede haber diferentes compuestos que presenten el mismo

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comportamiento

cromatogrfico

bajo

condiciones

idnticas,

lo

que

llevara

identificaciones errneas. En consecuencia, las mejores tcnicas de anlisis cualitativo son aqullas que combinan la capacidad de separacin de la cromatografa con la capacidad de la identificacin de tcnicas como la espectroscopa de masas (tcnicas acopladas) [10].

5.4.3DESCRIPCION DEL CROMATGRAFO DE GASES

Un cromatgrafo es el equipo instrumental para realizar una separacin y cuantificacin mediante cromatografa de elucin en columna.Actualmente, ms de 30 fabricantes de instrumentos ofrecen 130 modelos distintos de equipos de CG, con un precio que varia desde los 30.000 hasta 250.000 dlares. En las ltimas dcadas los fabricantes han mejorado sus componentes agregando primero integradores electrnicos y procesadores de datos basados en un computador. Despus ordenadores para el control automtico de la mayora de parmetros, como temperatura de la columna, caudales e inyeccin de la muestra, y el desarrollo de columnas abiertas que son cantidad de analitos en tiempos relativamente cortos [11]. capaces de separar gran

Figura 2. Esquema bsico de un cromatgrafo.

Los principales elementos que se encuentran en este esquema son:

1. La fase mvil o eluyente (lquido, gas o fluido supercrtico) que tiene como misin transportar a los componentes de la muestra a travs de la fase estacionaria. 2. El sistema de regulacin y medida del flujo o presin de la fase mvil.

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3. El inyector o sistema de introduccin de la muestra en la corriente de la fase mvil. El proceso de introduccin de la muestra en el cromatgrafo comnmente se denomina inyeccin. 4. La columna cromatogrfica, tubo estrecho generalmente de metal o slice fundida, con dimetro interno y longitud variables, en cuyo interior se encuentra la fase estacionaria. Es, por tanto, en su interior donde los componentes de la muestra se separan. La columna puede unirse directamente al inyector y al detector (como en cromatografa de gases, GC) o bien estar conectada a estas otras partes del equipo mediante tubos conectores (como en cromatografa de liquidos de alta eficacia, HPLC). 5. Un sistema de termostatizacion que permite mantener la temperatura de la columna constante. 6. El detector, que es la parte del instrumento que mide de manera continua una propiedad fsica o qumica del fluido que sale de la columna (eluato) y la transforma en una seal elctrica. 7. Un sistema de amplificacin y tratamiento de la seal elctrica generada por el detector, de manera que se obtenga una seal que pueda ser entendida por el analista (por ejemplo, la aparicin del cromatograma en la pantalla del ordenador) [10]. 5.4.3.1SISTEMAS DE INYECCIN DE MUESTRA[11].

El modo estndar, adecuado para aproximadamente 95% de las aplicaciones de las columnas empacadas (o empaquetadas), es la inyeccin directa. La muestra es inyectada con una jeringa hipodrmica a travs de un sptum de goma (o hule) de silicona autosellante, a un alineador de vidrio (glassinsert) contenido en un bloque metlico, donde es vaporizada y barrida hacia la columna. El bloque se calienta a una temperatura que se fija en un valor suficientemente alto para convertir prcticamente en forma instantnea la muestra lquida en vapor. La cantidad de muestra inyectada es del orden de L para lquidos y algo superior para gases.

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Figura 3. Esquema de un puerto de inyeccin por vaporizacin instantnea tpico

Las muestras, lquidas y gaseosas, tambin pueden introducirse con un lazo (o bucle) calibrado, introducindolas despus a la corriente del gas que fluye por medio de una vlvula (Figura 4).

Figura 4. Vlvula rotatoria de seis vas Inyeccin en columnas capilares. Es necesaria una reduccin del volumen de la muestra cuando se trabaja con columnas capilares. Esto se logra mediante un inyector divisor (inyeccin en split), donde generalmente se inyecta una muestra de 1 L pero slo

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entra al capilar 0.01 L; el resto es desechado. Esta tcnica impide la sobrecarga de la columna, pero desperdicia una porcin significativa de la muestra. Cuando se realizan anlisis en cantidades pequeas de muestra con algunos componentes en concentraciones del orden de milsimos de parte por milln, se introducira muy poco material en la columna si para estas muestras se utiliza el divisor. Para ellas se requiere de solvente o inyeccin sin divisin (inyector en splitless). La muestra completa, incluyendo el disolvente, se inyecta en la columna tubular abierta, a travs de un vaporizador instantneo caliente. Se evita un coleo pronunciado del disolvente abriendo hacia la atmsfera el puerto de inyeccin despus de algn tiempo (quiz unos 30s), cuando la mayor parte del disolvente, y esencialmente toda la muestra, entraron en la columna. El tiempo apropiado antes de esa descarga es crtico; si es demasiado corto se produce la prdida de los componentes de la muestra, mientras que si es demasiado largo se produce un pico del disolvente ms grande del necesario, que puede sepultar algunos de los picos de inters. Muestreador automtico. Un muestreador automtico reproduce las inyecciones y medidas manuales. Los frascos para las muestras son de vidrio, desechables, con tapones de sptum con sellado para vapores. El muestreador enjuaga la jeringa con una muestra nueva para lavar las trazas de la muestra anterior, bombea la muestra nueva para humedecer la jeringa y eliminar por completo cualquier burbuja, toma una cantidad de muestra medida con precisin, la inyecta al cromatgrafo de gases. Los muestreadores automticos tienen reproducibilidad mecnica y son consistentemente ms precisos que un cromatografista experimentado. Tambin, la operacin que no requiere atencin personal libera al operador para otras actividades. Muestreo de la cabeza gaseosa. Ms all del anlisis convencional de gases y lquidos de baja viscosidad por CG (cromatografa de gases), algunos casos se manejan ms eficazmente con muestreo de la cabeza gaseosa (vapor sobrenadante, o headspace). Esto es vlido cuando slo interesa el vapor sobre la muestra, como en el caso de los perfumes o los productos alimenticios; con los constituyentes orgnicos voltiles de muestras, como la orina, la respiracin del hombre y muestras ambientales; cuando la muestra es un lquido que normalmente requerira de algn tratamiento antes de la inyeccin, como la sangre, aguas residuales o agua potable, Los picos de los disolventes

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son mucho ms pequeos de lo que seran al inyectar la muestra lquida tal cual. El muestreo de la cabeza gaseosa puede efectuarse sobre muestras con cualquier matriz, siempre y cuando el coeficiente de reparto permita que exista una cantidad suficiente del analito en la fase gaseosa. Desorcin trmica y purga y trampa.Los constituyentes orgnicos voltiles de una muestra (slida o lquida) se pueden purgar o extraer de ella haciendo pasar a travs de la misma una corriente de He y atraparlos en una trampa adsorbente que forma parte del sistema de inyeccin del cromatgrafo y que puede ser de Tenax, carbn activo u otro adsorbente a la temperatura ambiente. En el caso de muestras gaseosas estos compuestos pueden ser atrapados en un tubo de vidrio externo al cromatgrafo, relleno de adsorbente por el que se hace circular mediante bombeo el gas a analizar y que despus son colocados en el sistema de inyeccin del cromatgrafo. En el primero de los casos se trata de sistemas de purga-trampa y en el segundo de desorcin trmica. Calentando esta trampa se desorben los voltiles hasta una precolumna enfriada con nitrgeno lquido. Una vez se ha producido toda la desorcin adsorcin, se calienta en pocos segundos esta precolumna que est unida a la columna cromatogrfica de CG y se inicia el anlisis. Algunos ejemplos de compuestos analizados por purga y trampa son los de los constituyentes orgnicos de la orina, fruta, quesos. Ejemplos de desercin trmica son los anlisis de la respiracin humana y del aire ambiental. Pirlisis. La cromatografa gas - lquido alcanza su lmite prctico cuando la cantidad de energa necesaria para vaporizar la muestra es igual a la que se requiere para romper un enlace carbono-carbono. La tcnica de pirolisis (o fragmentacin trmica controlada) extiende los anlisis por cromatografa de gases a compuestos de tan baja volatilidad como el caucho (o hule), polmeros, pelculas de pintura, resinas, microorganismos, suelos, carbones, textiles y organometlicos. La muestra se introduce en un pirolizador que la calienta a temperatura muy elevada y suficiente para llevar a cabo la descomposicin. Se forman fragmentos voltiles y se introducen automticamente en el cromatgrafo para el anlisis.

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5.4.3.2 COLUMNAS [12].

En cromatografa de gases se usan dos tipos generales de columnas, las empaquetadas, o de relleno y las tubulares abiertas, o capilares. Hasta la fecha, la mayor parte de la cromatografa de gases se ha realizado con columnas de relleno, Sin embargo, en la actualidad esta situacin est cambiando rpidamente, y parece probable que en un futuro prximo, excepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno sern sustituidas por las ms eficaces y rpidas columnas capilares. Las columnas cromatogrficas varan en longitud desde menos de 2 hasta 50 m, o ms. Se construyen de acero inoxidable, vidrio, slice fundida, o Tefln. A fin de poder colocarse en el interior de un termostato, normalmente se configuran como helicoides con dimetros de 10 a 30 cm. En una seccin posterior se encuentra una discusin detallada acerca de las columnas, rellenos de columna y fases estacionarias.

5.4.3.3 HORNOS O ESTUFAS [12].

La temperatura de la columna es una variable importante que para un trabajo preciso ha de regularse a las dcimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno termostatizado. La temperatura ptima de la columna depende del punto de ebullicin de la muestra y del grado de separacin requerido. En la prctica, con una temperatura igual o ligeramente superior al punto de ebullicin promedio de la muestra, se obtienen tiempos de elucin razonables (2 a 30 min). Para muestras con un amplio intervalo de ebullicin, a menudo es conveniente emplear una programacin de temperatura, con lo que se aumenta la temperatura de la columna bien de forma continua bien sea por etapas, al mismo tiempo que tiene lugar la separacin. En la Figura 4 se muestra la mejora de un cromatograma ocasionada por la programacin de temperatura.

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Figura 5. Efecto de la temperatura sobre los cromatogramas. a) Temperatura programada. b) Isotermo Las columnas cromatogrficas se enrollan y sujetan en una canasta que se monta en el interior de un horno. El horno de la columna debe poder ser calentado y enfriado rpidamente. Esto requiere de un sistema de flujo de aire adecuado y bien diseado. En la mayora de los diseos el chorro de aire pasa a travs de las resistencias de calentamiento, despus por medio de deflectores que conforman la pared interior del horno, pasan por la columna y de vuelta al ventilador para recalentarse y recircular. Los hornos se construyen usualmente con acero inoxidable delgado. Para la programacin de temperatura es deseable disponer de un intervalo de velocidades de programacin desde 0. 1 hasta 50 oC/min. Debe ser posible sostener la temperatura en cualquier momento dentro del programa durante un tiempo. En general, la resolucin ptima se asocia con una menor temperatura; sin embargo, la consecuencia de una reduccin de temperatura es un aumento en el tiempo de elucin, y por tanto del tiempo que se necesita para completar un anlisis. Las temperaturas iniciales subambientales son tiles cuando se trabaja con columnas capilares. Las temperaturas se deben mantener alrededor de la temperatura deseada con precisin de 1oC en el caso de trabajo isotrmico y de 2oC durante la programacin de temperatura.

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5.4.3.4 DETECTORES [12].

Durante el desarrollo de la cromatografa de gases se han investigado y utilizado docenas de detectores. En las secciones que siguen a continuacin, se describen los utilizados ms frecuentemente. En cromatografa de gases, un detector ideal tiene las siguientes caractersticas:

1. Adecuada sensibilidad.Lo que constituye una adecuada sensibilidad no se puede evaluar de forma cuantitativa. Por ejemplo, las sensibilidades de los detectores que se van a describir difieren por un factor de 107. Aunque todos se utilizan extensamente y son adecuados en ciertos casos; sin embargo, en algunas aplicaciones los menos sensibles no resultan convenientes. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 10-8 a 10-15 g de analito/s. 2. Buena estabilidad y reproducibilidad. 3. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios rdenes de magnitud. 4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400C. 5.Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal. 6.Alta fiabilidad y manejo sencillo. Hasta el punto de estar a prueba de la impericia de operadores inexpertos. 7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva y altamente predecible para una o ms clases de analitos. 8.No destructivo de la muestra.

5.4.4 ESPECTROMETRA DE MASAS (EM)

De todas las herramientas analticas de que dispone un cientfico, la espectrometra de masas es quizs la de mayor aplicacin, en el sentido de que esta tcnica es capaz de proporcionar informacin acerca de: la composicin elemental de las muestras; [13] la estructura de las molculas inorgnicas, orgnicas y biolgicas; de la composicin

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cualitativa y cuantitativa de mezclas complejas y de las relaciones isotpicas de tomos en las muestras. [14]

Como muchas reacciones qumicas usadas para anlisis, el propsito bsico de la espectrometra de masas es convertirla muestra en productos que son indicativos de la molcula original. Los productos formados son bastante extraos: iones positivos gaseosos, cuya masa y abundancias relativas son mostrados en el espectro de masa. [15] Impacto Electrnico (IE). [13] Para este mtodo de ionizacin, el reactivo que produce los productos inicos es un haz de electrones enrgicos. Estos son calentados en un filamento incandescente, y viajan a travs de la cmara de iones hasta un nodo (trampa de iones) en el lado opuesto. El flujo de molculas vaporizadas de la muestra a una presin de aproximadamente 10-3Pa (10-5 torr) que entra a la fuente interacta con el flujo de iones para formar una variedad de productos, incluyendo los iones positivos. Con la IE se pueden introducir muestras de molculas largas usando la tcnica de haz de partculas.

En la figura que se muestra a continuacin (figura 4) se muestra una cmara de ionizacin que hace parte del sistema del espectrmetro de masas.

Figura 6. Fuente de ionizacin

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Ionizacin Qumica (IQ). [13] El gas reactivo entra a la cmara de ionizacin aumentando la presin en la cmara de ionizacin a ~ 70 Pa (0,50 torr), se puede asegurar que la muestra sufrir cientos de colisiones antes de escapar. El bombardeo de electrones de metano o cualquier otro gas a tal presin en una cmara de ionizacin cerrada produce una abundancia de iones "reactivos" como CH5+. Estos reaccionaran con las molculas de la muestra adicionada a travs de reacciones in-molcula; algunas son suaves produciendo iones estables que representan las molculas de la muestra sin disociar. [15] Con la ionizacin qumica diferentes tipos de molculas pueden ser ionizadas selectivamente con iones positivos o negativos especficos. Ambos tipos de iones son utilizados para indicar el peso molecular, porque estn a menudo presentes en espectros de IQ de compuestos que no muestran in molecular en el espectro de IE. Para IQ el gas reactivo R es introducido a la fuente de iones a una concentracin en exceso (~10-4:1) [14] comparado con la muestra, y es ionizado por bombardeo de electrones o descarga elctrica. Los iones R inicialmente formados pueden reaccionar con otras molculas de R para formar iones reactivos los cuales atacan las molculas de la muestra.

Mediante las tcnicas de ionizacin se producen diferentes tipos de especies qumicas, entre ellas el Ion molecular, que es aquel resultado de la ionizacin de la muestra. Ion Molecular. [13] El in molecular, M+ provee la ms importante informacin en el espectro de masa. Desafortunadamente, para algunos tipos de compuestos el in molecular no es lo suficientemente estable para ser encontrado con apreciable abundancia en el espectro de IE. Para estos casos la espectrometra de masas proporciona la tcnica de ionizacin qumica [15].

Los siguientes son requerimientos necesarios pero no suficientes para el in molecular en un espectro de masas: Debe ser el in con mayor masa en el espectro; debe ser una especie radical, que contenga un electrn desapareado; debe ser capaz de producir los iones importantes en la regin de masas alta del espectro por prdidas de especies neutras lgicas [15]. A continuacin se presenta la reaccin global que da como resultado la produccin del ion molecular a partir de la molcula.

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Figura 7. Reaccin global para producir el ion molecular.

Sin embargo, el uso de un espectrmetro de masas como detector en cromatografa de gases se desarroll durante la dcada de 1950 por RolandGohlke y McLafferty Fred.

5.4.4.1 CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRA DE MASAS (CG EM)

Algunos fabricantes de instrumentos ofrecen equipos de cromatografa de gases que pueden acoplarse directamente con distintos tipos de espectrmetros de masas de barrido rpido. [16]

La CG es la principal tcnica analtica para la separacin de compuestos voltiles, por su rpido anlisis, resolucin, fcil operacin y excelentes resultados cuantitativos. Desafortunadamente la CG no puede confirmar la identidad o estructura de cada pico. Los tiempos de retencin son caractersticos de cada compuesto pero no son nicos. [17] Tanto el sistema cromatogrfico como el espectroscpico estn calentados (200 - 300C), ambos trabajan con compuestos en estado gaseoso y ambos requieren pequeos tamaos de muestra (micro o nano gramos). CG y EM son muy compatibles. El nico problema es que la presin atmosfrica en la salida del CG debe ser reducida a un vacio de 1 a 10-6 torr para la entrada al EM W. Las molculas del analito deben ser primero ionizadas para ser atradas (o repelidas) por un apropiado campo magntico o elctrico. Existen numerosas tcnicas de ionizacin, pero impacto electrnico (IE) es el ms antiguo, comn y simple. La fuente de ionizacin es calentada y bajo vaco la mayora de las muestras son fcilmente vaporizadas e ionizadas, [17, 18]

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Los electrones de alta energa golpean las molculas neutras del analito, causando la ionizacin (usualmente pierde un electrn) y fragmentacin. [19] Comnmente esta tcnica produce menos fragmentaciones y espectros ms simples. El pico mayor que resulta es (M + 1), siendo M el peso molecular. Para llevar a cabo la ionizacin qumica, la cantidad de iones es habitualmente diferente de la usada para impacto electrnico, la presin de operacin es mayor y la temperatura es ms baja. [16]

Despus de la ionizacin, las partculas cargadas son repelidas y atradas por lentes cargados en el analizador de masa. Aqu las especies inicas son separadas por su razn masa-carga por cualquiera de los dos campos magntico o elctrico ml. Los analizadores de masa tpicos para CG/EM son cuadrupolos o trampa de iones. El primero consiste en cuatro varas hiperblicas perpendiculares a cada una. Tiene la ventaja de ser sencillo, pequeo, de costo moderado y rpido anlisis lo que lo hace ideal los sistemas CG/EM. [17]

El de trampa de iones es tambin simple en diseo y de anlisis rpidos para CG/EM. El espectro generado, difiere a menudo del espectro clsico creado en uno de cuadrupolo y algunos iones sufren disociacin o colisiones inmolcula adentro de la trampa de iones. [19, 20]

El espectro de masa es simplemente un plano de la abundancia de los iones en funcin del (m/z) Bajo condiciones controladas, las razones de abundancia y (m/z) especifico que presentan las especies son nicos para cada compuesto. Estos pueden ser utilizados para determinar el peso molecular y la estructura qumica de cada compuesto. [19, 20]

CG-EM combina las ventajas de ambas tcnicas: el alto poder de resolucin y la velocidad de anlisis de CG, mientras la EM provee tanto identificacin positiva como anlisis cuantitativos por debajo del nivel de las ppb. Por otro lado los instrumentos de CG-EM representan una inversin importante de capital, son ms complicados de operar que un CG. [19, 20]

La presentacin de datos puede ser de dos maneras; o como un total anlisis (scan, TICTotal Ion Current) o como un numero pequeo individual de iones (SIM-Selected Ion

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Monitoring) caractersticos de un compuesto. Un cromatograma de in total (TIC) es usado para identificar compuestos desconocidos. Un rango especfico de masas es escaneado. Todos los picos son reportados as que los espectros de masa pueden ser recuperados del computador y ser usados para identificar cada pico. La computadora compara rpidamente cada espectro de masa desconocido con cerca de 450.000 espectros de referencia. La adquisicin de datos necesario para examinar todos los iones en el rango seleccionado es lento, la sensibilidad es limitada, y usualmente no es ptima. [19, 20]

En SIM solo un pequeo nmero de iones (habitualmente 6) son monitoreados. Aqu la adquisicin de datos es ms rpida durante el tiempo de vida del pico, por lo tanto la cuantificacin es mejor y la sensibilidad aumenta considerablemente. SIM no puede usarse para anlisis cualitativo (no todas las masas son escaneadas), pero es el mejor modo para el anlisis de compuestos designados, a menudo por debajo del nivel de los ppb. [19, 20]

5.4.5

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA

5.4.5.1ANLISIS CUALITATIVO

Un anlisis cromatogrfico puede dar una amplia informacin cualitativa si se escoge el sistema de deteccin adecuado para determinar y evaluar los analitos separados, as si se utiliza un detector que permita obtener un espectro de cada compuesto separado y a su vez contenga una base de datos que pueda realizar su comparacin con una

biblioteca de espectros se podra, de una forma muy precisa, establecer la identidad de los componentes de una muestra, de hecho esto se logra fcilmente con cromatgrafos que contienen sistema de deteccin como el Infrarrojo (IR), el de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) o el espectrmetro de Masas (MS). Sin embargo, estos sistemas son muy costosos, es por ello que la mayora de los laboratorios cuentan con cromatgrafos con sistemas de deteccin sencillos como el detector de ionizacin a la llama (siglas en ingles, FID) o el detector de conductividad trmica (siglas en ingles (TCD) en el caso de cromatografa de gases o detectores de absorbancia o ndice de refraccin para los casos

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de cromatografa de lquidos. La nica informacin cualitativa que pueden ofrecer estos sistemas es el tiempo de retencin del analito, el cual, solo puede ser usada controlando bien las condiciones cromatogrficas como: flujo, temperatura, tipo de fase estacionaria en el caso de gases o composicin qumica de la fase mvil adems de las otras variables mencionadas anteriormente para el caso de cromatografa de liquida, adems de que se debe tener conocimiento de los posibles compuestos de la muestra y una amplia variedad de patrones para realizar comparaciones. Sin embargo, se puede dar el caso que dos compuestos tengan el mismo tiempo de retencin, lo que imposibilita su identificacin. Por supuesto que, a partir de cromatogramas obtenidos con diferentes fases mviles (para cromatografa liquida) y estacionarias y a diversas temperaturas de elusin (para cromatografa gaseosa), se puede obtener datos adicionales [21].

5.4.5.2ANLISIS CUANTITATIVO

El uso de la cromatografa se ha extendido en todo el mundo, en las ultimas cuatro dcadas, no solo por su capacidad de separar compuestos sino porque se puede realizar un anlisis cuantitativo de las especies proporcionadas. En la cromatografa en columna, el anlisis cuantitativo se basa en la comparacin de la altura, o del rea, del pico del analito con la de uno o ms patrones inyectados bajo las mismas condiciones cromatogrficas. El uso de una u otro termino depender de las caractersticas de la banda obtenida, aunque en la actualidad con el uso de sistemas de integracin de rea computarizados, la precisin es muy alta para el calculo de rea, sin embargo siempre es importante conocer las otras herramientas a utilizar para calcular el rea de una banda y en que momento es mejor usar altura en vez de rea por si llega a faltar el sistema computarizado. Para lograr un anlisis cuantitativo de los componentes separados de una muestra existe una gran variedad de mtodos de anlisis entre los que se pueden mencionar [21]:

1. Calibracin absoluta 2. Mtodo del estndar interno. 3. Normalizacin de rea (con y sin factor de respuesta) Cada mtodo tiene sus ventajas y desventajas.

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5.4.6 APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA EN EL CAMPO FORENSE (ESTUPEFACIENTES)

La cromatografa se ha convertido en una herramienta muy importante en muchos campos, incluyendo las ciencias forenses, y es extensamente usada debido a su versatilidad, sensibilidad, velocidad y confiabilidad de la tcnica. La cromatografa de gases (GC) en particular ha sido exitosamente aplicada a un nmero especfico y problemas nicos encontrados en un laboratorio del forense. Hay una buena razn para este xito. Desde 1980 la instrumentacin cromatogrfico se ha convertido asequible a la rutina de laboratorio y se ha podido acoplar con otras tcnicas, especialmente la espectrometra de masas y espectroscopia de infrarroja, permitiendo estas tcnicas sofisticadas ser aplicadas [7]. El consumo de drogas se ha intensificado en varios pases en los ltimos aos, aumentando tambin su accesibilidad, su implicacin en el comportamiento social y la importancia de su determinacin clnica y forense [22][23]. Por esta razn resulta de inters tratar el tema de los mtodos rpidos de anlisis de estos compuestos, en combinacin de procedimientos simples de preparacin de muestras y de interpretacin de datos. Es por ello que desde hace ms de una dcada, varios grupos de investigacin en conjunto con laboratorios y empresas de elementos de cromatografa han intentado desarrollar y/o mejorar los mtodos cromatogrfico de anlisis simultaneo de un amplio rango de drogas La cromatografa de gases GS sigue siendo un mtodo accesible, sencillo, menos costoso y de alta reproducibilidad para ser usado en la bsqueda de drogas de abuso en

diferentes matrices, en laboratorios clnicos y forenses sin demasiada experiencia en el tema. Estos equipos usualmente cuentan con un procesador automtico de datos y un buen banco de datos para poder analizar el mayor nmero posible de muestras en un laboratorio bioqumico y/o forense. La representacin grfica de los datos de CG-EM provee una manera fcil de anlisis para el personal no-experimentado de laboratorios

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forenses, bioqumicos y/o mdicos, usndose esta tcnica para la confirmacin de las muestras positivas [24]. 5.5 VALIDACIN

La validacin de una metodologa analtica, es un proceso de seguimiento que comprende la determinacin de una serie de parmetros que demuestren que los resultados del mtodo son confiables y reproducibles.

5.5.1

IDONEIDAD DEL SISTEMA CROMATOGRFICO [25].

El test de idoneidad del sistema consiste en un conjunto de ensayos que permiten comprobar en el momento de utilizacin del mtodo, que el sistema (analista, reactivos e instrumental) es adecuado para llevar a cabo la determinacin para la que se ha establecido y validado dicho mtodo. Factor de capacidad (k): Tambin definido como relacin de distribucin de masa (D) se interpreta como el nmero de volmenes de fase mvil necesarios para eluir un compuesto despus del volumen inicial contenido en una columna (t0). Este factor determina la retencin de un soluto y puede ser calculado como:

Donde: t0 = tiempo en el que un compuesto no retenido pasa por el interior del sistema tR = tiempo de retencin del compuesto considerado. Valores bajos de k indican que el pico eluye muy prximo al frente de solvente, pudiendo verse comprometida la selectividad. Son recomendables valores de k superiores a 1, consiguindose una optima resolucin con valores mayores de 2.

Nmeros de platos tericos (N): Es una medida de la eficacia del sistema cromatogrfico, que expresa el nmero de picos que pueden aparecer en el

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cromatograma por unidad de tiempo y, por lo tanto, de la capacidad del sistema de proporcionar bandas de elucin estrechas. El clculo del nmero de platos tericos se basa en la relacin entre el tiempo de retencin y la anchura del pico cromatogrfico, para su calculo se puede emplear la siguiente formula: ( ) Donde: tR = tiempo de retencin del compuesto considerado. W = La anchura del pico en la lnea de base determinado por la tangente ajustada a un % de la altura del pico.

Resolucin (Rs): Es la medida de la separacin entre dos picos. Este parmetro resulta muy til para controlar el comportamiento de posibles interferencias. La formula de calculo para la resolucin es:

Donde: tR1 y tR2 = Tiempo de retencin (tiempo de elucin del mximo del pico medido desde el inicio de la inyeccin), tR1 < tR2. W1 y W 2 = Anchura de pico por tangentes, C = 2.0 (USP) [25].

Factor de selectividad ( ): el factor de selectividad de una columna para dos especies se define como:

Precisin: Se evala el calculo del coeficiente de variacin de los resultados obtenidas tras el anlisis de una serie de replicados de una muestra. La USP 24

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estable como criterio un coeficiente de variacin igual o inferior al 2% en la inyeccin. 5.5.2 PRECISIN

La precisin est relacionada con la dispersin de las medidas alrededor de su valor medio o central y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el mtodo se aplica repetidamente a mltiples alcuotas de una muestra homognea. La precisin se expresa matemticamente como la desviacin estndar (SD), o ms comnmente como la desviacin estndar relativa (RSD) o coeficiente de variacin (CV) [26]. El objetivo del estudio de la precisin es conocer la variabilidad o el ms-menos del mtodo de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo mtodo de ensayo. Como consecuencia de la existencia de estos errores, los anlisis efectuados sobre muestras idnticas, en las mismas circunstancias, no conducen generalmente a resultados idnticos. Los factores susceptibles que influirn sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo, instrumental, reactivos, tiempo, etc.) de aqu la importancia del estudio de la precisin. La precisin diferentes tipos de estudios: Repetibilidad: se expresa matemticamente por el coeficiente de variacin (desviacin estndar relativa) de una serie de medidas. Esta estudia la variabilidad del mtodo efectuando una serie de anlisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (por un mismo analista, con los mismos aparatos y reactivos, etc.), en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto. Uno de los factores que ms puede influir en la Repetibilidad del mtodo de anlisis es la concentracin del analito, ya que la desviacin estndar de las respuestas obtenidas aumenta al disminuir la concentracin del analito. Repetibilidad del sistema instrumental Este parmetro estudia la variabilidad debida nicamente al instrumento, y se determina analizando repetidamente una misma muestra de forma consecutiva de 6 a 10 veces. La

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estimacin de esta se realiza con el clculo del coeficiente de variacin de las respuestas obtenidas. Los resultados obtenidos en la repetibilidad instrumental dependen del instrumento, por ejemplo no se puede obtener el mismo coeficiente de variacin en un equipo con inyeccin automtica que con inyeccin manual. Repetibilidad del mtodo El ensayo de Repetibilidad del mtodo se efecta sobre una serie de alcuotas de una muestra homognea que se analiza independientemente desde el principio (preparacin de muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el mismo analista.

La Repetibilidad del mtodo depende generalmente del proceso de preparacin de la muestra. Es decir, cuanto mayor sea la manipulacin de la muestra ms probable es que la variabilidad del mtodo aumente.

Precisin intermedia: Estudia la variabilidad del mtodo efectuando una serie de anlisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos, das, etc.) y en un mismo laboratorio. Reproducibilidad: Estudia la variabilidad del mtodo bajo condiciones operativas diferentes y en distintos laboratorios [25]. ANLISIS DE VARIANZA ANOVA: El anlisis de la varianza (ANOVA) es una potente herramienta estadstica, de gran utilidad tanto en la industria, para el control de procesos, como en el laboratorio de anlisis, para el control de mtodos analticos. Sirve para comparar si los valores de un conjunto de datos numricos son significativamente distintos a los valores de otro o ms conjuntos de datos. El procedimiento para comparar estos valores est basado en la varianza (coeficiente de variacin) global observada en los grupos de datos numricos a comparar.

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Tabla 1. Parmetros test ANOVA

Donde: Desviacin Estndar de la linealidad: Sxx= _x2-(_x)2/n] Desviacin Estndar de la regresin: Sxy=_xy-[(_x_y)/n] Desviacin del error total Syy= _y2-(_y)2/n] Desviacin del error dentro (Syy)k = _/k (_y2-(_y)2/m] Suma de cuadrados de la regresin Scrg = S2xy / Sxx Suma de cuadrados del error residual Scr = Sct Scrg Desviacin del error total Sct

5.5.3 EXACTITUD [25].

La exactitud de un procedimiento analtico expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y el valor experimentalmente encontrado. De esta definicin surge el problema de saber cul es el valor verdadero. No obstante, cuando se dispone de patrones de referencia certificados, el valor de dicho patrn es el que se acepta como valor verdadero y la exactitud puede evaluarse aplicando el mtodo sobre dicho patrn, o bien analizando muestras de placebo o de problema a las que se ha aadido una cantidad conocida de dicho patrn. Tambin se acepta la comparacin de los resultados con un mtodo de referencia validado del que se ha demostrado su exactitud; entonces el valor verdadero es el que se obtiene con dicho mtodo de referencia.

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La exactitud debe determinarse en todo el rango especificado para el mtodo analtico. Se recomiendan un mnimo de 9 determinaciones sobre 3 niveles de concentracin del analito que cubran el rango especificado (por ejemplo 3 determinaciones por 3 niveles de concentracin, que podra ser la concentracin central y las concentraciones en los extremos del rango). La exactitud se expresar como porcentaje de recuperacin en la valoracin de una cantidad conocida de analito aadida sobre la muestra o como la diferencia entre la media obtenida y el valor aceptado como verdadero junto a los intervalos de confianza.

No siempre se obtienen valores de recuperacin cercanos al 100%, ya que sta depende de la matriz de la muestra, de la efectividad de mtodo de preparacin y extraccin y de la concentracin del analito. Aunque es deseable alcanzar valores de recuperacin cercanos al 100%, en algunas muestras de matrices complejas solo se obtienen valores del 50, 80 o 90%. En estos casos es importante que aunque la recuperacin sea baja, la precisin del mtodo sea alta ya que entonces puede intentar aplicarse un factor de correccin. La desviacin de la exactitud por exceso se produce cuando existen interferencias y la selectividad del mtodo no es la adecuada, entonces se obtienen resultados superiores al valor verdadero. En este caso, si es posible, se debera modificar las condiciones del mtodo para optimizar la selectividad o bien cambiar a otro alternativo que sea selectivo.

La desviacin de la exactitud por defecto suele producirse cuando la matriz de la muestra es compleja y la extraccin del analito requiere varios pasos obtenindose recuperaciones ms bajas. Cuando esto ocurre sera conveniente intentar optimizar la preparacin de la muestra para mejorar el factor de recuperacin. Si esto es muy costoso o no es posible, cuando la exactitud obtenida es repetible, es decir, tienen una precisin elevada y adems es homognea en todos los niveles de concentracin estudiados, puede aplicarse un factor de correccin en el clculo final para compensar las prdidas del analito debidas al mtodo de extraccin [25]. LMITE DE DETECCIN (LD): El lmite de deteccin (LD) corresponde a la mnima cantidad de analito en la muestra que se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar en las condiciones establecidas

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y se expresa en unidades de concentracin (%, ppm, ppb, etc.). Su determinacin puede efectuarse mediante la relacin entre el ruido y la seal debida al analito. LMITE DE CUANTIFICACIN (LC): Dado un mtodo analtico determinado, se entiende por lmite de cuantificacin (LC) de dicho mtodo, la mnima cantidad de analito presente en la muestra que se puede cuantificar, bajo las condiciones experimentales descritas, con una adecuada precisin y exactitud; tambin se expresa en unidades de concentracin [25,26]. Existen diversos procedimientos de anlisis y sistemas instrumentales que dependiendo de sus caractersticas definen en muchos casos cul es el mtodo ptimo para determinar tanto el lmite de deteccin como el de cuantificacin. Entre los mtodos ms comunes se tienen los siguientes: Mtodo basado en la relacin seal/ruido Este mtodo, uno de los ms conocidos y empleados, requiere que el procedimiento de anlisis sea instrumental y que proporcione una seal blanco, un ruido de fondo o una lnea de base, es decir una seal residual a concentracin cero de analito (espectrofotometra UV-visible o la cromatografa de gases o lquida). Este procedimiento presenta la desventaja de que en numerosas ocasiones al llevar a cabo la comprobacin experimental del LC calculado, se observa que es posible obtener resultados igualmente precisos y exactos an cuando se desciende ms en la concentracin lmite Mtodo basado en la desviacin estndar de la respuesta del blanco y la pendiente de la recta de calibrado De acuerdo a la IUPAC (International Union of Pure and AppliedChemistry), puede calcularse el LD Y LC de un mtodo analtico a partir del conocimiento de la desviacin atribuible a la respuesta de una muestra de placebo y la pendiente de la recta de calibrado del analito. La expresin a aplicar para este clculo vara en funcin de si el mtodo instrumental empleado corrige la seal frente a un blanco o no.

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Mtodos instrumentales que corrigen la seal frente a un blanco Este primer caso correspondera a un mtodo espectrofotomtrico en el que se podra calcular el LD y el LC tericos mediante la expresin:

Donde: CL= Concentracin de analito en el lmite de cuantificacin o deteccin. K= Constante que usualmente se considera igual a 10 para el LC e igual a 3 para el LD. Sbl= desviacin estndar correspondiente a la seal del blanco o placebo. b= pendiente de la curva de calibracin obtenida al representar la respuesta del mtodo frente a la concentracin de analito. Evidentemente el rango de esta recta tiene que ser cercano en concentraciones a los niveles lmite de cuantificacin [25]. Si el mtodo analtico realiza la lectura final por duplicado o triplicado, mejorando con ello la precisin, se ha de introducir en la frmula el trmino correspondiente a las rplicas (n) en la siguiente forma:

Mtodos instrumentales que no corrigen la seal frente a un blanco El caso en que no se realiza correccin frente a un blanco es tpicamente el de mtodos cromatogrficos GC o HPLC. En stos se ha de tener en cuenta tambin la seal media obtenida del anlisis correspondiente al placebo, es decir, el ruido de fondo o background del sistema (Ybl) con lo que la expresin final ser entonces:

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Mtodo basado en la extrapolacin de la recta de calibrado a concentracin cero Se trata de un procedimiento aplicable tambin a mtodos analticos instrumentales que proporcionan resultados numricos y dirigido a evitar el clculo, en ocasiones costoso en tiempo, como se ha podido observar, de la seal media del blanco y su desviacin estndar. El mtodo utiliza la pendiente de una recta de calibrado realizada a niveles de concentracin cercanos a los lmites esperados, pero sustituye el valor real de la seal del blanco por el resultante de la extrapolacin de dicha recta. La interseccin con el eje Y corresponder tericamente al valor de la respuesta a concentracin cero de analito.

5.5.5

LINEALIDAD Y RANGO [25].

La linealidad es la capacidad del mtodo para proporcionar resultados que son directamente (o por medio de transformaciones matemticas) proporcionales a la concentracin del analito en la muestra dentro de un rango establecido. Siempre que sea posible se buscar una respuesta de tipo lineal que facilitar su trazado, interpolacin e interpretacin. En el caso que la respuesta del mtodo no sea lineal pero si proporcional a la concentracin son vlidos otros ajustes matemticos. El rango se define como el intervalo comprendido entre la concentracin mnima y mxima de analito para el cual se ha demostrado su correcta precisin, exactitud y linealidad del mtodo descrito.

Para evaluar la linealidad se recomienda que dentro del rango establecido se estudien al menos 5 niveles de concentracin las cuales se analicen por triplicado (K=5, n de replicas=3); estadsticamente lo correcto sera analizar las muestras de forma aleatoria, pero para minimizar posibles efectos de memoria en el equipo es conveniente analizarlas en sentido creciente de concentracin. Otro aspecto importante es realizar pesadas independientes, ya que as se elimina el posible error sistemtico que se podra arrastrar partiendo de una sola pesada y realizando diluciones; no obstante, para evaluar la linealidad en las impurezas se suelen utilizar sucesivas diluciones ya que normalmente se trabaja a niveles de concentracin muy bajos y esto dificultara las pesadas.

Con los resultados de estudio de la linealidad se hace una relacin entre las cantidades o concentraciones X (variable independiente o predictiva) y la respuesta y (variable

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dependiente, por ejemplo reas, alturas, absorbancias, etc.). La relacin entre ambas variables se expresa matemticamente como una recta de regresin del tipo y = bx + a, donde b es el valor de la pendiente y a el trmino independiente. Esta regresin es obtenida por un mtodo de ajuste (por lo general mnimos cuadrados); en algunos casos podra ser necesaria alguna transformacin matemtica previa (uso de logaritmos, recprocos de las variables, etc.) para obtener funciones lineales. La pendiente b se encuentra relacionada con la sensibilidad del mtodo analtico de forma que a mayor pendiente mayor sensibilidad (respuesta del mtodo frente a los cambios de la concentracin del analito). El trmino independiente a, u ordenada en el origen, es la interseccin de la recta con el eje de ordenadas y es indicativo del error sistemtico. La representacin grfica de la recta de regresin en un sistema de coordenadas junto con los valores experimentales, permite visualizar la bondad del ajuste. Si la recta no pasa cerca del origen de coordenadas significa que el mtodo a evaluar est afectado por un error sistemtico por defecto o exceso en el intervalo estudiado. Si existen diferencias apreciables entre los valores experimentales y los puntos de la recta significa que la linealidad no es buena.

Independiente de la apariencia de la recta, resulta conveniente evaluar el coeficiente de correlacin (r) y el coeficiente de determinacin (r2). El coeficiente de correlacin nos indica el grado de relacin entre la variable x (concentracin), y la variable y (respuesta). Su valor mximo es 1. Si r es cercano a la unidad significa que existe correlacin con una probabilidad elevada. Un valor nulo indica ausencia de relacin lineal entre las variables. El valor recomendable para el coeficiente de correlacin es 0,999, aunque en el caso de impurezas se admite 0,990. La informacin obtenida mediante el clculo de r es limitada y no justifica por s sola la linealidad, siendo r2 coeficiente de determinacin el que aporta una mayor significacin estadstica ya que representa la proporcin de la variacin total de y explicada por el modelo [25].

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DISTRIBUCIN T DE STUDENT LINEALIDAD Es una distribucin de probabilidad que evala la variacin entre las variables de estudio mediante el coeficiente de correlacin, cuando este es estadsticamente diferente de cero, para el caso en estudio se toma el t de tabla con una seguridad del 97,5% y se trabaja con n-1 grados de libertad. Hiptesis planteadas para evaluar la metodologa:

-Intercepto (a): H0: a=0 H1: a0 - Coeficiente de correlacin (r): H0: r=0 H1: r0 - Pendiente (b): H0: b=0 H1: b0 Tabla 2. Parmetros t-student

Sxy = ((_ y2 a* _ y b* _ xy) / (n-2))1/2 S (b) = (S2xy/ (_ x2- (_ x2/ n))) 1/2 S (a) = (S (b)2 * (_ x2/ n ))

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6. METODOLOGA

6.1 PREPARACIN DE ESTNDARES

PREPARACIN DE SOLUCIONES STOCK PARA CADA UNO DE LOS ANALITOS: Para la preparacin de las soluciones madre (stock),es necesario hacer un ajuste de la cantidad a pesar, de acuerdo a la pureza del material de referencia utilizado, siguiendo la frmula:

Se prepararon soluciones madre a 1000ppm de cada uno de las sustancias a analizar de la siguiente manera:

Solucin de Tetracosano 1000ppm, estndar interno Pesar 202,02mg de tetracosano, llevar a un baln aforado de 200mL, diluir y completar a volumen con etanol.

Solucin de Cocana 1000ppm Pesar 101,01mg de cocana, llevar a un baln aforado de 100mL, diluir y completar a volumen con etanol.

Solucin de Morfina 1000ppm Pesar 50,505mg de morfina, llevar a un baln aforado de 50mL, diluir y completar a volumen con etanol. Nota: se debe almacenar a temperaturas entre (5-10)C y protegido de la luz.

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Solucin de Lidocana 1000ppm Pesar 51,020mg de morfina, llevar a un baln aforado de 50mL, diluir y completar a volumen con etanol.

Solucin de Fenacetina 1000ppm Pesar 51,020mg de Fenacetina, llevar a un baln aforado de 50mL, diluir y completar a volumen con etanol.

Solucin de Procana 1000ppm Pesar 51,546mg de Procana, llevar a un baln aforado de 50mL, diluir y completar a volumen con etanol.

Solucin de Papaverina 1000ppm Pesar 50,505mg de papaverina, llevar a un baln aforado de 50mL, diluir y completar a volumen con etanol.

Solucin de Tebana 1000ppm Pesar 50,505mg de Tebana, llevar a un baln aforado de 50mL, diluir y completar a volumen con etanol. Nota: se debe almacenar a temperaturas entre (5-10) C y protegido de la luz.

Solucin de Codena 1000ppm Pesar 50,505mg de Codena, llevar a un baln aforado de 50mL, diluir y completar a volumen con etanol.

Solucin de Herona 120ppm Pesar 3mg de Herona, llevar a un baln aforado de 25mL, diluir y completar a volumen con etanol. Nota: La concentracin de la solucin de Herona es diferente debido a que slo se dispona de 3mg de estndar de Herona.

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Solucin de trabajo Se toma un volumen de 1mL de cada una de las soluciones de los analitos y se mezcla para obtener una solucin que contenga todas las sustancias a analizar con una concentracin de 100ppm para cada analito.

6.2 PREPARACIN DE LA MUESTRA

Se toma aproximadamente 0,5mL de la solucin de trabajo, se lleva a viales de 1,5mL y se procede a su anlisis cromatogrfico para evaluar cada parmetro.

6.3ESTANDARIZACIN DEL MTODO CROMATOGRAFICO

Se evalan diferentes mtodos cromatogrficos con el fin de determinar cual de ellos presentanla mejor reproducibilidad, resolucin y respuesta. Los parmetros del mtodo se encuentran en la tabla 3 y a dicho mtodo se le denomin OPIACEOS-COCAINA2011B.

Sistema de idoneidad

Se deben realizar 5 inyecciones de la solucin de trabajo,

con el fin de evaluar los

parmetros de la columna cromatogrfica tales como: tiempo de retencin (tr), resolucin (R), factor de selectividad ( ), factor de capacidad (k) y nmero de platos tericos (N) evaluando que permanezcan constantes durante el desarrollo de la metodologa.

6.4VALIDACIN DEL MTODO

Los parmetros que se evalan en la tcnica de validacin son selectividad, especificidad, precisin (repetibilidad y precisin intermedia), lmite de deteccin, linealidad, lmite de cuantificacin y exactitud.

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6.4.1 Selectividad Paraeste parmetro se analizan las sustancias individualmente (cocana, opiceos y sus principales adulterantes) en el cromatgrafo cada una con 5 repeticiones.

6.4.2 Especificidad La especificidad se evala analizando las sustancias en mezcla con 5 repeticiones.

6.4.3 Repetibilidad Este parmetro fue evaluado a un solo nivel de concentracin de la mezcla de analitos. Se corren 10 muestras cada una con 1 inyeccin.

6.4.4 Precisin Intermedia Este parmetro es evaluado por dos analistas en tres das diferentes, con un solo nivel de concentracin. Realizando cinco muestras y cada una con tres inyecciones.

6.4.5 Lmite de Deteccin Este parmetro es evaluado a cinco niveles de concentracin (5, 10, 20, 25, 50) ppm Cada nivel con tres muestras y tres inyecciones por muestra.

6.4.6 Linealidad para cocana Para la linealidad se realiza una curva de concentraciones (200, 400, 600, 800 y 1000) ppm de cocana las cuales contiene una concentracin fija de 300 ppm de estndar interno de tetracosano. La linealidad es evaluada mediante procedimientos estadsticos, los cuales son: Anlisis de varianza ANOVA y distribucin t (de student). Los cuales son realizados a una curva de concentraciones

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6.4.7 Exactitud Se determina la exactitud del mtodo mediante el anlisis de 3 niveles de concentracin conocida de cocana (100, 300, 700) ppmcon una concentracin fija de 300ppm de estndar interno de tetracosano. Cada muestra se analiza por triplicado. Los resultados obtenidos se comparan con el valor de la concentracin terico y se determina el porcentaje de error, mediante la siguiente ecuacin: | |

RESULTADOS Y ANALISIS

7.1 Estandarizacin del mtodo

Condiciones cromatogrficas El cromatgrafo de gases fue operado en las condiciones se describen en la tabla 3, estas condiciones fueron halladas experimentalmente.

Tabla 3. Condiciones cromatogrficas Initialtemp Initial time Ramps # 1 2 3 Post temp. Post time Run time Mode Inicial Temp. Pressure Split ratio Split flow Total flow Gas saber Saverflow Saver time Gas type 140C (On) 1.00min. Rate 17.00 25.00 0.0 (Off) Final temp 242 295 300C 0.0min. 14.62min. Split 280C (On) 0.26psi (On) 20:1 25.9mL/min 19.7mL/min On 20.0mL/min 2.00min Helium Final time 1.50 4.00

OVEN

FRONT INLET

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COLUMNA

DETECTOR

Capillary columna ModelNumber Max temperatura Nominal length Nominal diameter Nominal film thickness Mode Initialflow Nominal initpressure Averagevelocity Inlet Outlet Outletpressure MSD Data rate Type Temperature

Agilent 19091S-413 350C 30.0m 320.00m 0.25m Constantflow 0.8mL/min 0.26psi 34cm/sec Front Inlet Front Detector Vacuum 20Hz Test plot 280C

7.1.1 Estabilidad Estndar Interno Tetracosano El estndar interno se utiliza en cromatografa de gases con el fin de poder efectuar una determinacin cuantitativa, ya que la cantidad de analito es proporcional a la intensidad del pico, para ello se realiza una curva de calibracin con estndares de concentracin conocida, cada muestra conteniendo el estndar, esta curva es una dependencia entre la relacin de concentraciones y larelacin de reas (Analito / estndar interno). Por esto se hace necesario inicialmente evaluar la repetibilidad que presenta elestndar interno en cuanto a sus reas y en su tiempo de retencin. Tabla 4. Estabilidad estndar interno con los tiempos de retencin. ESTABILIADAD TETRACOSANO 04-abr 17-may 29-may 11-jun 05-jul 18-jul 01-ago Promedio SD CV TR 8,670 8,670 8,670 8,670 8,670 8,658 8,670 8,668 0,004536 0,052324

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Seevalu la estabilidad del estndar interno a lo largo de proceso de validacin, y se comprob que no presenta cambios significativos en su respuesta cromatogrfica, garantizando una relacin constante de reas con los analitos presentes en las muestras; con lo cual da validez a los resultados obtenidos. 7.1.2 Sistema de idoneidad

Para determinar la idoneidad del sistema cromatogrfico se evalu distintos parmetros analticos as como la comprobacin de la precisin del sistema realizando medidas repetidas de una misma preparacin de muestra.

A continuacin en se muestran los parmetros analticos evaluados con sus respectivos criterios de aceptacin. Tabla 5. Criterios de aceptacin para los parmetros cromatogrficos

Parmetros Evaluados: Tiempo de retencin (tr) Factor de Capacidad (K') Resolucin Platos Tericos (N) Factor de selectividad

Criterio de Aceptacin CV 2% Entre 1.5 y 10 2 2000 1

Tabla 6. Resultados de los parmetros cromatogrficos

Estadstico Promedio SD CV (%) Promedio SD CV (%)

tr (min.) K FENACETINA 4,505 1,2525 0,000 0,000 0,000 5,733 0,000 0,000 0,000 LIDOCAINA 1,8665 0,000 0,000

N 4705,2015 502,656555 10,6829974 11732,0908 244,203142 2,08149722

58

Promedio SD CV (%) Promedio SD CV (%) Promedio SD CV (%) Promedio SD CV (%) Promedio SD CV (%) Promedio SD CV (%) Promedio SD CV (%) Promedio SD CV (%) Promedio SD CV (%)

PROCAINA 6,593 2,2966 0,000 0,000 0,004 0,007 COCAINA 7,677 2,8385 0,000 0,000 0,005 0,006 TETRACOSANO 8,668 3,335 0,001 0,001 0,012 0,016 CODEINA 9,034 3,5165 0,001 0,000 0,006 0,007 MORFINA 9,823 3,912 0,001 0,000 0,005 0,007 TEBAINA 1 9,823 3,9465 0,002 0,001 0,018 0,023 TEBAINA 2 9,968 3,984 0,001 0,000 0,006 0,008 HERONA 10,460 4,229 0,002 0,001 0,021 0,026 PAPAVERINA 11,358 4,679 0,000 0,000 0,003 0,003

18684,7085 580,7315 3,10805759 25729,2665 679,134524 2,63954094 26509,343 0 0 53663,5085 30,8694755 0,05752415 235308,83 0 0 185012,191 0 0 35041,028 0 0 95407,4315 3519,3715 3,68878131 22266,1555 385,622926 1,73187925

Tabla 7. Resultados de los parmetros cromatogrficos RELACION SUSTANCIA PROMEDIO SD CV FACTOR DE SELECTIVIDAD FENACETINA LIDOCANA 4,4128 1,490219561 0,0376 0 0,852066715 0 RESOLUCION

59

LIDOCANA PROCANA PROMEDIO SD CV PROMEDIO SD CV PROMEDIO SD CV PROMEDIO SD CV PROMEDIO SD CV PROMEDIO SD CV 4,0034 0,048690862 1,216237737 PROCANA COCANA 5,6462 0,039983747 0,708153213 COCANA TETRACOSANO 11,8684 0,21415952 1,804451484 TETRACOSANO CODENA 2,2858 0,02355207 1,030364423 CODENA MORFINA 6,7708 0,094756002 1,399480157 MORFINA TEBANA 1 0,832 1,24127E-16 1,49191E-14 TEBANA 2 HERONA 5,1212 0,132159752 2,580640315 HERONA PAPAVERINA 4,2558 0,061344926 1,441442888 1,230431289 0,0001198 0,009736428 1,235957512 0,000120322 0,009735156 1,1745288 0,000192962 0,016428884 1,054890692 0,000192138 0,018214051 1,11225796 0,000133459 0,011998966 1,009126469 0,000265167 0,026276891

PROMEDIO SD CV PROMEDIO SD CV

1,06182694 0,000242952 0,02288052 1,106122994 0,00028521 0,025784699

En la tabla 6 se puede observar que los tiempos de retencin para cada sustancia analizada presenta un coeficiente inferior al 2%. El factor de capacidad para cada analito

60

cumple con el criterio de aceptacin ya que este valor se encuentra dentro del rango establecido.El nmero de platos tericos para cada analito es significativamente alto lo cual indica que se presento un buen nmero de equilibrios, cumpliendo de esta manera con el criterio de aceptacin.

En cuanto a la resolucin se sabe que lo ideal es que el valor sea mayor a 2, para la mayora de los analitos alcanza el valor ideal, excepto parala morfina, sin embargo con esta resolucin se alcanza a diferenciar un pico del otro en el cromatograma. El factor de selectividad es un parmetro que se cumple para todos los analitos puesto que este valor es mayor que 1.

Con los resultados obtenidos se puede considerar que el equipo funciona correctamente y que la determinacin se realizo en las condiciones establecidas durante la validacin, lo cual indica que el sistema cromatogrfico es idneo y especifico.

7.2 VALIDACION

7.2.1

Especificidad

Tabla 8. Tiempos de retencin de cada sustancia analizada individualmente. Sustancia Fenacetina Lidocana Procana Cocana Tetracosano Codena Morfina Tebana 1 Tebana 2 Herona Papaverina Promedio Tiempo Retencin 4,5494 5,7620 6,6212 7,7056 8,7006 9,0716 9,3696 9,9070 9,9762 10,4806 11,3928

61

Se pudo observar con los datos obtenidos una buena especificidad ya que cada analito presenta un tiempo de retencin diferente; por lo tanto no hay interferencias para la correcta identificacin de las sustancias de inters.

A continuacin en las figuras 8, 9, 10 se muestran los cromatogramas de las principales sustancias analizadas.

Figura 8. Cromatograma cocana.

Figura 9. Cromatograma herona.

62

Figura 10. Cromatograma tetracosano. 7.2.2 Selectividad

En la tabla 9 se muestran los tiempos de retencin de cada sustancia analizada en la mezcla. Tabla 9. Datos obtenidos para los tiempos de retencin de cada sustancia en mezcla Sustancia Tiempo de retencin en mezcla 4,505 5,733 6,599 7,678 8,670 9,039 9,829 9,899 9,968 10,464 11,364

Fenacetina Lidocana Procana Cocana Tetracosano Codena Morfina Tebana 1 Tebana 2 Herona Papaverina

Con los resultados obtenidos se observa una buena separacin de las sustancias en la mezcla, sin presentarse solapamientos o alguna interferencia; la morfina y la tebana son las sustancias q presentan una separacin menor, sin embargo esto no impide un correcto anlisis cromatogrfico.

63

Figura 11. Cromatograma sustancias analizadas en mezcla

7.2.3

Repetibilidad

Tabla 10. Datos obtenidos para el anlisis de repetibilidad. Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Promedio SD C.V. % Muestra 1 2 3 4 5 6 7 Fenacetina Lidocana 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 0 0 0 0 Morfina 9,823 9,823 9,823 9,824 9,824 9,823 9,823 Procana 6,593 6,593 6,593 6,593 6,594 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 0,000316 0,004796 Cocana 7,677 7,677 7,677 7,677 7,677 7,677 7,677 7,678 7,677 7,677 7,677 0,000316 0,004119 Tetracosano 8,666 8,668 8,668 8,668 8,669 8,668 8,67 8,669 8,669 8,669 8,668 0,001075 0,012401 Codena 9,034 9,034 9,034 9,033 9,034 9,033 9,034 9,034 9,033 9,033 9,034 0,000516 0,005716

Tebana 9,893 9,894 9,897 9,897 9,893 9,893 9,897

Tebana 2 9,966 9,968 9,968 9,968 9,867 9,968 9,968

Herona 10,458 10,458 10,463 10,462 10,459 10,462 10,462

Papaverina 11,357 11,358 11,358 11,358 11,358 11,358 11,358

64

8 9 10 Promedio SD C.V. %

9,824 9,824 9,823 9,823 0,000516 0,005257

9,896 9,893 9,894 9,895 0,001829 0,018482

9,968 9,968 9,968 9,958 0,031875 0,320103

10,463 10,462 10,458 10,461 0,002163 0,020676

11,358 11,358 11,358 11,358 0,000316 0,002784

Los coeficientes de variacin entre los tiempos de retencin cumplen con el criterio de aceptacin, los cuales son menores al 2%. Esto demuestra que el mtodo para el anlisis de estas sustancias proporciona resultados constantes lo que indica una buena repetibilidad.

7.2.4

Precisin intermedia

7.2.4.1 Precisin intermedia Morfina Tabla 11. Datos obtenidos para el anlisis de precisin intermedia para morfina. MORFINA Da Muestra 1 Promedio S.D C.V. C.V. Global MORFINA Da Muestra 2 Promedio S.D C.V. C.V. Global
Analista 1

1
Analista 1 Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

9,82733 0,00289 0,02937

9,82533 0,00321 0,03272

9,82533 0,00321 0,03272

9,82367 0,00058 0,00588

9,82200 0,00346 0,03527

9,82367 0,00058 0,00588

0,02364

1
Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

9,82367 0,00058 0,00588

9,82567 0,00289 0,02938

9,82500 0,00346 0,03526

9,82400 0,00000 0,00000

9,82367 0,00058 0,00588

9,82333 0,00058 0,00588

0,01371

65

MORFINA Da Muestra 3 Promedio S.D C.V. C.V. Global MORFINA Da Muestra 4 Promedio S.D C.V. C.V. Global MORFINA Da Muestra 5 Promedio S.D C.V. C.V. Global ANOVA Morfina
Analista 1 Analista 1 Analista 1

1
Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

9,82533 0,00321 0,03272

9,82733 0,00289 0,02937

9,82533 0,00321 0,03272

9,82567 0,00289 0,02938

9,82367 0,00058 0,00588

9,82367 0,00058 0,00588

0,02266

1
Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

9,82333 0,00058 0,00588

9,82533 0,00321 0,03272

9,82700 0,00346 0,03525

9,82500 0,00346 0,03526

9,82333 0,00058 0,00588

9,82367 0,00058 0,00588

0,02014

1
Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

9,82333 0,00058 0,00588

9,82567 0,00289 0,02938

9,82367 0,00058 0,00588

9,82900 0,00000 0,00000

9,82333 0,00058 0,00588

9,82333 0,00058 0,00588

0,00881

Tabla 12. Datos obtenidos para el anlisis ANOVA para morfina Origen de las variaciones Entre grupos Dentro de los grupos Total Suma de cuadrados 8,1E-06 0,00049422 0,00050232 ANALISIS DE VARIANZA Grados Promedio F probabilidad de de los libertad cuadrados 1 8,1E-06 1,442266 1 88 89 5,616E-06 Valor critico para F 3,949321007

66

7.2.4.2 Precisin intermedia Herona Tabla 13. Datos obtenidos para el anlisis de precisin intermedia para herona HERONA Das Muestra 1 Promedio S.D C.V. C.V. Global HERONA Das Muestra 2 Promedio S.D C.V. C.V. Global HERONA Das Muestra 3 Promedio S.D C.V. C.V. Global HERONA Das Muestra 4 Promedio S.D C.V. C.V. Global 1 2 3 10,46000 0,00346 0,03312 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 10,46400 10,46400 10,46400 10,46400 10,46200 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00346 0,03311 1 2 3 10,46400 0,00000 0,00000 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 10,46400 10,46400 10,46400 10,46400 10,46200 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00346 0,03311 1 2 3 10,46000 0,00346 0,03312 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 10,46400 10,46400 10,46400 10,46400 10,45800 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 1 10,46400 10,46400 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 2 10,46400 10,46400 10,45800 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 3 10,46200 0,00346 0,03311 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2

0,00552

0,00552

0,00552

0,01104

67

HERONA Das Muestra 5 Promedio S.D C.V. C.V. Global ANOVA Herona Tabla 14. Datos obtenidos para el anlisis ANOVA para herona. Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre 1,63636E-06 grupos Dentro de 0,000513818 los grupos Total 0,000515455 ANALISIS DE VARIANZA Grados Promedio F de de los libertad cuadrados 1 86 87 1,636E-06 5,974E-06 0,27388535 probabilidad Valor critico para F 3,95188241 1 2 3 10,45800 0,00000 0,00000 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 10,46400 10,46400 10,46400 10,46400 10,46000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00346 0,03312

0,00552

7.2.4.3 Precisin intermedia Cocana

Tabla 15. Datos obtenidos para el anlisis de precisin intermedia para cocana COCAINA Das Muestra 1 Promedio S.D C.V. C.V. Global 1 2 3 Analista Analista Analista Analista Analista Analista 1 2 1 2 1 2 7,67767 0,00058 0,00752 7,67733 0,00058 0,00752 7,67733 0,00058 0,00752 7,67767 0,00058 0,00752 7,67600 0,00346 0,04513 7,67767 0,00058 0,00752

0,01379

68

COCAINA Das Muestra 2 Promedio S.D C.V. C.V. Global COCAINA Das Muestra 3 Promedio S.D C.V. C.V. Global COCAINA Das Muestra 4 Promedio S.D C.V. C.V. Global COCAINA Das Muestra 5 Promedio S.D C.V. C.V. Global 1
Analista 1 Analista 2 Analista 1

1
Analista 1 Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

7,67767 0,00058 0,00752

7,67733 0,00058 0,00752

7,67700 0,00000 0,00000

7,67967 0,00289 0,03759

7,67733 0,00058 0,00752

7,67733 0,00058 0,00752

0,01128

1
Analista 1 Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

7,67933 0,00321 0,04186

7,67733 0,00058 0,00752

7,67733 0,00058 0,00752

7,67900 0,00346 0,04511

7,67733 0,00058 0,00752

7,67767 0,00058 0,00752

0,01951

1
Analista 1 Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

7,67733 0,00058 0,00752

7,67733 0,00058 0,00752

7,67733 0,00058 0,00752

7,68100 0,00346 0,04510

7,67733 0,00058 0,00752

7,67733 0,00058 0,00752

0,01378

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

7,67733 0,00058 0,00752

7,67767 0,00058 0,00752

7,67767 0,00058 0,00752

7,68300 0,00000 0,00000

7,67733 0,00058 0,00752

7,67733 0,00058 0,00752

0,00627

69

ANOVA Cocana

Tabla 16. Datos obtenidos para el anlisis de ANOVA para cocana ANALISIS DE VARIANZA Origen de Suma de Grados Promedio F probabilidad Valor las cuadrados de de los critico variaciones libertad cuadrados para F Entre 1E-07 1 1E-07 0,393638171 1 3,94932101 grupos Dentro de 2,235E-05 88 2,54E-07 los grupos Total 2,245E-05 89 7.2.4.4 Precisin intermedia Cocana con relacin de reas

Tabla 17. Datos obtenidos para el anlisis de precisin intermedia para cocana con relacin reas cocana/tetracosano. COCAINA Das Muestra 1 Promedio S.D C.V. C.V. Global
Analista 1

1
Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

0,63674 0,03089 4,85200

0,84892 0,00908 1,06929

0,83738 0,02461 2,93902

1,17023 0,03141 2,68426

0,86576 0,06297 7,27328

0,86598 0,02976 3,43699

3,70914

COCAINA Das Muestra 2 Promedio S.D C.V. C.V. Global

Analista 1

1
Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

0,66274 0,09245 13,94920

0,84500 0,01767 2,09153

0,89069 0,02081 2,33640

1,18021 0,02396 2,03018

0,90098 0,00829 0,91998

0,87286 0,02539 2,90929

4,03943

70

COCAINA Das Muestra 3 Promedio S.D C.V. C.V. Global

Analista 1

1
Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

0,69094 0,02236 3,23563

0,86100 0,01197 1,38988

0,86430 0,01156 1,33735

1,20475 0,02157 1,79057

0,83447 0,04581 5,48930

0,87675 0,00882 1,00610

2,37480

COCAINA Das Muestra 4 Promedio S.D C.V. C.V. Global

Analista 1

1
Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

0,68360 0,02682 3,92388

0,87010 0,01617 1,85890

0,88292 0,00746 0,84485

1,19746 0,02954 2,46680

0,86689 0,04644 5,35706

0,88390 0,01659 1,87714

2,72144

COCAINA Das Muestra 5 Promedio S.D C.V. C.V. Global

Analista 1

1
Analista 2 Analista 1

2
Analista 2 Analista 1

3
Analista 2

0,68298 0,02013 2,94678

0,84830 0,04049 4,77355

0,90287 0,02187 2,42273

1,18216 0,01541 1,30370

0,85806 0,00715 0,83377

0,89453 0,00504 0,56386

2,14073

71

ANOVA Cocana con relacin reas cocana/tetracosano

Tabla 18. Datos obtenidos para el anlisis ANOVA para cocana relacin reas. ANALISIS DE VARIANZA Origen de Suma de Grados Promedio F las cuadrados de de los variaciones libertad cuadrados Entre 0,054137773 1 0,001230404 0,06883252 grupos Dentro de 0,804389748 85 0,017875328 los grupos Total 0,85852752 89 probabilidad Valor critico para F 0,999999938 1,64490351

Al realizar el test de ANOVA para comparar la variacin de los datos entre grupos con respecto al cambio de analista, se obtiene que F experimental en todos los casos es menor que el valor critico para F, indicando que no hay dispersin significativa entre los datos. Se comparo la variacin de los resultados entre analistas debido a que estaparmetro puede introducir la mayor diferencia entre resultados. El mtodo no presenta variaciones frente al cambio de condiciones operativas, tales como el analista, la preparacin de la muestra y el da de anlisis. 7.2.7 Lmite de deteccin

Los lmites de deteccin se calcularon mediante el mtodo basado en la extrapolacin de la recta de calibrado a concentracin cero. Para calcular el limite de deteccin se

prepararon cinco niveles de concentracin (1, 5, 10, 20, 50) ppm. 7.2.5.1 Lmite de deteccin Herona

Tabla 19. Datos obtenidos de reas para cada concentracin de herona. Concentracin 5 10 20 50 rea 16922912,8 34081561,4 55075336,6 122160821

72

Curva Lmite de Deteccin Heroina

140000000 120000000 100000000 Area 80000000 60000000 40000000 20000000 0 0 10 20 30 40 50 60 Concentracin Heroina (ppm) y = 2E+06x + 9E+06 R = 0,9972

Figura 8. Curva lmite deteccin herona Tabla 20. Datos obtenidos de la desviacin de las reas para cada concentracin de herona. concentracin 5 10 20 50 Desv 1698812,1 1614921,19 1890608,55 3653101,81

Curva de extrapolacion a cero para el blanco

4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 10 Desviacion estandar y = 46679x + 1E+06

20

30 Concentracion

40

50

60

Figura 9.Curva de extrapolacin a cero para el blanco para herona.

73

 Donde: ybl: 8503545.558 Sbl: 1222435.212 n: 4 b: 2285017.054 Lmite de Deteccin = 2,6631ppm

7.2.5.2 Lmite de deteccin Cocana

Tabla 21. Datos obtenidos de reas para cada concentracin de cocana. Concentracin 1 10 20 25 rea 0,0007302 0,00260288 0,00440323 0,00568742

Curva Lmite de Deteccin de Cocana

0,006 0,005 0,004 Area 0,003 0,002 0,001 0 0 5 10 15 20 25 30 Concentracion (ppm) y = 0,0002x + 0,0005 R = 0,997

Figura 10. Curva lmite de deteccin cocana.

74

Tabla 22. Datos obtenidos de la desviacin de las reas para cada concentracin de cocana. Concentracin 1 10 20 25 Desv 0 0,00034453 0,00060448 0,00181782

Curva de extrapolacion a cero para el blanco

0,002 Desviacion estandar 0,0015 0,001 0,0005 0 0 -0,0005 5 10 15 20 25 30 Concentracion (ppm) y = 7E-05x - 0,0002

Figura 11. Curva de extrapolacin a cero para el blanco para cocana. Donde: ybl: 4.2912x10-5 Sbl: 2.1889x10-4 n: 4 b: 2.2973x10-4 Lmite de Deteccin = 1.5226ppm

Lmite de Cuantificacin= 4.8575ppm

75

7.2.5.3 Lmite de deteccin Morfina

Tabla 23. Datos obtenidos de reas para cada concentracin de morfina. Concentracin (ppm) 20 25 50 2040 3064,66667 7551 rea

Lmite de deteccin Morfina

8000 6000 4000 2000 0 0 Area y = 182,33x - 1555,2 R = 0,9996

10

20

30

40

50

60

Concentracin (ppm)

Figura 12. Curva lmite de deteccin morfina.

Curva de extrapolacion a cero para el blanco

Desviacion estandar
400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 y = 8,0191x - 35,529

10

20

30

40

50

60

Concentracin (ppm)
Figura 13. Curva de extrapolacin a cero para el blanco para morfina.

76

Tabla 24. Datos obtenidos de la desviacin de las reas para cada concentracin de Morfina Concentracin 20 25 50 Desv 36,0555128 271,503837 347,665069

Donde: ybl: 155.23 Sbl: 35.53 n: 3 b: 182.33 Lmite de Deteccin = 5.26ppm

Los lmites de deteccin calculados para Cocana, Herona y Morfina, son adecuados para las muestras que van a ser analizadas por ste mtodo, ya que las muestras incautadas que van a ser objeto de estudio se encuentran en altas concentraciones.

7.2.6 LINEALIDAD

Tabla 25. Datos obtenidos para linealidad cocana. Curva Cocana Promedio Concentracin Relacin Relacin ppm concentraciones reas 200 0,6667 0,1286 400 1,3333 0,4182 600 2 0,8386 800 2,6667 1,3258 1000 3,3333 1,8218 a -0,3816 b 0,6441 r 0,9952

Nivel 1 2 3 4 5

77

Curva Linealidad Cocaina

2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 y = 0,6441x - 0,3816 R = 0,9904 Relacion Areas

0,5

1,5

2,5

3,5

Relacin Concentraciones

Figura 14. Curva linealidad cocana.

ANOVA linealidad cuantificacin cocana Tabla 26. Datos obtenidos para el anlisis ANOVA de linealidad. ANALISIS DE VARIANZA Origen de Suma de Grados Promedio F probabilidad Valor critico las cuadrados de de los para F variaciones libertad cuadrados Entre 18,21297643 19 0,958577707 0,850661016 0,63612512 2,137008959 grupos Dentro de 22,53724312 20 1,126862156 los grupos Total 40,75021955 39

Tabla 27. Datos obtenidos para el anlisis t-student de linealidad. PARMETRO b Sb tb experimental T tabla a Sa ta experimental T tabla VALOR 0,6441 0,036665 17,5668 1,7341 -0,3816 0,081069 -4,7072 1,7341 COMPARACIN t exp> t tabla se rechaza la hiptesis nula, la pendiente es diferente de cero texp< t tabla se acepta la hiptesis nula, el intercepto no es significativamente diferente de cero

78

r r2 Tr experimental T tabla

0,9952 0,9904 17,4820 1,7341

t exp> t tabla se rechaza la hiptesis nula, el coeficiente de correlacin es significativamente diferente de cero

La ecuacin de la recta, el coeficiente de correlacin (R) y el coeficiente de determinacin (R2) para esta curva de calibracin son:

y= 0,6441x - 0,3816 R = 0,9904 R = 0,9952

Con los valores enunciados anteriormente, se infiere que la linealidad del mtodo es muy buena, debido a que el R es muy prximo a 1 y el R2 tambin es alto. Con estos datos se comprueba mediante la verificacin que los valores obtenidos en la estandarizacin del mtodo son confiables y reproducibles.

Se realizo el estudio de linealidad mediante las herramientas estadsticas, test de ANOVA y t-student. Con los cuales se pudo demostrar que la curva realizada presenta un comportamiento lineal, la pendiente es significativamente diferente de cero y el intercepto no es significativamente diferente de cero 7.2.7 Exatitud

Tabla 28. Datos obtenidos para el clculo de exactitud

Concentracin terica(ppm) 100

300

Concentracin experimental (ppm) 111,51 110,28 110,22 278,00 267,86 277,32

% error 11,51 10,28 10,22 7,33 10,71 7,56

79

700 Promedio

634,32 642,45 619,95

9,38 8,22 11,44 9,63

Con los datos obtenidos al evaluar la exactitud del mtodo se pudo determinar la proximidad con los valores convencionalmente verdaderos, encontrndose un porcentaje de error de 9,63%. ste valor no es significativamente alto, por lo cual se considera bueno para el tipo de anlisis que se realiza a las muestras o sustancias incautadas.

80

CONCLUSIONES

Se valid el mtodo por Cromatografa de Gases acoplado a Espectrometra de Masas (GC-MS) para el anlisis cualitativo de cocana, herona y morfina; y para el anlisis cuantitativo de cocana.

No se detectaron interferencias para el anlisis de cocana, herona y morfina en presencia de codena, fenacetina, lidocana, papaverina, Procana y tebana, para la condiciones del mtodo establecido

En los tiempos de retencin de las sustancias individuales como en mezcla se obtuvo una excelente repetibilidad, la desviacin estndar relativa experimenta (%RSD)l de todas las sustancias es menor al 1%.

Al realizar el test de ANOVA para cocana, herona y morfina, se obtuvo que no hay dispersin significativa entre los datos. El mtodo no presenta variaciones frente al cambio de condiciones operativas, tales como el analista, la preparacin de la muestra y el da de anlisis.

Los lmites de deteccin obtenidos para cocana, herona y morfina fueron 1.5226ppm, 2.6631ppm y 5.26ppm respectivamente, los cuales permiten determinar bajas concentraciones de los analitos en estudio. El lmite de cuantificacin de cocana fue de 4,8575 ppm, el cual permite una buena cuantificacin de las muestras incautadas analizadas en el Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses.

Esta metodologa permite la identificacin y confirmacin de cocana, herona y morfina, lo cual permite dar respuesta a las solicitudes de las autoridades, con soporte tcnico en los informes de investigacin de laboratorio.

81

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83

10. ANEXOS

Anexo 1. Especificidad. Sustancia Fenacetina Lidocana Procana Cocana Tetracosano Codena Morfina Tebana Tebana 2 Herona Papaverina
repeticin 1 repeticin 2 repeticin 3 repeticin 4 repeticin 5 Promedio

4,549 5,762 6,621 7,704 8,700 9,071 9,372 9,908 9,976 10,481 11,392

4,551 5,762 6,622 7,708 8,702 9,073 9,370 9,907 9,977 10,480 11,393

4,55 5,762 6,622 7,704 8,701 9,071 9,370 9,907 9,976 10,481 11,393

4,549 5,762 6,620 7,705 8,700 9,071 9,368 9,907 9,976 10,480 11,392

4,548 5,762 6,621 7,707 8,700 9,072 9,368 9,906 9,976 10,481 11,394

4,5494 5,762 6,6212 7,7056 8,7006 9,0716 9,3696 9,907 9,9762 10,4806 11,3928

Anexo 2. Sistema idoneidad - Resolucin y factor de selectividad. RELACION SUSTANCIA

Fenacetina Lidocana

INYECCION RESOLUCION 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 4,441 4,441 4,441 4,394 4,347 4,036 4,036 4,036 3,927 3,982 5,617 5,617 5,617 5,690 5,690 11,712 11,712 11,712 12,103 12,103

Lidocana Procana

Procana - Cocana

Cocana Tetracosano

FACTOR DE SELECTIVIDAD 1,490219 1,490219 1,490219 1,490219 1,490219 1,230377 1,230377 1,230377 1,230377 1,230645 1,236011 1,236011 1,236011 1,236011 1,235742 1,174211 1,174564 1,174564 1,174564 1,174740

84

Anexo 3. Sistema idoneidad - Resolucin y factor de selectividad. 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 2,303 2,303 2,303 2,260 2,260 6,840 6,840 6,840 6,667 6,667 0,832 0,832 0,832 0,832 0,832 5,031 5,031 5,031 5,323 5,190 4,323 4,323 4,211 4,211 4,211 1,055205 1,054889 1,054889 1,054739 1,054730 1,112169 1,112169 1,112169 1,112469 1,112311 1,008947 1,009075 1,009459 1,009330 1,008819 1,061762 1,061495 1,062123 1,061997 1,061754 1,106289 1,106408 1,105754 1,105885 1,106277

Tetracosano Codena

Codena - Morfina

Morfina - Tebana 1

Tebana 2 - Herona

Herona Papaverina

Anexo 4. Sistema idoneidad Platos Tericos Sustancia Fenacetina Lidocana Procana Cocana Tetracosano Codena Morfina Tebana Tebana 2 Herona Papaverina Platos Tericos Repeticin1 Repeticin2 Repeticin3 Repeticin4 4421,514 4624 4232,043 5542,249 11591,1 12155,063 11591,1 11591,1 19265,44 18103,977 19265,44 18103,977 26121,365 24552,971 26121,365 26121,365 26509,343 26509,343 26509,343 26509,343 53716,976 53645,686 53645,686 53645,686 235308,83 235356,75 235308,83 235308,83 185012,191 185012,191 185012,191 185012,191 35041,028 35041,028 35041,028 35041,028 98926,803 91888,06 91888,06 98926,803 22043,516 22043,516 22043,516 22934,074

85

Anexo 5. Repetibilidad Muestra 1 Fenacetina Lidocana 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 4,505 5,733 Procana 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,594 6,594 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 6,593 Cocana Tetracosano 7,677 8,666 7,677 8,664 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,669 7,677 8,669 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,668 7,677 8,670 7,677 8,670 7,677 8,670 7,677 8,669 7,678 8,669 7,678 8,669 7,677 8,669 7,677 8,669 7,677 8,669 7,677 8,669 7,677 8,669 7,677 8,669 Codena 9,034 9,034 9,034 9,034 9,034 9,034 9,034 9,034 9,034 9,033 9,033 9,033 9,033 9,033 9,033 9,033 9,033 9,033 9,034 9,033 9,034 9,034 9,034 9,034 9,033 9,033 9,033 9,033 9,033 9,033

10

86

Anexo 6. Continuacin repetibilidad.

Muestra 1

10

Morfina 9,823 9,823 9,823 9,823 9,823 9,823 9,823 9,823 9,823 9,824 9,824 9,824 9,824 9,824 9,824 9,823 9,823 9,823 9,823 9,823 9,823 9,824 9,824 9,824 9,824 9,824 9,824 9,823 9,823 9,823

Tebaina 9,893 9,893 9,893 9,894 9,894 9,894 9,897 9,897 9,897 9,897 9,896 9,897 9,893 9,893 9,893 9,893 9,893 9,893 9,897 9,897 9,897 9,897 9,896 9,896 9,893 9,893 9,893 9,894 9,894 9,894

Tebaina 2

9,966 9,966 9,966 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,867 9,867 9,867 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968 9,968

Herona Papaverina 10,458 11,357 10,458 11,357 10,458 11,358 10,458 11,358 10,458 11,358 10,458 11,358 10,462 11,358 10,463 11,358 10,463 11,358 10,462 11,358 10,462 11,358 10,462 11,358 10,459 11,358 10,459 11,358 10,459 11,358 10,462 11,358 10,462 11,358 10,462 11,358 10,462 11,358 10,462 11,358 10,462 11,358 10,463 11,358 10,463 11,358 10,463 11,358 10,462 11,358 10,462 11,358 10,462 11,358 10,458 11,358 10,458 11,358 10,458 11,358

87

Anexo 7. Precisin intermedia Morfina MORFINA Da 1 2 3 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 Muestra Inyeccin 1 9,829 9,824 9,823 9,823 9,818 9,823 1 2 9,824 9,823 9,829 9,824 9,824 9,824 3 9,829 9,829 9,824 9,824 9,824 9,824 1 9,823 9,829 9,829 9,824 9,824 9,823 2 2 9,824 9,824 9,823 9,824 9,823 9,823 3 9,824 9,824 9,823 9,824 9,824 9,824 1 9,829 9,829 9,823 9,824 9,824 9,823 3 2 9,823 9,824 9,829 9,824 9,824 9,824 3 9,824 9,829 9,824 9,829 9,823 9,824 1 9,824 9,824 9,829 9,823 9,823 9,823 4 2 9,823 9,823 9,823 9,829 9,823 9,824 3 9,823 9,829 9,829 9,823 9,824 9,824 1 9,823 9,824 9,824 9,829 9,823 9,823 5 2 9,824 9,829 9,823 9,829 9,824 9,824 3 9,823 9,824 9,824 9,829 9,823 9,823 Anexo 8. Precisin intermedia Herona HERONA Da 1 2 3 Muestra Inyeccin Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 1 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 10,458 1 2 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 10,464 3 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 10,464 1 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 10,458 2 2 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 10,458 3 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 10,464 1 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 10,464 3 2 10,464 10,464 10,464 10,464 10,464 10,464 3 10,464 10,464 10,464 10,464 10,464 10,464 1 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 10,458 4 2 10,464 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 3 10,464 10,464 10,464 10,464 10,464 10,464 1 10,464 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 5 2 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 10,458 3 10,464 10,464 10,464 10,464 10,458 10,458

88

Anexo 9. Precisin intermedia Cocana COCANA Tiempo de Retencin Da 1 2 3 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 Analista 1 Analista 2 Muestra Inyeccin 1 7,677 7,678 7,677 7,677 7,672 7,677 1 2 7,678 7,677 7,677 7,678 7,678 7,678 3 7,678 7,677 7,678 7,678 7,678 7,678 1 7,677 7,677 7,677 7,683 7,677 7,677 2 2 7,678 7,678 7,677 7,678 7,677 7,677 3 7,678 7,677 7,677 7,678 7,678 7,678 1 7,683 7,677 7,677 7,677 7,677 7,677 3 2 7,677 7,678 7,677 7,677 7,678 7,678 3 7,678 7,677 7,678 7,683 7,677 7,678 1 7,678 7,678 7,677 7,683 7,677 7,677 4 2 7,677 7,677 7,677 7,683 7,677 7,678 3 7,677 7,677 7,678 7,677 7,678 7,677 1 7,677 7,678 7,678 7,683 7,677 7,677 5 2 7,678 7,677 7,677 7,683 7,678 7,678 3 7,677 7,678 7,678 7,683 7,677 7,677 Anexo 10. Precisin intermedia Cocana Relacin reas COCANA Relacin de reas
Da Muestra 1 Inyeccin 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Analista 1 0,638940 0,604801 0,666472 0,557130 0,702107 0,728996 0,705412 0,702215 0,665191 0,713254 0,676525 0,661026 0,697293 0,659965 0,691670 1 Analista 2 0,856555 0,851311 0,838880 0,849146 0,860228 0,825619 0,861244 0,872839 0,848910 0,885577 0,871411 0,853309 0,804848 0,855067 0,884983 Analista 1 0,819677 0,865483 0,826977 0,909825 0,893717 0,868535 0,871415 0,850963 0,870523 0,884763 0,889287 0,874713 0,879338 0,922587 0,906671 2 Analista 2 1,188271 1,188458 1,133958 1,199653 1,153444 1,187542 1,225832 1,205708 1,182720 1,213194 1,215809 1,163388 1,199714 1,175916 1,170850 Analista 1 0,917941 0,883532 0,795820 0,897947 0,894643 0,910364 0,855011 0,781988 0,866410 0,845942 0,920118 0,834621 0,849909 0,860973 0,863298 3 Analista 2 0,897192 0,837917 0,862816 0,875522 0,896817 0,846239 0,886480 0,869275 0,874499 0,900912 0,867762 0,883033 0,900016 0,890094 0,893477

89

Anexo 11. Lmite de deteccin Herona Muestra 1 2 3 4 5 Promedio Desv rea [5ppm] 18455823 19248582 14909083 15324446 16676630 16922912,8 1698812,1 rea [10ppm] 36446517 35396932 32656362 32198139 33709857 34081561,4 1614921,2 rea [20ppm] 54804406 56220550 51521449 56049880 56780398 55075336,6 1890608,6 rea [50ppm] 128362968 121999174 123338549 117921407 119182007 122160821 3653101,8

Anexo 12. Lmite de deteccin Morfina Muestra 1 2 3 Promedio Desv rea [20ppm] 2010 2030 2080 2040 36,055513 rea [25ppm] 3337 3063 2794 3064,66667 271,503837 rea [50ppm] 7936 7260 7457 7551 347,665069

Anexo 13. reas Cocana y tetracosano para el lmite de deteccin Muestra 1 2 3 4 rea [1 ppm]
Cocana Tetracosano

rea [10 ppm]

Cocana Tetracosano

rea [20 ppm]

Cocana Tetracosano

rea [25 ppm]

Cocana Tetracosano

53927 53912 51924 55902

73852427 73831827 71031464 76588574

311044 93340105 481706 292159 93137489 497717 217667 106395354 509533 217918 106606731 495565

105689606 104673861 114188530 112448925

1124753 1403814 1604459 1630896

127834872 128278332 130934723 126188061

Anexo 14. Relacin de reas de cocana y tetracosano para el clculo del lmite de deteccin de cocana Muestra 1 2 3 4 Promedio Desv Relacin reas Cocana / Tetracosano [1 ppm] [10 ppm] [20 ppm] 0,0007302 0,00333237 0,00455774 0,0007302 0,00313686 0,00475493 0,000731 0,00204583 0,00446221 0,0007299 0,00204413 0,00440702 0,00073033 0,00260288 0,00440323 0 0,00060448 0,00034453 [25 ppm] 0,00879848 0,0109435 0,01225388 0,01292433 0,01123005 0,00181782

90

Anexo 15.Linealidad cocana curva cuantificacin.

Nivel 1: Concentracin 200 ppm cocana Muestra inyeccin 1 2 3 1 2 3 1 2 3 rea cocana 26339036 30505402 30901418 32454630 31643574 30425743 30983017 28795507 25826637 Promedio rea tetracosano 241826852 233197836 230820997 241891442 240149978 229742549 228367496 222838109 214037809 Relacin reas Promedio relacin reas

0,10891692 0,12453548 0,1308134 0,13387611 0,13417023 0,13279006 0,13176588 0,13243408 0,13567175 0,1285191 0,12922164 0,1206639 0,12861488

Nivel 2: Concentracin 400 ppm cocana Muestra inyeccin 1 2 3 1 2 3 1 2 3 rea cocana rea tetracosano 222901331 230695257 227526469 220223936 225787552 223531459 226885468 221602215 220472461 Relacin reas 0,38253369 0,39510844 0,41954249 0,43029186 0,41891268 0,43152357 0,41583022 0,43749356 0,43220236 Promedio relacin reas 0,39906154

85267268 91149642 95457021 94760566 94585268 96459094 94345833 96949543 95288718 Promedio

0,42690937

0,42850871 0,41815987

91

Anexo 16. Continuacin linealidad cocana curva cuantificacin.

Nivel 3: Concentracin 600 ppm cocana

Muestra inyeccin 1 2 3 1 2 3 1 2 3 rea cocana 188979037 183401924 190566026 172758909 178660267 189588328 214348305 207432379 221590567 Promedio rea tetracosano 232939491 228679728 224867367 227486952 219631350 224189607 243979984 237261122 242196963 Relacin reas 0,81127951 0,80200342 0,84745968 0,75942338 0,81345521 0,84566065 0,87854873 0,87427884 0,91491885 Promedio relacin reas 0,82024754

0,80617975

0,88924881 0,8385587

Nivel 4:Concentracin 800 ppm cocana

Muestra inyeccin 1 2 3 1 2 3 1 2 3 rea cocana 262740726 272397803 267251524 274014624 276325140 275714100 262745217 281713328 276917798 Promedio rea tetracosano 207382490 207819720 203423305 207162767 207097085 209187943 196302199 205442471 204278097 Relacin reas 1,26693785 1,31074088 1,31377044 1,32270209 1,33427827 1,31802099 1,33847312 1,37125165 1,35559222 Promedio relacin reas 1,29714972

1,32500045

1,35510566 1,32575194

92

Anexo 17. Continuacin linealidad cocana curva cuantificacin.

Nivel 5: Concentracin 1000 ppm cocana

Muestra inyeccin 1 2 3 1 2 3 1 2 3 rea cocana 345799372 341200556 358614618 321112046 309368845 321017276 338265084 329937029 337527586 Promedio rea tetracosano 190990926 191214180 198475637 176375648 171209476 176490764 179055914 182982864 181929632 Relacin reas 1,81055393 1,7843894 1,80684452 1,82061441 1,80696099 1,81888994 1,88915896 1,80310343 1,85526449 Promedio relacin reas 1,80059595

1,81548845

1,84917562 1,82175334

93