MTODOS PARA EVALUAR LA RESPUESTA INMUNE

DRA. LUISA BARBOZA

RESPUESTA INMUNE
Poblaciones celulares Clulas T Clulas B Clulas fagocticas Clulas citotxicas Productos de la respuesta Citoquinas Inmunoglobulinas/anticuerpos Complemento Diagnstico Patologas inmunes Procesos infecciosos

Tcnicas basadas en interaccin antgenoantgenoanticuerpo

Inmunoensayos Western blot Inmunoprecipitacin Inmunohistoqumica Inmunofluorescencia

Tipos de inmunoensayo:
Radioinmunoensayo (RIA): El marcador es un istopo radioactivo. Anlisis inmunoenzimticos (EIA): El marcador es una enzima. Marcados: Conjugados a molculas que emiten seales Fluoroinmunoanlisis: El marcador es una partcula fluorescente. detectables Ensayos inmunoquimioluminiscente: La marca es una sustancia quimioluminiscente.

Inmunoensayo: Formacin de inmunocomplejos (antgeno/anticuerpo)

No marcados: Son medidos por dispersin de luz o por visualizacin directa

Precipitacin Aglutinacin Difusin radial

J lmmunol Methods. 1992; 150: 5-21

Inmunoensayos: Comparacin

ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay):

La deteccin se realiza colorimtricamente por la interaccin de un sustrato cromognico y una enzima que ha sido acoplada a un anticuerpo detector La prueba de ELISA se basa en la formacin de inmunocomplejos, (reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad conocida), para detectar la presencia de un analito de inters. La deteccin se realiza colorimtricamente por la interaccin de un sustrato cromognico y una enzima que ha sido acoplada a un anticuerpo detector. En el ELISA, uno de los reactivos se conjuga con una enzima formando un complejo con actividad inmunolgica y enzimtica.

Engvall y Perlman 1971

ELISA. Pasos
Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con la enzima. Unin del antgeno (o del anticuerpo) al soporte. soporte Formacin de los inmunocomplejos. inmunocomplejos Revelado de la reaccin enzimtica. enzimtica

Tipos de ELISA:

Evaluacin de clulas B
Anticuerpos / ELISA & CBA

Utilidad Clases y subclases de Ig

Utilidad
Deteccin de Ag y Ac Bacterias Parsitos Hongos Virus Deteccin de complejos autoinmunes Anti- DNA (Antgenos nucleares extractables: Sm - Ro - La - RNP) RNP Anti-Histonas (H1, H2A, H2B, H3, H4) LES

Utilidad
Deteccin de Acs contra antgenos de tejido Anti-tiroglobulina Anti-microsomal Anticuerpos Antifosfolpidos (Cardiolipina Cardiolipina IgGIgG-M) Detecin de Ags asociados a tumores: Ag prosttico Ag ovario (Ca125) ACE, alfafetoprotena

ELISAs y Generaciones:
1ra generacin Ag: lisado purificado de VIH Pocas sensibilidad y especificidad 2da generacin Ag: protenas recombinantes de VIH. Deteccin de VIH-1 y VIH-2 Poca sensibilidad, mejora la especificidad 3ra generacin Ag: protenas recombinantes de VIH. Deteccin del grupo O del VIH. IgM e IgG Mejora la sensibilidad 4ta generacin Capacidad para detectar al Ag p24 y anticuerpos

Tcnicas basadas en fluorescencia

Citometra de flujo InmunofluoresciaMicroscopia de fluorescencia

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Hidrodinmica
Tcnica que permite analizar partculas en suspensin que se hacen fluir a travs de un rayo de luz, las partculas interactan dispersando este haz de luz y emitiendo fluorescencia, estas seales pticas son detectadas, transformadas y almacenadas electrnicamente.

ptica

Electrnica

Separacin Celular

ptica

Fluorocromos

Utilidad: Evaluacin de la funcin hematopoytica y de leucemias/linfomas

Produccin de citocinas/ marcadores intracelulares

Ionomicina / Brefeldina A

Usos de la citometra de flujo

Evaluacin de subpoblaciones celulares Anlisis de contenido de ADN (grado de ploidia) ploidia) Proliferacin celular Produccin de citocinas/marcadores citocinas/marcadores celulares Fagocitosis Estrs oxidativo

Inmunofluorescencia

Inmunofluorescencia
Anticuerpos Antinucleares (IFI Hep-2) Anticuerpos Anti DNA Anticuerpos Antimitocondria Anticuerpos Antimsculo Liso Anticuerpos contra Polimorfonuclear Neutrfilo (ANCAS) Anti-FTA

Microscopa confocal

Microscopa confocal
Aplicaciones!!!

FITC sdica Violeta de Cresilo Acriflavina HCL

WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING
Pasos bsicos

Difusin. Capilaridad (southern like). Electrofortica.

WESTERN BLOTTING
Everybody knows western

Inmunohistoqumica

Inmunohistoqumica

Montaje de la muestra (Preservacin del tejido) Fijado e inclusin en parafina Cortado ultrafino Montaje en laminas

Inmunohistoqumica

Pretratamiento del tejido Tratamientos proteolticos o por calentamiento Inhibicin de actividades endgenas indebidas Bloqueo

Inmunohistoqumica
Aplicaciones!!!

Inmunohistoqumica
Aplicaciones!!!

Inmunohistoqumica
Aplicaciones!!!

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Desarrollada en 1986 por Kary Mullis Obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de una cantidad muy pequea Amplificar un fragmento de ADN o ARN (RT(RT -PCR) Identificacin de: Microorganismos Personas Investigacin

Pasos de la PCR

PCR en tiempo Real

PCR en tiempo Real

La amplificacin y deteccin se producen de manera simultnea La deteccin por fluorescencia permite medir durante la amplificacin la cantidad de ADN sintetizado en cada momento momento. . Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de fluorescencia y estn diseados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la amplificacin. amplificacin.

PCR en tiempo Real

PCR en tiempo Real. Ventajas

Mayor precisin, exactitud y sensibilidad Permite hacer detecciones mltiples No requiere procesamiento post-PCR. Evita la contaminacin Mayor rapidez en la obtencin de los resultados Cuantificacin del contenido del material gentico (ADN, ARN)

PCR en tiempo Real. Utilidad

dentificacin de microorganismos Cuantificacin Monitoreo de resistencia a tto. Expresin de genes

Microarray

http://www.columbia.edu/~bo8/undergraduate_research/projects/sahil_mehta_project/work.htm

Utilidad:
Expresin de genes en diferentes patologas Valor pronstico- Cncer Susceptibilidad a enfermedad Infecciones Alergias

Analytica Chimica Acta. 2007, 601: 26