Universidad de Oriente. Ncleo Bolvar. Escuela de Ciencias de la Salud Dr. Francisco Batisttini Departamento de Ciencias Fisiolgicas. Asignatura: Bioqumica.

Actividad Enzimtica de la Amilasa Salival (Efecto de la temperatura, pH e inhibidores sobre la actividad enzimtica)

Profesora:
Zulay castillo Alacayo nenllytt Gaizan aleida Garcias kleirannell Machado eliannys Moreno diannellys Mota noriannys

Bachilleres: v-17.837.561 v-21.009.655 v-19.369.922 v-21.249.189 v-21.578.337 v-19.940.818

Parraga jhon carlos E-84.441.377

Ciudad Bolvar, octubre del 2013

INTRODUCCION

Las enzimas son consideradas como polmeros biolgicos que se encargan de catalizar reacciones qumicas eficiente y selectivamente para permitir la vida posible. Se caracterizan por poseer un elevado grado de especificidad respecto a condiciones muy definidas de pH, temperatura e inhibidores siendo muy susceptibles a los cambios de cualqu iera de estos parmetros. Lo anterior dicho se demostrar en las actividades a realizar en el presente trabajo prctico.

Estos polmeros se caracterizan por alterar las velocidades de reaccin mas no los equilibrios, convirtiendo un sustrato en uno o ms compuestos distintos. A medida que la temperatura de una enzima aumenta, la velocidad de la reaccin tambin incrementa; no obstante, esto sucede slo hasta alcanzar el punto en el que la energa cintica de la enzima exceda a la requerida para la ruptura de las fuerzas dbiles no covalentes que mantienen las estructuras secundaria y terciaria nativas de dicha enzima. En este punto, la enzima comienza a disminuir de manera brusca. Los cambios moderados en el pH afectan la actividad enzimtica por modificar la carga de los grupos R dbilmente cidos o bsicos de los aminocidos que participan, ya sea en la catlisis, en el enlace del sustrato o en la conformacin del sitio cataltico. Los cambios en el pH pueden modificar adems la carga de los sustratos. Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Puesto que el bloqueo de una enzima puede matar a un organismo patgeno o corregir un desequilibrio metablico, La unin de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima catalice su reaccin correspondiente.

OBJETIVO TERMINAL Al finalizar la prctica el estudiante debe es tar en capacidad de analizar la actividad enzimtica utilizando como modelo la enzima amilasa( salival y pancretica), varindolas concentraciones de sustrato y de enzima y sometindolas a diferentes condiciones de pH, temperatura, y presencia de inductores e inactivadores.

OBJ ET IV OS ES P EC IF IC OS :

1. Definir Km y Vmx. 2. Describir como vara la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de sustrato y concentracin de enzima. 3. Describir el efecto del pH, temperatura e inhibidores sobre la actividad de la amilasa. 4. Describir la funcin biolgica de la amilasa y su importancia biomdica. 5. Determinar la actividad de la amilasa a pH: 3 ,5,7,9 y 11. Bajo concentraciones saturantes de sustrato. 6. Determinar la actividad de la catalasa a temperaturas de 0, 37, 40 y 60C bajo concentraciones saturantes de sustrato. 7. Determinar el efecto de acarbosa, acido sulfrico, cloroformo y cloruro de sodio sobre la actividad de la enzima amilasa bajo concentraciones saturantes de sustrato. 8. Elaborar las graficas de la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de sustrato, variacin de pH, variacin de temperatura y variacin en presencia de inhibidores.

Efecto de la variacin del pH sobre la actividad de la enzima: Utilizando 1 tubos de ensayo, prepare cuatro bateras de tres tubos de ensayo cada una y otra batera con cuatro tubos que correspondra a los tubos control. En cada batera deber rotular un tubo como 1 min, 2 min y 3 min. Cada batera se preparara de la manera siguiente:
SUSTRATO (ml) BUFFER 1 (ml) INCUBACI ON Por 5 min 37 C AMILASA SALIVAL (ml) 0,5 TIEMPO DE REACCION LUGOL (ml) AGUA (ml) LECTURA DE LA ABSORBANCIA. 600nm 2,542 2,107 1,376 1 6,5 0,516 0.033 0,024 1 6,5 0,408 0,295

1 ml pH 5 1 ml pH 5

1 min 2 min 3 min

6,5

1 ml pH 5 1 ml pH 7,2 1 ml pH 7,2 1 ml pH 7,2 1 ml pH 8.0 1 ml pH 8.0 1 ml pH 8.0 1 ml pH 11.0 1 ml pH 11.0 1 ml pH 11.0

37 C

0,5

1 min 2 min 3 min

37 C

0,5

1 min 2 min

3 min 37 C 0,5 1 min 2 min 3 min 1 6,5

0,170 1,793 1,570 1,283

Tubo control: 2,984 abs

pH 5. Tubo 1min 2,984 2,542 1 ml de sustrato X X= 0,85 ml sustr.. Remanente Tubo 2 min 2,984 2,107 1 ml de sustrato X X= 0,71 ml sustr. Remanente Tubo 3 min 2,984 1,376 1 ml de sustrato X

X= 0,46 ml sustr. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,85 ml. Remanente= 0,15 ml sustrato Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 0,71 ml Remanente= 0,29 ml sustrato Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml - 0,46 ml Remanente= 0,54 ml sustrato Metabolizado.

pH 7,2

Tubo 1min 2,984 0,516 1 ml de sustrato X X= 0,17 ml sustr.. Remanente Tubo 2 min 2,984 0,033 1 ml de sustrato X X=0,01 ml sustr. Remanente Tubo 3 min 2,984 0,024 1 ml de sustrato X

X= 0,01 ml sustr. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,17 ml. Remanente= 0,83 ml sustrato Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 0,01 ml Remanente= 0,99 ml sustrato Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml - 0,01 ml Remanente= 0,99ml sustrato Metabolizado.

pH 8 Tubo 1min 2,984 0,408 1 ml de sustrato X X= 0,14 ml sustr.. Remanente Tubo 2 min 2,984 0,295 1 ml de sustrato X X=0,10 ml sustr. Remanente Tubo 3 min 2,984 0,170 1 ml de sustrato X

X= 0,06 ml sustr. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,14 ml. Remanente= 0,86 ml sustrato Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 0,10 ml Remanente= 0,9 ml sustrato Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml - 0,06 ml Remanente= 0,94 ml sustrato Metabolizado.

pH 11 Tubo 1min 2,984 1,793 1 ml de sustrato X X= 0,60 ml sustr.. Remanente Tubo 2 min 2,984 1,570 1 ml de sustrato X X=0,53 ml sustr. Remanente Tubo 3 min 2,984 1,283 1 ml de sustrato X

X= 0,43 ml sustr. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,60 ml. Remanente= 0,4 ml sustrato Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 0,53 ml Remanente= 0,47 ml sustrato Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml - 0,43 ml Remanente= 0,57 ml sustrato Metabolizado.

pH

Tiempo (min) 1 2 3 1 2 3 1

Absorbancia 2,542 2,107 1,376 0,516 0,033 0,024 0,408 0,295 0,170 1,793 1,570 1,283

mg Almidn remanente 0,85 0,71 0,46 0,17 0,01 0,01 0,14 0,10 0,06 0,60 0,53 0,43

mg Almidn Metabolizado 0,15 0,29 0,54 0,83 0,99 0,99 0,86 0,90 0,94 0,40 0,47 0,57

V0 (mg/min) 0,15 0,145 018 0,83 0,495 0,33 0,86 0,45 0,31 0,40 0,235 0,19

7,2

2 3 1

11

2 3

D. Efecto de la variacin de la temperatura sobre la actividad de la enzima. Utilizando 12 tubos de ensayo, prepare cuatro bateras de tres tubos de ensayo cada una. En cada batera deber rotular un tubo como 1 min, 2 min y 3 min. Cada batera se preparara de la manera siguiente:

SUSTRATO (ml)

BUFFER pH 7,2 (ml)

INCUBACI ON Por 5 min

AMILASA SALIVAL (ml)

TIEMPO DE REACCI ON 1 min 2 min 3 min 1 min 2 min 3 min 1 min 2min 3 min 1 min 2 min 3 min

LUGOL (ml)

AGUA (ml)

0 C

0,5

6,5

37 C

0,5

6,5

40 C

0,5

6,5

LECTURA DE LA ABSORBA NCIA. 600nm 2,128 1,890 1,810 2,507 1,067 0,339 2,047 0,811 0,738

50 C

0,5

6,5

1,810 1,249 1,039

Tubo control: 2,984 abs

 Temperatura de 0 C Tubo 1min 2,984 2,128 1 ml de sustrato X X= 0,71 ml sustr.. Remanente Tubo 2 min 2,984 1,890 1 ml de sustrato X X=0,63 ml sustr. Remanente Tubo 3 min 2,984 1,810 1 ml de sustrato X

X= 0,61 ml sustr. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,71 ml. Remanente= 0,29 ml Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 0,63 ml Remanente= 0,37 ml Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml - 0,61 ml Remanente= 0,39 ml Metabolizado.

 Temperatura de 37 C Tubo 1min 2,984 2.507 1 ml de sustrato X X= 0,84 ml sustr.. Remanente

Tubo 2 min 2,984 1,067 1 ml de sustrato X X=0,36 ml sustr. Remanente Tubo 3 min 2,984 0,339 1 ml de sustrato X X= 0,11 ml sustr. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,84 ml. Remanente= 0,16 ml Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 0,36 ml Remanente= 0,64 ml Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml - 0,11 ml Remanente= 0,89 ml Metabolizado.

 Temperatura de 40 C Tubo 1min 2,984 2,047 1 ml de sustrato X X= 0,69 ml sustr. Remanente Tubo 2 min 2,984 0,811 1 ml de sustrato X X=0,27 ml sustr. Remanente Tubo 3 min 2,984 0,738 1 ml de sustrato X

X= 0,25 ml sustr. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,69 ml. Remanente= 0,31 ml sustrato Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 0,27 ml Remanente= 0,73 ml sustrato Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml - 0,25 ml Remanente= 0,75 ml sustrato Metabolizado.

 Temperatura de 50 C Tubo 1min 2,984 1,810 1 ml de sustrato X X= 0,61 ml sustrato. Remanente Tubo 2 min 2,984 1,249 1 ml de sustrato X X=0,42 ml sustrato. Remanente Tubo 3 min: 2,984 1,039 1 ml de sustrato X

X= 0,35 ml sustrato. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,61 ml. Remanente= 0,39 ml sustrato Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 0,42 ml Remanente= 0,58 ml sustrato Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml - 0,35 ml Remanente= 0,65 ml sustrato Metabolizado.

Temperatura ( oC ) 0o

Tiempo (min) 1 2 3 1

Absorbancia 2,128 1,890 1,810 2,507 1,067 0,339 2,047 0,811 0,738 1,810 1,249 1,039

mg Almidn Remanente 0,71 0,63 0,61 0,84 0,36 0,11 0,69 0,27 0,25 0,61 0,42 0,35

mg Almidn Metabolizado 0,29 0,37 0,39 0,16 0,64 0,89 0,31 0,73 0,75 0,39

V0 (mg/min) 0,29 0,185 0,13 0,16 0,32 0,30 0,31 0.36 0,25 0,39 0,29 0,21

37o

2 3 1

40

2 3 1

50o

2 3

0,58 0,65

E. Efecto de inductores, inhibidores e inactivadores sobre la actividad de enzima: Utilizando 9 tubos de ensayo, prepare tres bateras de tres tubos de ensayo cada una. En cada batera deber rotular un tubo como 1 min, 2 min y 3 min. Cada batera se preparara de la manera siguiente .

SUST RATO (ml)

BUFF ER 1 (ml)

INCUBA CION Por 5 min

INHIBIDO R (ml)

AMILAS A SALIVAL (ml)

TIEMPO DE REACCI ON 1 min

LUGO L (ml)

AGUA (ml)

LECTURA DE LA ABSORBA NCIA A 600nm 0,847

37 C

acarbosa

0,5

2 min 3 min 1 min

5,5 1

0,813 0,686 1,705

37 C H2HSO4

0,5

2 min 3 min 1 min

5,5 1

1,469 1,400 0,324

37 C Cloroformo

0,5

2 min 3 min 1 min

5,5 1

0,024 0,009 1,040

37 C NaCL

0,5

2 min 3 min

5,5

0,492 0,474

Tubo control: 2,984 abs

 ACARBOSA Tubo 1min 2,984 0,847 1 ml de sustrato X X= 0,28 ml sustr.. Remanente Tubo 2 min 2,984 0,813 1 ml de sustrato X X=0,27 ml sustr. Remanente Tubo 3 min 2,984 0,686 1 ml de sustrato X

X= 0,23 ml sustr. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,28 ml. Remanente= 0,72 ml sustrato Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 0,27 ml Remanente= 0,73 ml sustrato Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml - 0,23 ml Remanente= 0,77 ml sustrato Metabolizado.

 H2HSO4

Tubo 1min 2,984 1,705 1 ml de sustrato X X= 0,57 ml sustr.. Remanente Tubo 2 min 2,984 1,469 1 ml de sustrato X X=0,49 ml sustr. Remanente Tubo 3 min: 2,984 1,400 1 ml de sustrato X

X= 0,47 ml sustr. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,57 ml. Remanente= 0,43 ml sustrato Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 0,49 ml Remanente= 0,51 ml sustrato Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml - 0,47 ml Remanente= 0,53 ml sustrato Metabolizado.

 CLOROFORMO

Tubo 1min 2,984 0,324 1 ml de sustrato X X= 0,11 ml sustr.. Remanente Tubo 2 min 2,984 0,024 1 ml de sustrato X X=8,04 ml sustr. Remanente Tubo 3 min 2,984 0,009 X 1 ml de sustrato

X= 3,01 ml sustr. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,11 ml. Remanente= 0,89 sustrato Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 8,04 ml Remanente= -7,24 ml sustrato Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml 3,01 ml Remanente= - 2,01 ml sustrato Metabolizado.

 NaCL

Tubo 1min 2,984 1,040 1 ml de sustrato X X= 0,35 ml sustr.. Remanente Tubo 2 min 2,984 0,492 1 ml de sustrato X X=0,16 ml sustr. Remanente Tubo 3 min 2,984 0,474 1 ml de sustrato X

X= 0,15 ml sustr. Remanente Ml de sustrato. Metabolizado: ml total ml Remanente= ml sustrato Metabolizado Tubo 1 min: 1 m1 sustr. 0,35 ml. Remanente= 0,65 ml sustrato Metabolizado Tubo 2 min: 1 ml - 0,16 ml Remanente= 0,84 ml sustrato Metabolizado Tubo 3 min: 1 ml - 0,15 ml Remanente= 0,85 ml sustrato Metabolizado.

Inhibidor

Tiempo (min) 1

Absorbancia

mg Almidn Remanente 0,28 0,27 0,23 0,57 0,49 0,47

mg Almidn Metabolizado 0,72 0,73 0,77 0,42 0,51 0,53

V0 (mg/min) 0,72 0,37 0,26 0,42 0,26 0,18

0,847 0,813 0,686 1,705 1,469 1,400

ACARBOSA

2 3 1

H2HSO4

2 3

1
CLOROFOR MO

0,324 0,024 0,009

0,11 8,04 3,01

0,89 7,24 2,01 0,65 0,84 0,85

0,89 3,62 0,67 0,65 0,42 0,28

2 3

1 NACL 2 3

1,040 0,492 0,474

0,35 0,16 0,15

ANALISIS DE RESULTADOS

A. Efecto de la variacin del pH sobre la actividad de la enzima:

El pH no afecta la actividad enzimtica directamente sino que modifica la concentracin de protones y afecta directamente a la velocidad de reaccin, Cualquier cambio brusco de pH altera el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica. Las enzimas poseen un pH caracterstico al cual su velocidad es mxima: por encima o debajo de este valor su actividad disminuye.

La velocidad de la reaccin enzimtica es directamente proporcional a la cantidad de la concentracin de enzima utilizada, a medida que aumenta la concentracin de enzima (amilasa salival) empleada en la experiencia, mayor ser la cantidad de sustrato degradado. La enzima amilasa acta ptimamente a un pH 7,2.

B. Efecto de la variacin de la Temperatura sobre la actividad de la enzima: La enzima al igual que el pH debe tener una temperatura ptima para poder tener una correcta actividad enzimtica. La Amilasa es una enzima que tiene una Vo mayor y una mejor actividad enzimtica a 37 C de temperatura, una temperatura correcta contribuye a una eficaz reaccin enzimtica de esta enzima, sin embargo no significa que no pueda actuar en otra temperatura, pero necesita de su temperatura ptima para su mejor funcionamiento.

Cuando se tiene menos temperatura (cerca o igual a 0C), hay menos reaccin en la enzima, como pudimos observar en la grfica, no es que la amilasa este inactiva, solo que la reaccin enzimtica es lenta y se vuelve lenta la reaccin del sustrato con la enzima, es decir, que la enzima si es activa solo que su accin es lenta. Sin embargo cuando se tiene una temperatura mayor a esta la enzima tiende a disminuir de igual forma su actividad y su Vo, pero esta vez si se descompone esta enzima, es decir, se desnaturaliza. No en todas las enzimas ocurre esto, hay enzimas que bien pueden trabajar a mayor temperatura, y as pueden tener una mayor velocidad de reaccin.

C. Efecto de inductores, inhibidores e inactivadores sobre la actividad de la enzima:

Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Puesto que el bloqueo de una enzima puede matar a un organismo patgeno o corregir un desequilibrio metablico, La unin de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima catalice su reaccin correspondiente.

De acuerdo a lo obtenido, podemos concluir que el cido Sulfrico es el inhibidor de mayor potencia, puesto que tuvo una mayor velocidad de reaccin, es decir, que ejerci un mayor bloqueo en la actividad de la enzima y por ende esta no puede continuar realizando su reaccin.

CONCLUSION

Las enzimas son molculas de protenas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar las reacciones qumicas que tienen lugar en los tejidos vivos, disminuyendo el nivel de la "energa de activacin" propia de la reaccin.

Las enzimas no reaccionan qumicamente con las sustancias sobre las que actan (que se denominan sustrato), ni alteran el equilibrio de la reaccin. Solamente aumentan la velocidad con que estas se producen, actuando como catalizadores. Todas las enzimas trabajan en un rango de temperaturas especficas del organismo al que pertenecen. Los aumentos de temperatura generalmente provocan un incremento de la velocidad de reaccin. Esto se debe a alteraciones de la estructura de la protena debidas a la interrupcin de uniones inicas que resultan en la estabilizacin de la estructura tridimensional de la enzima. La temperatura ptima de las enzimas humanas se encuentra generalmente entre los 35 y los 40 C; la temperatura media del organismo del ser humano es 37 C. As, las enzimas humanas comienzan a desnaturalizarse rpidamente a partir de los 40 C. Con respecto al pH algunas enzimas son sensibles y tiene un rango especfico en el que se detecta actividad; todas tienen un pH ptimo. El pH puede detener la actividad enzimtica al provocar la desnaturalizacin de la estructura proteica rompiendo enlaces inicos y puentes de hidrgeno. La mayora de las enzimas funcionan entre un pH 6 y 8; sin embargo, la pepsina estomacal tiene un pH ptimo de 2 y la tripsina de 8.

La unin de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima catalice su reaccin correspondiente. La unin del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma covalente y modifican su estructura qumica a nivel de residuos esenciales de los aminocidos necesarios para la actividad enzimtica. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones, dependiendo de si el inhibidor se une a la enzima, al complejo enzima-sustrato o a ambos.
La capacidad cataltica de algunas enzimas es verdaderamente impresionante en el caso de La amilasa, denominada tambin sacarasa, es un enzima hidrolasa que tiene la funcin de catalizar la reaccin de hidrlisis de los enlaces 1-4 del componente -Amilosa al digerir el glucgeno y

el almidn para

formar azcares simples,

se

produce

principalmente

en

las glndulas

salivales (sobre todo en las glndulas partidas) y en el pncreas. Tiene actividad enzimtica a un pH de 7. Una de las causas principales para que se puedan encontrar valores aumentados de amilasa en sangre, y en consecuencia en la orina, es la inflamacin del pncreas, es decir, una pancreatitis, o tambin, una inflamacin de una glndula salival. En el caso de las pancreatitis agudas, los niveles de amilasa se elevan ya dentro de las 8 a 12 horas, alcanzando picos, es decir, elevaciones mximas a las 24 a 36 horas, volviendo a valores normales unos dos o tres das despus. En estos casos, los valores que se alcanzan en la sangre, fcilmente pueden ser diez veces o ms de lo normal.

BIBLIOGRAFIA

Robert K. Murray, Peter A. Mayes, Darly K. Granner, Victor W. RodwellBioquimica de

Harper Capitulo 11. Edicin 14 editorial manual moderno Lehninger Albert L. 1991. Bioqumica. Ediciones Omega, S.A. 2da edicin http://es.wikibooks.org/wiki/Enfermedades_metab%C3%B3licas_ producidas_ por_ enzimas_defectuosas#CONTENIDO http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima#Implicaciones_en_enfermedades http://www.netsaluti.com/beta2/people/ver_noticias.phpid_noticia=1245 http://cuidar-su-salud.blogspot.com/2009/10/la-amilasa.html