II SEMINARIO INTERNACIONAL DE POSTCOSECHA DE CTRICOS

INTA EEA Concordia

Entre Ros, Argentina
17-20 de Octubre de 2005
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DETERMINACIN DE RESISTENCIA A FUNGICIDAS
TRADICIONALES EN CEPAS DE Penicillium digitatum Y P.
italicum EN DISTINTAS QUINTAS Y EMPAQUES DE LA
REGIN.

Ing. Alim. Maringeles Cocco, EEA Concordia del INTA, Argentina.
mcocco@concordia.com.ar

Objetivo:
A fin de determinar la resistencia de cepas de Penicillium digitatum y P. italicum se
realiz un relevamiento de las mismas obtenidos de frutos podridos de empaques de la
zona.

Metodologa:
Para tal fin se tomaron muestras de hongos, tocando con un hisopo estril la zona
de esporulacin de la podredumbre.
El relevamiento comenz en febrero de 2005 en frutos que haban estado en
cmara durante algn tiempo y que ya estaban procesados. Luego se tomaron muestras
de frutos podridos en empaques y en quintas.
El hisopo con las muestras se coloc en agua estril, y luego se agit, logrndose
as la suspensin de las esporas en agua.
Luego se sembr en agar PGA distribuyendo una gota de la suspensin de
esporas, en toda la placa. Cuando los conidios comenzaron su desarrollo se los observ
al microscopio extrayndose as una espora que se repic en otra placa. Luego de
incubar a 25C, 3 o 4 das se observaba el desarrollo de una colonia, identificando los
hongos en microscopio por el Ing. Sergio Garrn, fitopatlogo de la EEA Concordia del
INTA.
Una vez identificadas las cepas de Penicillium digitatum o P. italicum, se procedi
a la evaluacin de su sensibilidad in vitro a los fungicidas thiabendazol e imazalil.
Se repicaron las cepas con anza estril en placas de Petri con diferentes
concentraciones de los distintos fungicidas en agar PGA estril:
TBZ: 1 ppm; 10 ppm y 20 ppm.
Imazalil: 0,1 ppm; 0,5 ppm y 1 ppm.
Como control se utiliz agar PGA estril sin fungicidas.
Las placas una vez sembradas, fueron almacenadas a 20C durante 7 das antes
de medir el dimetro de la colonia sembrada.
Se realizaron 3 repeticiones por cepa/fungicida/concentracin.

Para determinar la resistencia a las distintas concentraciones de los fungicidas se
determin el porcentaje de inhibicin del crecimiento mediante la frmula:
%IC = (Dim. Prom. APG Diam Prom. Trat) x 100% /Diam Prom PGA

Luego se evaluaron los resultados con el siguiente criterio:
% IC = 100 % Cepa sensible al fungicida.
% IC = 50-100 % Cepa con un porcentaje significativo de inhibicin.
% IC = 0-50% Cepa resistente al fungicida.

En total se form una coleccin con 28 cepas (en su mayora Penicillium digitatum)
identificadas y evaluada su resistencia a ambos fungicidas.


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Resultados:
De las 28 cepas analizadas, un 94 % fue resistente a TBZ y un 61% a Imazalil;
presentaron un porcentaje significativo de inhibicin un 4 % a TBZ y un 9 % a Imazalil;
mientras, que fueron sensibles a la accin de los fungicidas: un 2 % a TBZ y un 30 % a
imazalil.

Resistencia in vivo

Objetivo
Para comprobar la resistencia a los fungicidas in vivo, se tom una de las cepas
que mostraron ser resistentes in vitro a ambos fungicidas, en este caso proveniente de
un empaque.
Metodologa
Se prepar una suspensin de 10
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conidios/ml y se procedi a inocular frutos de
mandarina (Citrus reticulata) var. Nova, mediante la realizacin de una herida de 3 mm de
profundidad y 1 mm de dimetro con anza estril. Se permiti el desarrollo del hongo
durante 18 horas a temperatura ambiente antes de los tratamientos.
Se utilizaron 3 repeticiones de 50 frutos por tratamiento.
Los frutos fueron procesados en lnea de empaque experimental: lavado con
detergente neutro, aplicacin de los fungicidas segn tratamientos, aplicacin de cera de
carnauba (18 % de slidos).
Los tratamientos realizados fueron:
Tratamiento 1: Control sin fungicida.
Tratamiento 2: Fungicida TBZ (1000 ppm)
Tratamiento 3: Fungicida Imazalil (500 ppm)

Luego de tratados, se simularon condiciones de mercado interno manteniendo los
frutos durante 7 das a 20C. Por otro lado, simul una conservacin manteniendo los
frutos durante 60 das a 5C, con posterior simulacin de comercializacin a 20C durante
7 das.
El porcentaje de frutos podridos se analiz mediante la aplicacin del arcoseno de
la raz cuadrada, de la proporcin de frutos podridos para homogenizar las varianzas). Se
aplic el test LSD para la separacin de las medias con un nivel de confianza del 95%.
Resultados
En la simulacin de comercializacin de mercado interno, se observa un bajo
control de podredumbres por imazalil (39% de control); el TBZ, en cambio presenta poco
o ningn control de podredumbres. Los frutos mantenidos como control presentaron un
95% de podredumbres.
En la conservacin, en cambio, el efecto de ambos fungicidas es nulo,
observndose en muchos casos mayor porcentaje de frutos con podredumbres en los
tratados que en los frutos control (los que presentaron un 97% de podredumbres).

Conclusiones:

Los resultados de resistencia in vitro se confirman in vivo para esta cepa.
Este estudio no tiene un carcter cuantitativo de determinacin estadstica, con un
nivel de confianza y metodologa de muestreo adecuada, del porcentaje de cepas
resistentes del total presente en la poblacin. Es ms bien un monitoreo de los podridos
de la zona para comprobar su resistencia o no a los fungicidas tradicionales.
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Dentro de este contexto, encontramos un alto porcentaje de cepas resistentes
(mayores al 90% en el caso de TBZ y entre 50-70% en el caso de Imazalil), que si bien no
pueden utilizarse para inferencia estadstica del total de la poblacin, s son indicadores
de un problema importante; ya que de seguir utilizndose estos fungicidas como nico
medio de control, estas cepas se encontrarn en ventaja competitiva ante cualquier otra
cepa presente y si se dan las condiciones desarrollarn, aumentando as la incidencia de
podredumbres.

Estrategias para el control del patgeno:

Como sabemos para que este patgeno (Penicillium spp.) produzca una
podredumbre en un fruto se deben dar simultneamente algunos factores. En primer lugar
se debe tener un nivel adecuado de inculo en el ambiente, pero adems este inculo
debe ponerse en contacto con la fruta. Sin embargo, el simple contacto de los conidios
con la fruta, no son suficientes para provocar una podredumbre. Para que cualquier
espora del hongo pueda desarrollarse en el fruto, dicha espora debe adems penetrar en
el fruto (esta penetracin se da por heridas en la piel). Una vez que la espora penetra, se
deben dar las condiciones ambientales favorables para el desarrollo del patgeno, pero
an as no es suficiente, para que la podredumbre se produzca el fruto debe ser
susceptible a la misma.
Cada una de estas etapas es imprescindible para el desarrollo de podredumbres;
por lo tanto, si actuamos sobre cualquiera de ellas podemos combatir el patgeno.
En primer lugar, para evitar altos niveles de inculo, la medida recomendada es la
limpieza y desinfeccin de superficies que puedan estar en contacto con la fruta. Nuestro
grupo de trabajo pudo comprobar el efecto de la contaminacin superficial en la incidencia
de podredumbres en ensayos realizados en empaques comerciales con hisopado de
distintas superficies y extraccin de muestras de frutas en los puntos clave. Las muestras
se mantuvieron 14 das a 20C, observndose despus un aumento de podredumbres en
aquellas superficies ms contaminadas.
Sin embargo, las superficies no son el nico punto de contaminacin por alto nivel
de inculo: muchas veces el tratamiento con cloro por inmersin al inicio de la lnea de
empaque, es una fuente de inculo; sobre todo si a dicho bao llegan frutos podridos y
esporulados. En ensayos realizados en la Seccin Postcosecha se ha podido comprobar
que el cloro a 200 ppm por s mismo no tiene efecto sobre Penicillium spp., observndose
igual o mayor incidencia de podredumbres en frutos inoculados y tratados con cloro, que
los controles inoculados y no tratados.
Respecto a las vas de penetracin, la mayora de ellas se dan en la cosecha de
los frutos. Las heridas por alicate o por pednculos largos, o la ausencia de pednculos
en los frutos que son arrancados de la planta, se convierten en la puerta de entrada del
hongo al fruto. Luego de cosechado durante el transporte y en el empaque, cualquier
golpe o herida que sufre el fruto aumenta es posibilidad de penetracin. En ensayos
realizados por este grupo de trabajo se ha podido comparar una cosecha tradicional con
una cosecha ms cuidadosa, con elementos limpios e higienizados, evitando heridas y
golpes en los frutos y se observ una reduccin del 11 % de frutos podridos.
En lo que respecta a las condiciones ambientales, las temperaturas cercanas a
20C son las ms favorables para el desarrollo del patgeno, por lo que la estiba
prolongada de los frutos antes del tratamiento, muchas veces a altas temperaturas se
constituyen en las condiciones aptas para que los patgenos desarrollen.
Por ltimo, lo que respecta a la susceptibilidad de los frutos, se sabe que hay
variedades que son ms resistentes como la Naranja Valencia Late y otras,
especialmente mandarinas de piel ms delgada, como la mandarina Murcott, que son
mucho ms susceptibles al desarrollo de podredumbres.
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Por lo tanto, antes de pensar en medidas curativas, se debe optimizar el proceso
de cosecha, transporte, empaque y conservacin, de manera de prevenir la entrada de los
hongos y en caso de estar presentes, no promover su desarrollo en los frutos.

FUNGICIDAS:

Una vez optimizados los parmetros mencionados anteriormente, se aplican
estrategias para inhibir el desarrollo fngico.
Comprobada la resistencia de las cepas a los bencimidazoles y los imidazoles, hay
otros fungicidas que se estn evaluando para el control de Penicillium spp. En la seccin
postcosecha de la EEA Concordia del INTA, se estn evaluando algunos de ellos, pero
an estn en perodo de prueba, por lo que no se presentan los resultados.
Ms all de los fungicidas de sntesis, hace muchos aos que se estn estudiando
a nivel internacional distintas alternativas para su reemplazo.
Dentro de las tcnicas que se pueden mencionar se encuentran tratamientos con
gases (O
2
, CO
2
), radiaciones ionizantes (rayos gamma), rayos ultravioletas y ozono
(ambos con efectos superficiales), y los aceites esenciales. Estas tcnicas se han
estudiado en distintos cultivos a nivel internacional, pero no se ha logrado una aplicacin
industrial hasta el momento.
Otras alternativas, tambin estudiadas a nivel experimental es de los
biocontroladores, microorganismos (en general levaduras o bacterias) presentes en la
microflora natural de los frutos, que inoculados artificialmente inhiben el desarrollo de
podredumbres.
Por ltimo tenemos dos alternativas, en las que este grupo tiene algunos aos de
experiencia: los tratamientos trmicos y los productos qumicos de bajo riesgo.
Dentro de los tratamientos trmicos hemos trabajado en la evaluacin del agua
caliente (48-52C, segn las variedades de naranjas o mandarinas) aplicada por
inmersin de los frutos. Dicho tratamiento ha mostrado un control de podredumbres, pero
por s slo no es definitivo, por lo que se ha avanzado en su combinacin tanto con
fungicidas de sntesis, como con sales de sodio. Por otro lado, al elevar mucho la
temperatura para hacer ms efectivo el tratamiento, se llega a niveles de fitotoxicidad.
Otro tratamiento trmico tambin muy evaluado, y de altsima efectividad, es el
curado. El curado consiste en mantener 1 o 2 das la fruta en cmara a temperaturas de
alrededor de 37C. Dicho tratamiento tiene como desventajas la generacin de voltiles y
las prdidas de peso de los frutos, adems del inconveniente de mantener la fruta ese
tiempo en tratamiento. Sin embargo, en este ltimo tiempo en la Seccin Postcosecha de
la EEA Concordia del INTA se est trabajando en alternativas para disminuir ese perodo
a menos de 1 da.
Por ltimo, las sustancias de baja toxicidad, muchas de ellas aditivos alimentarios,
presentan un efecto importante sobre los hongos. En la seccin postcosecha se ha
trabajado durante muchos aos en las sales: carbonato y bicarbonato de sodio, con
distintas formas de aplicacin, a diferentes concentraciones, en distintas etapas del
proceso de empaque y ltimamente se est perfeccionando la aplicacin con la
combinacin con otras alternativas.