RADIOINMUNOENSAYO (RIA) Esta tcnica fu desarrollada por Solomon A.

Berson y Rosalyn Yalow en 1960 para determinar la concentracin de insulina en el plasma sanguneo. Por ese motivo, R. Yalow recibi el Nobel de Medicina en 1977 (Berson muri en 1972). Hoy en da, esta tcnica se utiliza para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades muy pequeas y mezcladas con muchas otras. Es por tanto una tcnica muy sensible y muy especfica. Utilizando anticuerpos de gran afinidad se pueden detectar hasta picogramos de antgeno. (1 pg = 10-12 g). El fundamento es muy sencillo: Se mezcla una cantidad constante de antgeno marcado radioactivamente y una cantidad constante deun anticuerpo para ese antgeno Se produce la reaccin entre antgeno (Ag) y anticuerpo (Ac) se separa la fraccin de antgeno que se ha unido de la que permanece libre (hay varias formas de hacerlo. En la figura inferior se utiliza un 2 anticuerpo dirigido contra el primero) se determina la radioactividad Si la muestra contiene adems antgeno fro (no marcado), ste competir con el marcado para unirse al anticuerpo, y se observar un descenso en la medida de la radioactividad Este descenso es proporcional a la concentracin de antgeno fro en la muestra TECNICA DE ENZIMOINMUNOENSAYO. Esta tcnica, tambin se conoce como test de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). La identificacin de los complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antgeno, o bien unidas al anticuerpo. El test de ELISA puede ser directo o no competitivo, constando de los siguientes pasos: a) Se tapiza la placa con el anticuerpo especfico frente al antgeno a determinar. b) Se aade la muestra con el antgeno. c) Se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que en presencia de su sustrato da un producto coloreado soluble, este producto es cuantificado mediante el lector de ELISA

e indirecto o competitivo, se diferencia del caso anterior en que se aaden los anticuerpos, previamente incubados con la muestra, los anticuerpos que no se han unido a los antgenos de la muestra lo harn a los antgenos de los pocillos

Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa. Esta tcnica se utiliza para la medida de hormonas, antgenos de la hepatitis y otras muchas sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones. Una variante de esta tcnica de gran utilidad se conoce como test en fase slida y est orientada a la determinacin de anticuerpos frente a un determinado antgeno. Para ello el antgeno se encuentra fijo a un soporte (por ejemplo tubo de plstico). Al aadir la muestra con el posible anticuerpo se unir y podr ser detectado aadiendo anti-inmunoglobulinas marcadas con el enzima.

Otra variante de las aplicaciones inmunoenzimticas es cuando el antgeno se encuentra fijo en clulas o tejidos. Al igual que hemos visto en el apartado de inmunofluorescencia indirecta, en este caso tambin se emplean dos anticuerpos. El primero, con actividad frente a los antgenos a estudiar, y el segundo, que va dirigido frente al primero y que acta de puente con el complejo portador de la enzima. Cuando la enzima es la peroxidasa, este complejo suele ser una peroxidasa-antiperoxidasa (PAP)

La diferencia principal entre las tcnicas de RIA y ELISA es que la primera utiliza como marcador un istopo y la segunda la actividad de un enzima, as el RIA directo y el ELISA competitivo seran equivalentes, y tambin existira ELISA de inhibicin y ELISA en Sandwich. Existen inmunoensayos que se denominan homogneos en los cuales no es necesario la separacin de los inmunocomplejos de los reactivos libres. Son tcnicas muchas de ellas patentadas por diferentes firmas comerciales. Antigenos: Se definen como antgenos aquellas sustancias capaces de inducir una repuesta inmune especfica. Los antgenos exhiben (o pueden mostrar) una serie de propiedades inmunolgicas: inmunogenicidad: capacidad de inducir una respuesta inmune especfica, humoral y/o celular. En este sentido, antgeno sera sinnimo de inmungeno. clulas B + Ag clulas plasmticas + clulas B de memoria clulas T + Ag clulas T efectoras + clulas T de memoria. antigenicidad: capacidad de combinarse con anticuerpos y/o con receptores de clulas T (TCR). si una molcula es inmunognica, tambin es antignica;

sin embargo, la inversa no siempre es verdad: p. ej., ms adelante en este captulo hablaremos de los haptenos, que por s mismos no desencadenan respuesta inmune, pero que pueden ligarse a Ac preformados. alergenicidad: capacidad de inducir algn tipo de respuesta alrgica. Los alergenos son inmungenos que tienden a activar ciertos tipos de respuestas humorales o celulares que dan sntomas de alergia. tolerogenicidad: capacidad de inducir una falta de respuesta especfica en la rama celular o en la humoral.

CITOCINAS Las citocinas son una serie de sustancias producidas por clulas en respuesta a una gran variedad de estmulos y que son capaces de regular el funcionamiento de otras clulas. La naturaleza de las clulas sobre las que ejercen su efecto viene determinado por la presencia de receptores especficos. Estas sustancias pueden ser de diversos tipos entre los que se encuentran los denominadosFactores de crecimiento, polipptidos que estimulan la proliferacion de diferentes tipos celulares; las Linfocinas, producidas por linfocitos y de gran importancia en la regulacin del sistema inmune. Aunque todas las celulas del sitema inmune producen algun tipo de inteleucinas, es el linfocito Th la celula con mayor grado de participacion en la regulacion del sitema inmune a traves de las interleucinas que produce. La familia globalmente denominada Interferones, fueron originalmente identificadas como agentes capaces de proteger a las clulas frente infecciones virales. Hoy se sabe que los interferones tienen otras muchas funciones, tales como actuar en los procesos de diferenciacin y proliferacin celular as como en la modulacin del sistema inmunolgico. Los interferones pueden ser de tipo , y Una enfermedad autoinmune es una enfermedad causada porque el sistema inmunitario ataca las clulas del propio organismo. En este caso, el sistema inmunitario se convierte en el agresor y ataca a partes del cuerpo en vez de protegerlo. Existe una respuesta inmune exagerada contra sustancias y tejidos que normalmente estn presentes en el cuerpo INTERFERONES La infeccin viral de las clulas promueve la produccin de protenas llamadas interferones (IFNs), capaces de interferir la replicacin de los virus. Son de tres tipos: alfa, beta y gamma; los IFNs alfa y beta son elaborados por clulas infectadas y protegen a las sanas de las tres formas siguientes:

1. Ofrecen resistencia a la replicacin viral por activacin de los genes que destruyen el RNA de doble cadena de los virus e inhiben, adems su traslacin. 2. Inducen la expresin de los antgenos clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH-I), lo cual incrementa la posibilidad de la clula infectada del hospedero para presentar los pptidos virales y que stos sean reconocidos por los linfocitos T CD8, que ejercer una funcin citotxica. Este aumento en la clula no infectada, la protege contra el ataque de las clulas NK (natural killer o asesinas naturales). 3. Activan a las clulas NK, las cuales destruyen a las infectadas por virus de forma selectiva. 19 ACCIN DE LAS CLULAS NATURAL KILLER (NK O ASESINAS NATURALES) Estas clulas actan en etapas tempranas del proceso infeccioso causado por patgenos intracelulares como virus del herpes, Listeria monocytogenes, etc., y ejercen su accin citotxica o destructiva sobre clulas infectadas y tumorales, que incluso se incrementa entre 20 a 100 veces por las influencias de los IFNs alfa y beta, as como de la IL-12, la cual sinergia su efecto con el IFN-alfa y obliga a la clula NK a producir gran cantidad de IFN-gamma; fenmeno crucial para controlar la infeccin antes de que la clula T haya sido activada.