Coloracin GRAM

Juego de soluciones para la coloracin diferencial de GRAM para microscopa

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PRINCIPIO
La coloracin de Gram ha constituido, desde los albores de la
Bacteriologa, un elemento fundamental para la taxonomia e identificacin.
Luego del descubrimiento casual realizado por el investigador dans
Christian Gram, pasaron muchos aos durante los cuales se efectuaron
las ms variadas especulaciones sobre el mecanismo de esta coloracin.
Resultaba indudable, sin embargo, su practicidad a los fines de la
identificacin. El conocimiento de las estructuras de las membranas
bacterianas, tanto en el aspecto fsico como en su composicin molecular
que fueron logrados a partir de la dcada del sesenta, demostraron que la
coloracin de Gram distingue dos grupos de bacterias totalmente
diferentes. Las bacterias Gram positivas que presentan una gruesa capa
de peptidoglicano como estructura fundamental por sobre la membrana
citoplasmtica, y las Gram negativas, que encima de sta, presentan una
delgada capa de peptidoglicano, a la que se superpone una capa de
lipopolisacridos-lipoprotena, denominada membrana externa. La
presencia de esta membrana diferencia actualmente dos divisiones en
sistemtica bacteriana: las que no lo poseen, Firmicutes (Gram +) y las
que s, Gracilicutes (Gram -). La diferencia entre ambos grupos es pues
de enorme importancia taxonmica. El comportamiento como patgenos y
en la sensibilidad antibacteriana difieren sustancialmente; de ah que la
realizacin rpida de una coloracin de Gram, reviste enorme importancia
en Bacteriologa Clnica.
Esta coloracin permite la clasificacin de las bacterias en GRAM
POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS SEGN LA COMPOSICION DE SU
PARED CELULAR.
Por esto el complejo de color formado con la pared de las bacterias gram
positivas no puede ser removido con el agente decolorante que es el
alcohol acetona.
La clula permanece de color azul violeta, en cambio las bacterias gram
negativas, al decolorarse con el alcohol acetona, se dejan colorear con la
fuscina safranina, quedando de color rosado.

CONTENIDOS

VIOLETA CRISTAL (VIOLETA DE GENCIANA) para GRAM
Listo para su uso
Violeta cristal (Genciana) R.A. 2 g
Amonio Oxalato R.A. 1 g
Agua desmineralizada tipo II 100ml

LUGOL (Solucin Yodo/Yoduro) para GRAM
Listo para su uso
Yodo metalico R.A. 0.4 g
Potasio yoduro R.A. 0.6 g
Agua desmineralizada tipo II 100 ml

ALCOHOL ACETONA Decolorante para GRAM
Listo para su uso
Alcohol Etlico al 96% 80%
Acetona R.A. 20%

FUSCINA BASICA
Listo para su uso
Fuscina bsica R.A. 0.3 g
Fenol al 5% 90 ml
Alcohol etilico al 96% 10 ml

Alternativa
SAFRANINA GRAM
Listo para su uso
Safranina O R.A. 2 g
Alcohol etilico al 96% 100 ml


CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Las soluciones deben almacenarse entre 15C y 30C y protegidos
de la luz. Despus de abierto el contenido almacenado entre 15C y
30C y protegidos de la luz es estable hasta la fec ha de caducidad
indicada en la etiqueta.
Temperaturas inferiores a 15C puede precipitar co lorantes de las
soluciones colorantes.
Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.



PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
La solucin R1 Violeta Cristal (Violeta de Genciana) y la solucin R4
Fuscina bsica o Safranina son irritantes en contacto con piel, ojos y
mucosas.
La solucin R3 Alcohol acetona y la solucin R4 Fuscina bsica o
safranina son inflamables, por lo tanto se deben tomar los cuidados
requeridos para el manejo de productos inflamables en el laboratorio.
Observe la simbologa en los rtulos de las soluciones.
Las soluciones usadas y las caducadas deben eliminarse como
desechos especiales, debiendo cumplir las regulaciones locales para
el desecho de compuestos peligrosos.


MATERIALES ADICIONALES REQUERIDOS NO SUMINISTRADOS

Microscopio
Portaobjetos
Cubreobjetos
Cubeta de tincin
Frasco lavador
Agua
Mechero Bunsen o alcohol
Cronometro y/o timer

MUESTRAS
El material a examinar, como lquidos corporales, exudados, pus, material
de colonias lquido o slido, se aplica con el asa que ha estado al rojo
sobre un portaobjetos exento de grasa. Luego se mezcla directamente o
con 1 2 gotas de solucin fisiolgica de cloruro sdico y se extiende.
Despus de secar al aire se procede a la fijacin por calor, para lo que se
pasa 3 veces, lentamente, el lado inferior del portaobjetos (la parte del
frotis queda arriba) por la parte superior de la llama de un mechero
Bunsen. Luego se deja enfriar y se tie.


Toda muestra biolgica debe se considerada como
potencialmente infecciosa.


PROCEDIMIENTO

1. Cubrir la preparacin (Placa) fijada con
VIOLETA CRISTAL (Violeta de Genciana) para GRAM
por un (1) minuto.

2. Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.

3. Cubrir la preparacin (Placa) con
LUGOL (Solucin Yodo/Yoduro) para GRAM
por un (1) minuto.

4. Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.

5. Decolorar la placa con
ALCOHOL ACETONA Solucin decolorante para GRAM
Por 15 - 30 segundos hasta que la placa decolore totalmente.

6. Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.

7. Cubrir la preparacin (Placa) con
FUSCINA BASICA o SAFRANINA para GRAM
por un (1) minuto

8. Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua. Dejar secar al
aire.

9. Examinar al microscopio con lente de inmersin de 100X.







Coloracin GRAM
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RESULTADO

Microorganismos Gram Positivos Azul-Violeta

Microorganismos Gram Negativos Rosa-Rojo


CONTROL DE CALIDAD
Los controles puedes realizarse con bacterias Gram Positivas
(estafilococos) y bacterias Gram Negativas (Escherichia Coli). Para ello
deben utilizarse cultivos procedentes de medios de cultivo incubados
durante 18-24 horas.


NOTAS SOBRE EL EMPLEO
La tcnica descrita anteriormente puede modificarse de acuerdo con
las preferencias del operador para lograr mayor o menor intensidad de
coloracin, lo cual implica variaciones en los tiempos de tincin,
decoloracin, lavado,...
Se ha encontrado que el mal uso del ALCOHOL ACETONA Solucin
decolorante para GRAM en la fase de decoloracin puede llegar a
decolorar los grmenes GRAM POSITIVOS.
Cultivos y preparaciones viejas pueden dar resultados atpicos. Es por
ello que se recomienda utilizar cultivos de 18-24 h como mximo o
extensiones recientes.
Asimismo, es importante controlar la fijacin por el calor (dos-tres
pasos de un segundo por llama suave); un exceso del mismo puede
dar coloraciones errneas.
Agua altamente clorada puede debilitar la coloracin de contraste.



BIBLIOGRAFA
1.Gurr,E., Syntethic dyes in Biology, Medicine and Chemistry. Academic Press, London, New York. (1971).
2.Splengler, M.S., Rodeheaver, G.T., Richter, L., Edgerton, Edlich, R.F.. The Gram stain The most important
diagnostic test of infection. J.Am. College Emergency Physicians 7, 434-438. (1978).
3. Clark, George, Stains and staining (Microscopy), 4
th
edition, Williams & Wilkins, (1981).



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