Cultivo de Chia Revisr

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS
SECCIN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO E INVESTIGACIN DEPARTAMENTO DE GRADUADOS E INVESTIGACIN EN ALIMENTOS
CARACTERIZACIN DE COMPUESTOS FENLICOS PRESENTES EN LA SEMILLA Y ACEITE DE CHA (Salvia hispanica L.), MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR.
PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS EN ALIMENTOS PRESENTA:
FRANCISCO ERIK GONZLEZ JIMNEZ
DIRECTORES DE TESIS: M. EN C. MARA DEL CARMEN BELTRN OROZCO DRA. MARA GABRIELA VARGAS MARTNEZ
MXICO, D. F. DICIEMBRE 2010.
RESUMEN Actualmente el estudio de alimentos con propiedades antioxidantes ha aumentado considerablemente debido al inters que se tiene sobre los efectos benficos a la salud que previenen dichos compuestos, tales como la prevencin de cncer, enfermedades cardiovasculares y otras patologas de carcter inflamatorio. Adems de que el consumo frecuente de antioxidantes se relaciona con la disminucin de otras enfermedades como diabetes y enfermedades coronarias. En esta
investigacin se estudiaron 4 tipos de semilla de cha de los estados de Puebla y Colima y el aceite extrado de la misma, determinando la capacidad antioxidante de cada muestra por el mtodo del ABTS y la cantidad de fenoles totales con el reactivo de Folin-Ciocalteu e identificacin de los compuestos fenlicos mediante la tcnica de electroforesis capilar la cual es una herramienta muy til en el anlisis de alimentos ya que disminuye la generacin de contaminantes, el tiempo de anlisis y costo de los mismos. Los resultados obtenidos mostraron que la fraccin desengrasada de la semilla de cha contiene una elevada capacidad antioxidante (98.73 mol Trolox/g muestra) comparada con frutos como la frambuesa (84 mol Trolox/g muestra) y la manzana roja (40 mol Trolox/g muestra) que se distinguen por su alto contenido de antioxidantes. Mientras que el aceite de cha muestra valores de fenoles totales comparables (12 mg acido glico/100 g muestra) en relacin al aceite de olivo (13.36 mg acido glico/100 g muestra), en lo que respecta al anlisis mediante electroforesis capilar se lograron identificar hasta 9 compuestos fenlicos en el caso de la semilla desgrasada; cido ferlico, cido vainillinico, cido trans-cinmico, cido glico, cido cafeico, cido clorognico, miricetina, quercetina, kaempferol. En el caso del aceite se logr identificar hasta 4 compuestos fenlicos (dependiendo del tipo de aceite); cido trans-cinmico, cido clorognico, cido pcumrico y Quercetina. En general se puede considerar la semilla de cha como un alimento con potente capacidad antioxidante que incluyndola en la dieta diaria ayudara a satisfacer los requerimientos diarios de antioxidantes y prevenir ciertas enfermedades de patologa inflamatoria, adems de los beneficios que se obtendran por los dems nutrientes que contiene como es el caso de la protena, fibra, y cidos grasos omega 3 y 6.
ABSTRACT Currently the study of food with antioxidants has increased considerably due to the interest that has beneficial efects on health from such compounds, such as cancer prevention, cardiovascular and other inflammatory cancer diseases. In addition to the frequent consumption of antioxidants is related to the reduction of other diseases such as diabetes and heart disease. In this work we have studied 4 types of chia seeds from the states of Puebla and Colima and the oil extracted from it, determining the antioxidant capacity of each sample by the ABTS method and the amount of total phenolics with the Folin Ciocalteu reagent, and identification of phenolic compounds by capillary electrophoresis which is a very useful tool in food analysis because it reduces the generation of pollutants, the analysis time and cost of them. The results showed that the fraction defatted chia seeds contains a high antioxidant capacity (98.73 mmol Trolox / g sample) compared with fruits such as raspberries (84 mmol Trolox / g sample) and red apple (40 mmol Trolox / g shown) that are distinguished by their high antioxidant content. While chia oil shows comparable values of total phenols (12 mg acid gallic/100 g sample) compared to olive oil (13.36 mg acid gallic/100 g sample), with respect to analysis by capillary electrophoresis was achieved identify up to 9 phenolic compounds in the case of seed defatted; ferulic acid, vanillin, trans-cinnamic acid, gallic acid, caffeic acid, chlorogenic acid, myricetin, quercetin and kaempferol. In the case of oils were identified up to 4 phenolic compounds (depending on the type of oil), trans-cinnamic acid, chlorogenic acid, pcoumaric acid and quercetin. In general we can consider chia seed as a food with powerful antioxidant that including it in the daily diet would help meet the daily requirement of antioxidants and prevent certain inflammatory disease pathology, in addition to the benefits to be gained by the other nutrients it contains such as protein, fiber, omega 3 and 6.
INDICE GENERAL
Pgina NDICE GENERAL NDICE DE CUADROS NDICE DE FIGURAS i iii v
1.
INTRODUCCIN
1 1
1.1 Caractersticas de la semilla de cha. 1.1.2 Cultivo. 1.1.3 Usos y aplicaciones. 1.1.4 Composicin de las semillas de cha. 1.1.5 La cha como fuente de cidos grasos indispensables en la nutricin humana. Antioxidantes. Compuestos polifenlicos. 1.3.1 Biosntesis de compuestos fenlicos. 1.3.2 Actividad antioxidante de los compuestos fenlicos. 1.3.3 Anlisis de compuestos fenlicos. 1.4 Electroforesis capilar. 1.4.1 Tipos de electroforesis. 1.4.2 Flujo electroosmtico. 1.4.3 Inyeccin de la muestra. 1.5 1.6 Aplicaciones de la electroforesis capilar al anlisis de alimentos. Anlisis de compuestos fenlicos en alimentos mediante E.C. JUSTIFICACIN. OBJETIVOS. Objetivo general. Objetivos especficos. 2. 2.1 2.2 MATERIALES Y MTODOS. Materia prima. Reactivos y materiales.
2
3 5 7 8 10 11 14 15 16 17 19 23 25 25 30 31 31
1.2 1.3
31
32 32 32
i II
2.3 2.4 3. 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9
Desarrollo experimental. Equipo. MTODOS. Determinacin de protenas. Determinacin de humedad. Determinacin de fibra. Determinacin de cenizas. Determinacin de lpidos. Determinacin de carbohidratos Extraccin del aceite de cha. Extraccin de compuestos fenlicos de la semilla de cha Extraccin de compuestos fenlicos presentes en el aceite de cha. .
33 34
34
34
35 35 35 35 36 36 36 36 37 38 38
3.10 Determinacin de fenoles totales. 3.11 Capacidad antioxidante de los extractos de semilla y aceite de cha por el mtodo del radical ABTS. 3.12 Anlisis de compuestos polifenlicos mediante electroforesis capilar 4. 4.1 4.2 4.3 4.4 RESULTADOS Y DISCUSIN. Anlisis proximal Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de cha. Determinacin de la capacidad antioxidante por el mtodo del ABTS. Identificacin de compuestos fenlicos mediante electroforesis capilar. 4.4.1 Eleccin de las condiciones ptimas de anlisis 4.4.2 anlisis de los extractos de aceite de cha 5. 6. CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA
40
40 41 45 47
47 65 92 94
ii
NDICE DE CUADROS
Cuadro No. 1. Concentracin de antioxidantes en extractos de semilla de cha. Concentracin relativa de compuestos fenlicos en tejidos vegetales Las principales clases de compuestos fenlicos en frutos. 4. Mtodos para el anlisis de compuestos fenlicos mediante E.C. Anlisis proximal de la semilla de cha Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de cha. Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de cha y aceite Condiciones de anlisis en electroforesis capilar. 27 Pgina 6
2.
10
3.
11
5. 6. 7.
40 42 45
48
Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico.
50
10
51
11
51
12
52
13 14
Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico. Condiciones ptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar. Tiempos de migracin de cada estndar.
56 57
15.
58
iii
16
Condiciones ptimas experimentalmente.
de
anlisis
halladas
62
17 18
Tiempos de migracin de cada estndar. Contenido de fenoles totales, capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar. Condiciones utilizadas en el anlisis de extractos frescos de semilla y aceite de cha. Comparacin de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 das Contenido de compuestos fenlicos en extractos frescos.
64 78
19
79
20
88
20
89
iv
NDICE DE FIGURAS
Figura No. 1. 2. Cultivo de cha y clasificacin botanica Biosntesis de los compuestos fenlicos a partir de la va del shikimato y fenilalanina Formacin de fenilpropanoides, estilbenos, lignanos, ligninas, suberinas, cutinas, flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina. FAL: Fenilalanina amonio liasa. Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Electroferograma. Distribucin de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmtico resultante. Formacin de la doble capa elctrica. Perfiles de flujo para lquidos: (a) por presin electroosmtica EC, y (b) por presin hidrodinmica HPLC. Deteccin de molculas con distinta carga. Inyeccin electrocintica. Inyeccin por vaco. Semilla 094 Semilla 125 Semilla 287 Semilla 301 Desarrollo experimental Curva tipo de cido glico Fenoles totales en el aceite de cha y aceite de olivo. Pgina 1 12
3.
13
4.
14
5. 6.
18 19
7. 8.
20 21
9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16 17. 18.
22 24 24 32 32 32 32 33 41 43
19.
Contenido de fenoles totales de la semilla de cha desgrasada con otros frutos. Curva tipo Trolox expresada como M Trolox
44
20.
45
21.
Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de cha. Electroferograma de la mezcla de 8 estndares. Electroferograma de la mezcla de 8 estandares. Electroferogramas de cada par de estandares. Electroferograma de comparacin de 8 estndares. Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial. Espectros de absorcin de cada estndar. Electroferograma de 11 concentraciones de buffer. estndares a distintas
47
22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.
49 53 54 54 55 60 61
29.
Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracin de los 11 estndares. Espectros de absorcin obtenidos mediante detector de arreglo de diodos. Electroferograma del aceite comercial de cha. Electroferograma del aceite 094. Electroferograma del aceite 094 aadiendo estndares. Electroferograma del aceite 125. Electroferograma aadidos. del aceite 125 ms estndares
63
30.
64
31. 32. 33. 34. 35.
65 66 66 67 67
36. 37.
Electroferograma del aceite 287 Electroferograma aadidos. del aceite 287 ms estndares
68 68
vi
38. 39. 40. 41. 42. 43.
Electroferograma del aceite 301. Electroferograma de la semilla 094 Electroferograma de la semilla 125 Electroferograma de la semilla 287. Electroferograma de la semilla 301. Electroferograma aadidos. Electroferograma aadidos. Electroferograma aadidos. Electroferograma aadidos. de semilla 094 con estndares
69 70 70 71 73 73
44.
de
semilla
125
con
estndares
74
45.
de
semilla
287
con
estndares
75
46.
de
semilla
301
con
estndares
76
47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55.
Electroferograma del aceite fresco 094. Electroferograma del aceite fresco 125. Electroferograma del aceite fresco 287. Electroferograma del aceite fresco 301. Electroferograma de las 4 muestras de aceite de cha. Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco. Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco. Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco. Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco.
79 80 81 82 83 84 85 86 87
vii
1 INTRODUCCIN La cha (Salvia hispnica L.) es una planta herbcea de la familia de las Lamiceas; junto con el lino (Linum usitatissimum), es una de las especies vegetales con la mayor concentracin de cido graso alfa-linolnico omega 3 conocidas hasta 2006. Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas, que se utilizan molidas como ingrediente alimenticio (Cahill, 2003).
1.1 CARACTERSTICAS DE LA SEMILLA DE CHA Es una hierba anual, de hasta 1 m de altura; presenta hojas opuestas, de 4 a 8 cm de largo y 3 a 5 cm de ancho. Las flores son hermafroditas, prpuras a blancas, y aparecen en ramilletes terminales; florece entre julio y agosto en el hemisferio norte. Al cabo del verano, las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente (Figura 1). La semilla es rica en muclago, fcula y aceite; tiene unos 2 mm de largo por 1,5 mm de ancho, y es ovalada, lustrosa, y de color pardo grisceo a rojizo (Cahill, 2003).
Reino: Subreino: Divisin: Clase: Subclase: Orden: Familia: Subfamilia: Tribu: Gnero: Especie: Nombre binomial Figura 1. Cultivo de cha y clasificacin botnica
Plantae Tracheobionta Magnoliophyta Magnoliopsida Asteridae Lmiales Lamiceas Nepetoideae Mentheae Salvia S. hispanica L. S. hispanica L.
1.1.2 CULTIVO La cha prefiere suelos ligeros a medios, bien drenados, no demasiado hmedos; como la mayora de las salvias, es tolerante respecto a la acidez y a la sequa, pero no soporta las heladas. Requiere abundante sol, y no fructifica en la sombra. Antes de la conquista de Amrica, la cha era un alimentos bsico para las civilizaciones de Amrica Central y Mxico; su cultivo era probablemente el tercero en importancia econmica, superado slo por el maz (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris). Los aztecas imponan a sus pueblos tributarios una contribucin de hasta 15,000 toneladas anuales (Cahill, 2003).
Desplazada por los cereales aportados por los espaoles, el cultivo de cha desapareci durante la colonia; sobrevivi slo en reas montaosas aisladas de Mxico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y Guatemala. El mayor centro productor de Mxico est en Acatic, Jalisco, de donde se exportan cantidades crecientes a Japn, Estados Unidos y Europa. Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios pases de Amrica Latina comenz en la dcada de 1990 a replantar experimentalmente la cha en el norte de Argentina, para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos, con resultados excelentes (Ayerza, 1996).
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 1.6 t/ha, con contenidos de aceite de hasta el 38,6%. Se han suscrito contratos para la produccin comercial de cha en las provincias de Catamarca, Salta y Tucumn (Argentina), exportando el producto sobre todo a los Estados Unidos. La viabilidad en los estudios piloto se estimaba entre el 78% y el 87% (Coates, 1996).
1.1.3 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientfica que muestra que la semilla de cha comenz a usarse en la alimentacin humana hace 3,500 aos A.C. y se convirti en uno de los cultivos bsicos en el centro de Mxico entre 1,500 y 900 A.C junto con el amaranto, frjol y maz. Por siglos, la semilla de cha fue utilizada como alimento por los indgenas del oeste y del sur de Mxico. Los aztecas, entre otros usos, ofrecan la cha a los dioses como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas. Conocida como el alimento de caminatas, su uso como un alimento de resistencia y alta energa ha sido registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas, cuyos guerreros subsistan con la semilla durante sus conquistas. Los indgenas del suroeste ingeran muy poco, no ms de una cucharada llena cuando salan de marchas forzadas durante 24 horas (Ayerza, 1996).
Hacia el ao 1600 D.C. se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41% correspondan a los medicinales y el resto eran culinarios, artsticos y religiosos, entre otros. Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la formulacin de medicamentos eran en su mayora las semillas y en menor medida los tallos, hojas y races, las cuales se utilizaban principalmente para combatir las infecciones respiratorias. Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el tratamiento contra fiebres, diarreas, estreimiento, regulacin de la secrecin biliar, infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias, tambin serva como estimulante y para proteger la piel. Como alimento, las semillas de cha se tostaban y molan hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli. La harina se incorporaba en las tortillas, tamales y en varias bebidas de los aztecas llamadas Chianatoles. Los usos artsticos se restringieron al aceite de la semilla para pinturas, barnices, cosmticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las vasijas y platos. Adicionalmente, el aceite sirvi como componente bsico en la pintura para el cuerpo y rostro (Cahill, 2003).
En rituales religiosos, las semillas le servan a los aztecas como ofrenda al dios Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill, 2003). Si se mezcla una cuchara llena de cha dentro de un vaso de agua y se deja durante aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi slida. La reaccin que genera el gel se debe a la fibra soluble presente. El gel que se forma en el estmago crea una barrera fsica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los disuelven, de manera tal que disminuye la conversin de carbohidratos en azcar (Ayerza, 2002).
En adicin a los obvios beneficios para los diabticos, esta demora en la conversin de los carbohidratos en azcar genera la habilidad de crear resistencias. Los carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos. La prolongacin de su conversin a azcar estabiliza los cambios metablicos, creando as una mayor duracin en sus efectos de generacin de energa. Adems, una de las cualidades excepcionales de estas semillas son sus propiedades hidroflicas, teniendo la habilidad de absorber ms de 12 veces su peso en agua, dicha habilidad de mantener el agua ofrece la posibilidad de prolongar la hidratacin los fluidos y electrolitos que proveen el entorno que da vida a las clulas del cuerpo humano. Con semillas de cha, se puede retener la humedad, regulando la absorcin corporal de nutrientes y fluidos corporales.
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacin de los fluidos corporales, el balance electroltico se mantiene (Ayerza, 2002).
En la actualidad, mucha gente utiliza las semillas de cha en la preparacin de una bebida refrescante y popular llamad a cha fresca, tambin se puede preparar un muclago dejando reposar la semilla en agua, para utilizarla como fibra diettica o para aadirla y dar espesor a mermeladas, jaleas, yogures, mostazas, salsa trtara; igualmente es til en la industria cosmetolgica y otras aplicaciones. En el pan se puede utilizar el gel como un imitador de grasa, as como para resaltar su sabor, asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible aumentar su vida de anaquel (Beltrn y Romero, 2003).
La cha es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el pas, que los hay y son muchos. Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como frmulas para bebs, alimento para animales, barras nutritivas, entre otros. (Beltrn y Romero, 2003). Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos con -3 como huevos, pollos, carne vacuna, jamn, leche, quesos, etc. Utilizada como una fuente de cidos grasos -3, no requiere el uso de antioxidantes artificiales como las vitaminas sintticas. El aceite esencial encontrado en las hojas tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de algunos insectos a la planta (Craig, 1997). 1.1.4 COMPOSICIN DE LAS SEMILLAS DE CHA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de cha contiene un 32% de aceite y ste ofrece el contenido natural conocido ms elevado de cido -linolnico que es aproximadamente de 58.7%, la siguen el crtamo y el girasol. Asimismo, entre sus componentes principales se encuentra tambin el cido linolico que vara de 17 a 26%. El cido graso -linolnico es un cido graso insaturado -3, es muy importante para la nutricin humana, se denomina indispensable ya que debe de suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo. Se ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de cidos grasos -3, reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado con la reduccin de casos de arteriopata coronaria. Otras de sus funciones son que ayudan al mantenimiento de la piel, del pelo y del sistema reproductivo, mejoran el desempeo mental y visual, as como el de la regulacin del metabolismo del colesterol. Consumiendo 25 g de semilla de cha, se alcanza la cantidad diaria de cido graso -3 recomendada por las organizaciones de nutricin (Tosco, 2004).
Una vez que el aceite se ha extrado de la semilla de cha, el material remanente contiene un 40% de fibra, de la cual un 5% es fibra soluble o diettica. Los extractos de agua y metanol de la semilla de cha una vez que se ha prensado y extrado el aceite, han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltrn y Romero, 2003). La semilla de cha contiene una cantidad de compuestos con potente actividad antioxidante, entre los ms importantes se encuentran el y - tocoferol y antioxidantes fenlicos tales como cidos clorognico y cafeico y flavonoles (miricetina, quecetina y kaempferol). La importancia de los mismos radica en su proteccin frente a la oxidacin lipdica que afecta tanto la calidad de los alimentos como la salud de los consumidores, con el posible deterioro de las caractersticas organolpticas, funcionales y nutricionales (Taga et al. 1984). En el Cuadro 1 se muestra la concentracin de compuestos antioxidantes presentes en la semilla de cha de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por Taga et al en 1984. Cuadro 1. Concentracin de antioxidantes en extractos de semilla de cha. Compuesto cido cafeico cido clorognico Miricetina Quercetina Kaempferol cido cafeico Fuente: Taga et al. 1984. Concentracin (mol/kg de semilla de cha) 6.6 x 10-3 7.1 x 10-3 3.1 x 10-3 0.2 x 10-3 1.1 x 10-3 13.5 x 10-3
La oxidacin de los alimentos constituye un grave problema, tanto para los consumidores como para los fabricantes de alimentos. Si no se controla, la oxidacin puede producir no slo sabores extraos, sino tambin promover el envejecimiento y las enfermedades degenerativas de la edad como el cncer, las enfermedades cardiovasculares, cataratas, declinacin del sistema inmunolgico y disfuncin cerebral, de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir cidos grasos -3 y antioxidantes (Okuyama et al. 1997).
1.1.5 LA CHA COMO FUENTE DE CIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIN HUMANA. Existe un grupo de cidos grasos poli-insaturados que se denominan cidos grasos indispensables (AGE), los cuales son muy importantes para la nutricin humana pero no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de la dieta. Los AGE para el hombre son: los cidos grasos Omega-3 (cido a-linolnico y sus derivados de cadena larga) y los cidos grasos Omega-6, cuyo precursor es el cido linolico. La evidencia sugiere que los cidos grasos Omega-3 juegan un papel importante en la membrana celular. La funcin de stos cidos grasos, es aportar mayor flexibilidad a las membranas celulares, permitiendo el movimiento de protenas en su superficie y dentro de la bicapa lipdica (Lauritzen et al. 2001).
Las cantidades necesarias de cidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de vida de cada persona y de su estado fisiolgico o patolgico que pueden llevar a un aumento en las necesidades de cidos grasos. Se estima en promedio que es necesaria una ingesta del 1 % de la energa total de cidos grasos Omega-3 y un 4% de la energa total para los Omega-6. El problema radica en que el contenido de cidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacin es muy bajo, por lo que el consumo diario no alcanza a superar el 0,5 % de la energa total (Harper et al. 2006).
De todas las fuentes de cido grasos Omega-3, slo el lino (Linum usitatissimum L.) y la cha tienen su origen en cultivos agrcolas. Ambas son especies vegetales con la mayor concentracin de cido graso a-linolnico conocida hasta la fecha. Estas semillas, fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente alimenticio, o en forma natural como suplemento diettico. Las otras dos fuentes disponibles son de origen marino: las algas y el aceite de pescado (Ayerza, 1995).
La oxidacin de los alimentos constituye un grave problema, tanto para los consumidores como para los fabricantes de alimentos. Si no se controla, la oxidacin puede producir no slo sabores extraos, sino tambin promover el envejecimiento y las enfermedades degenerativas de la edad como el cncer, las enfermedades
cardiovasculares, cataratas, declinacin del sistema inmunolgico y disfuncin cerebral, de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir cidos grasos -3 y antioxidantes (Okuyama et al. 1997). 1.2 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo enzimtico y nutrientes esenciales (como vitaminas, pigmentos) cuya funcin
principal es prevenir la formacin de radicales libres e interceptar los que ya se han generado (Shi, 2001).
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales: avena, soya, t, granos de caf, especias, arroz, aceites vegetales, papas, frutas, productos microbianos. Los antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencin de enfermedades relacionadas con el estrs oxidativo.
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambin sintticos, elaborados por la industria y adicionados a los alimentos. En particular, los antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles, pueden
funcionar como compuestos reductores, interrumpen la cadena de formacin de radicales libres, inhiben o impiden la formacin de oxgenos libres e inactivan los metales pro-oxidativos. Los radicales libres se forman en el organismo mediante la respiracin aerbica y existen en diferentes formas como: anin superxido, hidroxilos, perxidos, y alcxilos. Son dainos ya que pueden reaccionar con componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi, 2001).
El dao oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades crnicas, como la oxidacin de las lipoprotenas de baja densidad (LDL), enfermedades cardiovasculares, dao oxidativo al ADN, cncer y alteracin de la visin (Serrano et al. 2007).
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son: carotenoides, fosfolpidos, tocoferoles (vitamina E), vitamina C, compuestos fenlicos, pigmentos, y sistemas enzimticos como la superxido dismutasa, catalasa y glutatin peroxidasa. Las vitaminas E, C, carotenos y los cofactores (Cu, Zn, Mn, Fe y Se) son importantes antioxidantes que funcionan de manera sinrgica inhibiendo la formacin de radicales libres. Los compuestos fenlicos interfieren con el proceso de oxidacin al reaccionar con radicales libres, quelan metales catalticos y capturan el oxgeno. Estos compuestos se dividen en dos grupos: flavonoides y no flavonoides (Cedillo, 2006).
Los polifenoles o compuestos fenlicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades crnicas como cncer, degeneracin neuronal relacionada con la edad y enfermedades cardiovasculares. Las plantas contienen una gran variedad de compuestos fenlicos como fenilpropanoides, derivados del cido benzoico, taninos y ligninas (Macheix et al. 1990).
Los flavonoides que incluyen flavonas, flavonoles y taninos condensados, funcionan como quelantes de metales, atrapan radicales libres, inhiben la xantina-oxidasa asociada a la formacin de especies reactivas del oxgeno y la proliferacin de clulas cancergenas en pulmones, estmago y colon, adems, previenen enfermedades coronarias. En general, la actividad antioxidante aumenta cuando existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidrgeno en la estructura molecular del compuesto (Wang et al. 1996).
1.3 COMPUESTOS POLIFENLICOS
Los compuestos fenlicos o polifenoles, son las sustancias que poseen un anillo aromtico, unidos a uno o ms grupos hidroxilo, incluyendo derivados funcionales (esteres, glucsidos, etc.) (Macheix et al. 1990)
En el Cuadro 2, se muestra la concentracin relativa en tejidos vegetales de estos compuestos fenlicos presentes en la naturaleza, se conocen aproximadamente 4000, siendo los flavonoides el grupo ms importante. Un nmero considerable de fenoles monocclicos simples, quinonas fenlicas, lignanos, xantonas se incluyen en esta clasificacin, al igual que materiales polimricos tales como ligninas, lignanos, melaninas y taninos (Lee, 1992). Cuadro 2. Concentracin relativa de compuestos fenlicos en tejidos vegetales. Tejido Concentraciones relativas Fruto Hojas Tronco Corteza cidos cinmicos > catequinas leucoantocianinas (flavan-3,4-dioles) > flavonoles flavonoles catequinas catequinas cidos cinmicos > leucoantocianinas leucoantocianinas > flavanoles >
cidos cinmicos Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente: Robards et al. 1999.
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3, la mayora de los cuales se pueden encontrar en las frutas, siendo estos una excelente fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al. 1990), siendo la mejor fuente algunas bebidas como el vino tinto, caf y t (Scalbert y Williamson, 2000).
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Cuadro 3. Las principales clases de compuestos fenlicos en frutos. tomos de carbono 7 9 10 13 14 15 Estructura Bsica C6 C1 C6 C3 C6 C4 C6 C1 C6 C6 C2 C6 C6 C3 C6 Clase cido hidroxibenzoico cido hidroxicinmico Cumarinas Ejemplo p hidroxibenzico cafeico scopolina Juglona Mangiferina Resveratrol quercetina, cianidina daidzena Fruto (Ejemplo) Fresa Manzana Ctricos Nuez Mango Uva Cereza Frijol de soya Frutos con hueso.
Naftoquinonas Xantonas Estilbenos Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos Fuente: Macheix et al. 1990.
Slo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma alimentacin, estos compuestos son el cido glico, sinptico, ferlico, cafeico, p cumrico, y sus derivados as como los flavonoides y sus glucsidos. Las antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas y verduras. Mientras que la mayora de los polifenoles no son pigmentos, son de igual importantes pues son responsables de la prdida de color, principalmente el oscurecimiento, que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de frutas y verduras, formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimtico y no enzimtico (Lee, 1992).
1.3.1 BIOSNTESIS DE COMPUESTOS FENLICOS. Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metablicas: la ruta del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los cidos hidroxicinmicos (Figura 2 y Figura 3); y la ruta del acetato, la cual produce fenoles simples y algunas quinonas (Decker, 1997).
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Figura 2. Biosntesis de los compuestos fenlicos a partir de la va del shikimato y fenilalanina Fuente; Harborne, 1989.
El grupo ms importante de los compuestos fenlicos son los flavonoides, incluyendo flavonas, isoflavonas y antocianidinas, las que se forman va condensacin del fenilpropano (C6 C3), con la participacin de 3 molculas de malonil coenzima A, la cual permite la formacin de chalconas, que posteriormente se ciclan en condiciones cidas. Por lo que los flavonoides tienen la estructura bsica de los difenilpropanoides (C6 C3 C6) que consiste en dos anillos aromticos unidos a 3 carbonos que forman un anillo heterocclico oxigenado. El estado oxidativo de esta cadena de 3 carbonos, determinan las diferentes clases de flavonoides. Los flavonoides incluyen antocianinas (glucsidos acilglucsidos de las antocianidinas), flavanoles (catequinas), flavonoles, flavonas, isoflavonas,
flavononoles y sus derivados.
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Figura 3. Formacin de fenilpropanoides, estilbenos, lignanos, ligninas, suberinas, cutinas, flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina. FAL: Fenilalanina amonio liasa. Fuente; Shahidi y Naczk 2004.
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1.3.2 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENLICOS A lo largo de los aos, algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos fenlicos, y un gran nmero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de cncer, potencialmente a travs de la actividad biolgica de los compuestos fenlicos as como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al. 2003). Por lo que los polifenoles pueden prevenir a la oxidacin lipdica, la mutacin del DNA y el dao del tejido (Figura 4).
Figura 4. Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente; Shahidi y Naczk, 2004.
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El comportamiento antioxidante de los compuestos fenlicos parece estar relacionado con su capacidad para quelar metales, inhibir la lipoxigenasa y captar radicales libres, aunque en ocasiones tambin pueden promover reacciones de oxidacin in vitro. (Decker, 1997).
Para que un compuesto fenlico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos condiciones bsicas: 1) Cuando se encuentre en una concentracin baja con relacin al sustrato que va a ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacin o la oxidacin mediada por un radical libre. 2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones posteriores.
1.3.3 ANLISIS DE COMPUESTOS FENLICOS.
Actualmente el, inters en los compuestos antioxidantes (fenlicos) ha aumentado debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana. Especficamente se han encontrado varios efectos preventivos en diferentes enfermedades como la prevencin de cncer, las enfermedades coronarias del corazn, los desrdenes inflamatorios, la degeneracin neurolgica, envejecimiento, etc (Madhavi et al. 1996). Este inters ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analticos capaz de manejar matrices ms complejos en que estos compuestos se descubren. En este contexto, las tcnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas, permitiendo la separacin e identificacin de compuestos que no pueden separarse fcilmente por los mtodos de HPLC tradicionales, adems de proporcionar informacin complementaria, y permitiendo el anlisis simultneo de diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al. 2002). Adems, los mtodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos de anlisis ms cortos y eficacias superiores comparadas con otras tcnicas, requiriendo volmenes de muestra y reactivos mnimos (Herrero et al. 2005).
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1.4 ELECTROFORESIS CAPILAR La electroforesis es un mtodo de separacin que se basa en las diferencias de movilidades de los analitos generadas cuando estos estn bajo la influencia de un campo elctrico. Los analitos, se encuentran en un medio conductor (electrolito soporte o buffer) y el campo elctrico es generado en el medio conductor al aplicar una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del tubo capilar. El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a migrar hacia uno u otro de los electrodos: las molculas con una carga neta negativa se desplazarn hacia el nodo (electrodo positivo) y las molculas con una carga neta positiva migrarn hacia el ctodo (electrodo negativo). La velocidad de migracin de un in, v, en el seno de un campo elctrico, medida en cm s -1, es (Curtis et al. 1994).
v = e E
Siendo e la movilidad electrofortica del in, medida en cm2V-1s-1, y E la intensidad del campo elctrico medida en Vcm-1. La movilidad electrofortica de un in es directamente proporcional a la fuerza elctrica del in Fe e inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento Ff. La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un in a partir de su tamao o radio del in solvatado r i y de la viscosidad del medio en el que migra , siendo Q la carga inica de la sustancia. Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6
rivi
Por lo tanto:
vi
Q 6 ri
Q
e
ri
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Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacin carga-tamao entre los diferentes analitos presentes en la muestra; cuanto mayor sea esta relacin ms rpido migrar el in en el seno del campo elctrico. Para iones del mismo tamao, el de mayor carga elctrica migrar ms rpidamente. Para iones con la misma carga migrar ms aquel de menor tamao, ya que tendr una fuerza de retardo por rozamiento de menor valor. La resistencia del medio al paso del in tambin influir en su movilidad electrofortica, siendo sta mayor cuanto mayor sea la viscosidad del medio. Para hacer una separacin efectiva es necesario mantener constantes las cargas de cada especie de iones, de manera que la relacin cargatamao (y por tanto la velocidad de migracin) permanezcan en el intervalo ms estrecho posible. Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier cido o base quiere decir que las separaciones electroforticas requieren disoluciones tampn (Castanon, 2006).
1.4.1 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos mtodos electroforticos ampliamente utilizados: la electroforesis convencional y la electroforesis capilar. La primera se lleva a cabo sobre papel o sobre un gel, en los que se aplica la muestra directamente. La disolucin tampn, que ser el medio conductivo, cubre la placa de papel o de gel. Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a travs de la placa. Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso de la corriente y, si es necesario, las muestras se tien para visualizarlas. En la segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos capilares de dimetros internos menores a 100 m, donde se disipa mejor el calor y no es necesario el uso de geles (aunque es posible). Esto permite la aplicacin de voltajes de hasta 30 mil volts, acelerando la separacin.
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Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas pueden detectarse directamente al aplicar el mtodo, es decir la tcnica se puede automatizar. Se obtiene una grfica de la respuesta en funcin del tiempo, llamada electroferograma (Figura 5), en la que cada pico representa una especie qumica separada (Albarrn, 2000).
Figura 5. Electroferograma. Por resolucin se puede entender la capacidad de una tcnica o mtodo para separar dos componentes en una mezcla. En la electroforesis capilar se define de forma anloga a la cromatografa: Resolucin = Separacin del pico / Anchura media del pico La separacin entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades electroforticas de las especies, y por tanto ser la anchura de la banda la que determine la mayor o menor resolucin del mtodo. El flujo electroosmtico, es el responsable de la disminucin de anchura de las bandas. Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los cromatogramas, por ello, la nomenclatura utilizada para describir la separacin de los picos o bandas en cromatografa se usa tambin para la electroforesis capilar. Sin embargo, la mayor diferencia es que la posicin de los picos se determina por las movilidades electroforticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
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con la fase estacionaria. De manera que la eficacia (o nmero de platos N) en electroforesis capilar vendra dada por: N = eV / 2D Dnde: D es el coeficiente de difusin del soluto. Por tanto, para aumentar la eficacia N, y por tanto la resolucin, es necesario aumentar lo mximo posible el potencial elctrico V (Curtis et al. 1994).
1.4.2 FLUJO ELECTROOSMTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene un lquido (electrolito), el lquido se mueve, este movimiento se denomina flujo electroosmtico (Figura 6).
Figura 6. Distribucin de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmtico resultante. La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del regulador y depende de la carga en la superficie del capilar. La causa de la aparicin del flujo electroosmtico es la formacin de la doble capa elctrica (Figura 7).
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Figura 7. Formacin de la doble capa elctrica.
Bsicamente es una separacin de la carga inica, una segregacin de capas de iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la disolucin. Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de slice fundida. A pH por encima de 3, la pared interna del capilar de slice presenta carga negativa debido a la desprotonacin de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie. Los cationes de la disolucin formarn cerca de la superficie del capilar una primera capa interna, fija, en la que los cationes, inmviles, estn unidos fuertemente a la superficie del capilar. Una segunda capa, denominada capa mvil o difusa, formada tambin por cationes aunque unidos de manera ms dbil a la superficie del capilar, migrar hacia el ctodo (electrodo negativo) en presencia de un campo elctrico. El resto de la disolucin, mediante capilaridad, migrar a la misma velocidad y en la misma direccin, lo que producir un perfil de flujo plano, a diferencia de la cromatografa, que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006).
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(a)
(b)
Figura 8. Perfiles de flujo para lquidos: (a) por presin electroosmtica EC, y (b) por presin hidrodinmica HPLC. La segregacin de las capas de iones produce un potencial en la superficie que disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie. Este potencial es grande en la capa fija, y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa difusa. El punto clave es que donde termina la capa fija an existe un cierto potencial, llamado potencial zeta , que permitir el movimiento del fluido. La velocidad del flujo electroosmtico es proporcional a la diferencia de potencial e inversamente proporcional a la viscosidad del regulador . La velocidad del FE y por consiguiente la movilidad de FE FE va a variar en funcin de los cambios que se produzcan en el regulador; por ejemplo, una variacin del pH del tampn origina un cambio en la ionizacin del capilar y un aumento de la concentracin del regulador da lugar a una disminucin del flujo electroosmtico, as como cambios en la constante dielctrica del disolvente (Castanon, 2006).
FE
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En general, cualquier alteracin en la disolucin que modifique la carga en la superficie del capilar, modifique la viscosidad del tampn o requiera un cambio en el potencial, altera la velocidad del FE. Como se ha comentado, el flujo electroosmtico da lugar a un perfil de flujo plano, lo que reduce significativamente el ensanchamiento de banda y por tanto, mejora la resolucin. Adems, la gran ventaja que presenta el FE es que la separacin electrofortica y la deteccin pueden realizarse a la vez para cationes y aniones. Sin el FE, o slo aniones, o slo cationes migraran hacia el detector. El in de carga opuesta migrara retrocediendo al final de la inyeccin, y los compuestos neutros se quedaran al final y se dispersaran por difusin. Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro, 2006).
Figura 9. Deteccin de molculas con distinta carga.
Finalmente, la velocidad de un in en la electroforesis capilar vendr determinada por su velocidad electrofortica y por su velocidad de flujo electroosmtico: Dnde: V= Velocidad del in e = Velocidad electrofortica feo= Velocidad del flujo electroosmtico E= Campo elctrico v = (e + feo) E
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En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el ctodo, los iones negativos tendrn una movilidad electrofortica e negativa, y por tanto estos iones migrarn ms lentamente que los positivos. El resultado final en el electroferograma ser una serie de picos que indican el siguiente orden de elucin: primero los cationes ms rpidos, seguidos sucesivamente de los cationes ms lentos, todas las especies neutras en una nica zona, y finalmente los aniones ms lentos seguidos de los aniones ms rpidos (Pais y Knize, 2000).
1.4.3 INYECCIN DE LA MUESTRA Debido a que el volumen de lquido que cabe en el capilar es de 4-5 L, el volumen de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros: esto implica una serie de dificultades al inyectar las muestras en el capilar. Existen varios mtodos:
Inyeccin electrocintica: se retira del depsito del regulador uno de los extremos del capilar junto con el electrodo, y se colocan en un pequeo recipiente que contiene la muestra. Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo, por lo que la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmtico y a la migracin inica. Despus el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el recipiente con la disolucin regulador (Figura 10). Inconvenientes: la muestra no es del todo representativa, ya que se introduce en el capilar ms cantidad de los iones ms mviles respecto a los ms lentos (Castaeda et al. 2005).
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Figura 10. Inyeccin electrocintica.
Inyeccin por presin: el extremo del capilar se coloca momentneamente en un pequeo recipiente que contiene la muestra, y se utiliza una diferencia de presin para conducir la muestra al interior del capilar. Esta diferencia de presin proviene de aplicar vaco en el extremo del detector o de la aplicacin de presin en el recipiente que contiene la muestra, o bien se consigue por elevacin del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura 11). La inyeccin por presin no diferencia los iones segn su movilidad, por lo que no es discriminativa (Castaeda et al. 2005).
Figura 11. Inyeccin por vaco.
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1.5 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANLISIS DE ALIMENTOS. La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anlisis de alimentos es bien reconocido y establecido actualmente. Esto se confirma con las aplicaciones en el estudio de sustancias de inters de alimentos, que van desde compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que afectan a dichos alimentos. Este hecho es corroborado por los ms de 650 trabajos publicados en los ltimos 10 aos (Castaeda et al. 2005) y manuales para el desarrollo de mtodos de anlisis de alimentos (Frazier et al. 2000).
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en trminos de tamao molecular de los componentes de los alimentos, ya que pueden analizarse desde pequeas molculas como cidos orgnicos o aminocidos hasta el anlisis de biomolculas de gran tamao, como protenas, hidratos de carbono o ADN (Castaeda et al. 2005). 1.6 ANLISIS DE COMPUESTOS FENLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE E.C.
Los compuestos fenlicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas, los cuales poseen una caracterstica comn de las estructuras; una fraccin de fenol, y se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo. Los compuestos fenlicos son de inters debido a su posible contribucin al gusto (astringencia, la amargura, y acidez) y la formacin de los sabores desagradables en los alimentos, incluidos el t, caf y jugos de diferentes frutas, durante el almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007).
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anlisis de compuestos fenlicos en ts, vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4. Cabe sealar que no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenlicos debido a que son aromticas y, por tanto, presentan la absorcin intensa en la regin UV.
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Varios anlisis han sido publicados, que puede ser utilizado como una gua para el anlisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al. 2000) (Herrero et al. 2005).
En una revisin reciente, se discutieron las estrategias que se han utilizado durante la optimizacin de los mtodos de E.C. para el anlisis fitoqumico de los compuestos bioactivos, y se propuso el uso de mltiples variables diseos experimentales para simplificar esta tarea (Li et al. 2006).
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccin rpida y simultnea de importantes antioxidantes naturales, incluidos los fenoles y antioxidantes no fenlicos, utilizando EC con un microchip con deteccin electroqumica a travs de un electrodo de carbn vtreo (Blasco et al. 2005).
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Cuadro 4. Mtodos para el anlisis de compuestos fenlicos mediante E.C. APLICACIN METODO DE DETECCIN
UV UV UV ELECTROQUMICA UV UV UV ELECTROQUMICA DAD VISIBLE CONDUCTIMETRIA
MODO E.C.
CZE CZE CZE MECK CZE MECK MECK CZE MEKC CZE CZE
BUFFER UTILIZADO
45 mM tetraborato de sodio pH 9.3 60 mM acetato de amonio pH 9.5 20 mM tetraborato de sodio pH 9.2 20 mM boratos pH 8.8 100 mM boratos pH 10 50 mM fosfatos pH 7 20 mM fosfatos pH 7 100 mM borato pH 9.24 20 mM tetraborato de sodio 50 mM boratos pH 8.4 150 mM 2-amino-2metilpropanol 100 mM boratos pH 8.7
REFERENCIA
Blasco et al. 2005. Carrasco et al 2006 Strerbova et al 2006 Li et al. 2002 Suntornsuk et al.2003. Herrero et al. 2005 Bonoli et al. 2003 Gao et al. 2002. Brandolini et al 2002. Saenz et al. 2003. Kuban et al. 2006.
Fraccin polifenlico de aceite de olivo extra virgen Polifenoles en aceite de olivo Polifenoles en queso (Bromus inermis L.) Rutina y quercetina in plantas Quercetina, rutina, kaempferol, catequina, en plantas Procianidinas despus tilisis Catequinas in t verde Resveratrol en vinos, hierbas, y en alimentos saludables Resveratrol y piceid en vino tinto Antocianinas en vino tinto cidos fenlicos (derivados de cido benzoico y cinmico) Flavonoides y compuestos fenlicos (cido ferlico, apigenina, luteolina,cido rosmarinico y cido cafeico) en Perilla frutescens L.
ELECTROQUMICA
CZE
Peng et al 2005.
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza
UV
MECK
25 mM tetraborato de sodio pH10.5
Cortacero et al. 2005.
DAD; detector de arreglo de diodos, CZE: electroforesis capilar de zona, MECK; Electroforesis micelar electrocintica.
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Otras aplicaciones de la EC en el anlisis de alimentos son mencionados por Vallejo y Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran ; Determinacin de protenas de la leche (casenas, -lactoalbminas, lactoglobulinas). Anlisis de protenas del trigo. Determinacin de carbohidratos por CZE con deteccin amperomtrica mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola). Determinacin de oligosacridos mediante CZE (rafinosa, estaquiosa y verbascosa de semillas de leguminosas). Anlisis del color/sabor de los alimentos. Anlisis de los flavonoides de la caa de azcar mediante CZE. Separacin de los cidos del lpulo que dan amargor mediante CZE y MEKC (cidos y de extracto de lpulo comercial).
Anlisis de compuestos orgnicos en alimentos: Determinacin del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de zumo de naranja). Comparacin cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacin de aditivos en alimentos (cafena, aspartamo y cido benzoico en refrescos). Determinacin cuantitativa de propionato en pan mediante CZE. Anlisis de iones inorgnicos. Anlisis cualitativo de aniones presentes en cerveza, salsa de soja, t y caf. Determinacin semicuantitativa de calcio, sodio, cloruros, fosfatos y citratos en muestras de leche.
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La versatilidad de la electroforesis capilar en el anlisis de alimentos se demuestra claramente por los numerosos y amplios mtodos presentados anteriormente. Por otra parte, la eficiencia y la rapidez de la E.C. en las separaciones fueron las principales ventajas que hacen de esta tcnica una alternativa atractiva en los laboratorios de anlisis de alimentos. La E.C an est lejos de ser tan bien establecida como las tcnicas cromatogrficas, aunque ciertamente ha ganado popularidad como una alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anlisis de protenas de los alimentos, muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE, gran poder de resolucin y velocidad de anlisis. Tal vez el mayor potencial de la EC fue encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los alimentos (Vallejo et al. 2007).
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JUSTIFICACIN
Actualmente existe un inters por el estudio de alimentos con un alto contenido en antioxidantes naturales, como son los compuestos fenlicos los cuales estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una disminucin en la aparicin de enfermedades cardiovasculares as como el cncer y otras enfermedades crnico-degenerativas que actualmente estn en crecimiento.
El inters que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos, por lo cual hace que la semilla de cha sea un alimento idneo para este estudio.
Esta investigacin tiene por objetivo caracterizar la semilla de cha cultivada en los estados de Puebla y Colima, con relacin a los compuestos polifenlicos presentes en la misma y en el aceite extrado de dicha semilla, mediante la tcnica de electroforesis capilar debido a que es una tcnica actual y muy eficiente en cuanto al anlisis qumico se refiere, las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad mnima comparndolas con otras tcnicas que son costosas, tardadas y con menor eficiencia.
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OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenlicos presentes en la semilla de cha y en el aceite extrado de la misma, procedente de los estados de Colima y de Puebla, utilizando la tcnica de electroforesis capilar, as como la medicin de la capacidad antioxidante de los mismos.
OBJETIVOS ESPECFICOS: Cuantificacin del contenido de fenoles totales, en semilla y aceite de cha.
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de cha y del aceite de cha mediante el mtodo ABTS.
Establecer una metodologa para la identificacin y cuantificacin de compuestos fenlicos mediante electroforesis capilar.
Identificar mediante el mtodo de electroforesis capilar los compuestos fenlicos presentes en la semilla y el aceite de cha.
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2. MATERIALES Y MTODOS 2.1 Materia Prima. Semilla de cha (Salvia hispnica L.) asignndoles la numeracin de tres dgitos simplemente para evitar confusiones (094, 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla, cultivadas en la misma temporada del ao y en el mismo suelo.
Figura 12. Semilla 094 Aumento 10x
Semilla 301 de cha (Salvia hispnica L.) proveniente del Estado de Colima
Figura 15. Semilla 301. Aumento 10x 2.2 Reactivos y materiales. Estndares de polifenoles grado HPLC: cido ferlico, cido vainillinico, cido trans-cinmico, cido p-cumrico, cido glico, cido cafeico, cido clorognico, Miricetina, Quercetina, Kaempferol (Sigma-aldrich). Solucin reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS) (Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) cido 6-hidroxi-2, 3, 7,8-tetrametilcroman-2-carboxlico (TROLOX) (Sigmaaldrich).
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2.3 DESARROLLO EXPERIMENTAL. En la Figura 16, se muestra el diseo experimental que se seguir para el desarrollo de esta investigacin.
II).- ELECTROFORESIS CAPILAR.
Figura 16. Desarrollo experimental.
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2.4 Equipo
Balanza analtica, marca Sartorius, modelo H110. Balanza analtica, marca Mettler-Toledo, modelo PB5001. Bomba de vaco, marca Welch, Modelo GEM 1.0, Cartuchos Diol SEP-PACK, marca Waters. Espectrofotmetro con longitud de onda visible, marca Perkin Elmer. Evaporador rotatorio, marca Yamato modelo BM100. Sonicador, marca Sonic modelo 200. Sistema de electroforesis capilar P/ACE marca MDQ Beckman-Coulter.
3. MTODOS
3.1 DETERMINACIN DE PROTENAS: Se determina por el mtodo Kjeldahl, la muestra se digiri en cido sulfrico concentrado con un catalizador, el nitrgeno se convierte en sulfato de amonio. Se agrega hidrxido de sodio concentrado para liberar amonaco, que se destila en cido estandarizado para su cuantificacin por titulacin. (AOAC 2.057, 1990). El contenido de protena se calcul de acuerdo a la siguiente ecuacin:
% proteina
(V )( N )( 0.014 )( f ) (100 ) ( w)
Dnde: V = Volumen gastado de HCl en la titulacin. N = Normalidad del HCl. 14 = Equivalente-gramo del nitrgeno. w = Peso de muestra en gramos. f = Factor proteico (6.25). El contenido de protena puede representarse en gramos por 100g de muestra, g/100g.
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3.2 DETERMINACIN DE HUMEDAD: (A.O.A.C. 14.003, 1990). El contenido de humedad, se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final, de una muestra representativa sometida a una temperatura de 130 C. 3.3 DETERMINACIN DE FIBRA: se determin el contenido de fibra cruda de acuerdo al mtodo oficial de la A.O.A.C 962.09 el cual se basa en la prdida de masa que corresponde a la incineracin del residuo orgnico que queda despus de la digestin con soluciones de cido sulfrico e hidrxido de sodio en condiciones especficas.
3.4 DETERMINACIN DE CENIZAS: Se utiliz el mtodo de calcinacin en mufla a 500 C (A.O.A.C. 14.006, 1990). El contenido de cenizas se calcul de acuerdo a la siguiente ecuacin:
%cenizas
Dnde; CC = peso inicial de la muestra. C = peso final de la muestra. w = peso de la muestra.
CC C (100) w
3.5 DETERMINACIN DE LPIDOS: Se emplea el mtodo de Soxhlet (A.O.A.C. 7.062), utilizando ter de petrleo anhidro como disolvente. Se emplea la siguiente ecuacin para el clculo de grasa: % lpidos Dnde: a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada envuelta en papel filtro. b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante. m = peso de la muestra seca en gramos. = ( a b) X 100 m
B.S.
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3.6 DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS: Los carbohidratos totales se calculan por diferencia de porcentaje de humedad, protena, lpidos, cenizas y fibra (BlancoMetzler et al. 2009). El contenido de carbohidratos totales se calcul de acuerdo a la siguiente ecuacin:
%carbohidratos totales = 100- (% humedad + % protena + % grasa + % cenizas + % fibra)
3.7 EXTRACCIN DEL ACEITE DE CHA (Garca et al. 2003). Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de cha mediante equipo Soxhlet, empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas. Los parmetros de extraccin fueron: temperatura 45 2C y flujo de disolvente de 30 gotas por minuto. La mezcla hexano-aceite se destil a presin reducida en un evaporador rotatorio a 45 C, para obtener el aceite crudo, el cual se envas en frascos de vidrio mbar con rosca y se almacen a 0 C bajo atmsfera de nitrgeno hasta su posterior evaluacin.
3.8 EXTRACCIN DE COMPUESTOS FENLICOS DE LA SEMILLA DE CHA (Reyes et al. 2007). Una masa de 10 g de harina de cha desengrasada se mezcl con 100 mL de etanol a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacin mecnica. La mezcla fue centrifugada a 2500 g durante 15 min. El sobrenadante se evapor a 40 C en un evaporador rotatorio de vaco. El residuo seco se redisolvi con 15 mL de etanol.
3.9 EXTRACCIN DE COMPUESTOS FENLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHA. (Carrasco-Pancorbo et al. 2006). Cada muestra de aceite (10 g) se disolvi en 10 mL de hexano y se hicieron pasar sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de 1mL/min, posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
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para eluir la fraccin no polar del aceite, finalmente se eluy la fraccin polar (polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de metanol y posteriormente se llev a sequedad en evaporador rotatorio al vaco a 45C y el residuo seco se redisolvi en 2 mL de metanol.
3.10 DETERMINACIN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi, 1965). El mtodo original de Folin Ciocalteau se desarroll en 1927, en la cual la oxidacin de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccin coloreada a mx a 745 750 nm:
Na2WO4 NaMoO Mo VI amarillo e
fenol MoW11O40 Mo V azul
Este mtodo es simple, sensible y preciso. Sin embargo, la reaccin es lenta a un pH cido, por lo que pierde especificidad. Singleton y Rossi (1965) mejoraron el mtodo con un reactivo heteropolianinico molibdotungstofosfrico que reduce los fenoles de forma ms especfica; la mx para el producto es 765 nm:
3H2O P2O5 13WO3 5MoO3 10H2O 3H2O P2O5 14WO3 4MoO3 10H2O
Obtencin de la curva tipo. Se prepararon soluciones de 100, 200, 300, 400 y 500 mg/L de cido glico o tnico. En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones anteriores, 100L de agua desionizada, 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 0.8 mL de una de solucin de carbonato de sodio al 7.5 %. Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes de tomar la lectura en el espectrofotmetro a 760 nm.
37
Tratamiento de la muestra. En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de agua desionizada, 100 L de muestra, 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 0.8 mL de una solucin de carbonato de sodio al 7.5%. Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotmetro, se interpol en la curva tipo y se expres el contenido de fenoles totales como equivalente de cido glico (GAE) en mg por g de muestra.
3.11 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHA: MTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al. 2003). La actividad antioxidante se determin usando el radical ABTS la generacin del ABTS+, se llev a cabo con la produccin del cromforo azul/verde ABTS +, a travs de la reaccin entre el ABTS y persulfato de amonio. El ABTS se disolvi en agua desionizada a una concentracin 7 mM. El catin del radical ABTS (ABTS +) se produjo haciendo reaccionar la solucin stock de ABTS con persulfato de amonio 2.45 mM en una relacin 1:1 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a temperatura ambiente (20C) 16 horas antes de su uso. Posteriormente se realiz una dilucin del ABTS+ con etanol, para obtener una absorbancia de 0.700 0.020 a 734 nm, la cual fue de 1:60. Para la reaccin con las soluciones estndar Trolox y los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 L de muestra con 1980 L de ABTS+ y se tom la absorbancia despus de 6 minutos.
3.12 ANLISIS DE COMPUESTOS ELECTROFORESIS CAPILAR.
POLIFENLICOS
MEDIANTE
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar equipado con un detector UV-Vis. El software 32 Karat se utiliz para el control instrumental y anlisis de datos. Las separaciones se realizaron con un capilar de slice fundida con una longitud total de 51.9 cm (41.7 cm al detector) de 50 m de dimetro interno.
38
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacin lavndolos con hidrxido de sodio 0.1 M durante 2 min, agua desionizada durante 2 min, y luego con el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar. Despus del ltimo anlisis de cada da, los capilares se lavaron con hidrxido de sodio 0.1 M durante 2 min, y finalmente con agua desionizada (10 min). Los estndares se disolvieron en etanol al 80 % a excepcin de la miricetina, quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 % en etanol. Todos los estndares fueron preparados a una concentracin de 1000 ppm.
Los extractos de las muestras de aceite de cha y fraccin desgrasada de semilla de cha fueron analizadas bajo las siguientes condiciones ptimas de anlisis encontradas experimentalmente.
Concentracin de regulador de pH: 50mM de Na2B4O7.10H2O pH: 9.4 (ajustado con NaOH 0.1N) Voltaje: 28 kV. Inyeccin de muestra: 0.5 psi durante 5 s. Temperatura de anlisis: 22C. Longitud total de capilar: 51.9 cm. Longitud efectiva: 41.7 cm Dimetro interno: 50 m. Longitud de onda: 200 nm.
39
4. RESULTADOS Y DISCUSIN.
4.1 ANLISIS PROXIMAL El anlisis proximal de las diferentes muestras de semilla de cha se presentan en el Cuadro 5, se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el tipo de semilla, sin embargo, en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra, siendo 20.71 % el valor ms bajo lo cual la convierte en un alimento con alto contenido de fibra. Cuadro 5. Anlisis proximal de la semilla de cha.
MUESTRA SEMILLA 094 SEMILLA 125 SEMILLA 287* SEMILLA 301
a
HUMEDAD % 5.840.1 5.560.1 5.680.1 6.560.1
LPIDOS a % 30.361.6 30.201.4 30.511.0 32.410.7
PROTENA a % 21.981.91 19.842.13 22.962.01 20.830.98
CARBOHIDRATOS a % 16.400.5 15.000.9 12.000.6 10.501.6
FIBRA a % 20.710.4 24.550.8 24.450.3 25.510.7
CENIZA a % 4.090.1 4.450.1 4.200.1 3.920.1
Valores expresados en base hmeda por triplicado con desviacin estndar.
De igual manera, el elevado contenido de lpidos 30-32 % la convierte en una de las semillas con ms contenido de lpidos y segn estudios realizados por Ayerza, la semilla de cha es la fuente natural ms rica en cidos grasos omega-3 comparada con el aceite de menhaden (especie de rbalo) y de algas; al mismo tiempo el aceite obtenido de la semilla de cha no tiene ni produce olor a pescado por lo que el consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de cha no necesitan un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de sabor como sucede en los productos ricos en omega 3, provenientes de pescado, para prevenir incluso, los menores cambios ocasionados por el medio ambiente. Su contenido elevado de protenas 19-23 % la convierten en una opcin viable para satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de protena en comparacin con productos crnicos como la carne de res la cual a pesar de tener aproximadamente el mismo contenido protenico que la cha, es de mayor valor econmico.
40
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha determinado que la mayora de estos forman muclagos, los cuales se sugiere que pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estmago se forma un gel el cual disminuye la conversin de azcares y esto produce una sensacin de saciedad durante ms tiempo.
4.2 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHA. En la Figura 17, se presenta la curva tipo que se utiliz para la cuantificacin de compuestos fenlicos totales, o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4 muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de cha, tomando como referencia cido glico.
2 1.8 1.6 1.4 A 765 nm 1.2
y = 0.0033x + 0.1116 R = 0.9966
1
0.8 0.6 0.4 0.2 0
100
200
300
cido glico mg/L.
400
500
600
Figura 17. Curva tipo de cido glico. Los resultados de la cuantificacin de compuestos fenlicos de los extractos de semilla y aceite de cha estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como mg equivalentes de cido glico (GAE) por 100 gramos de muestra.
41
Cuadro 6. Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de cha. Fraccin de semilla mg cido Aceite de cha mg cido desengrasada glico/100 g extrado de la semilla glico/100 g a a muestra muestra 5.920.42 Aceite de cha prensado en fro Semilla 094* 1104.716.05 Aceite 094* 11.490.53 Semilla125* Semilla287* Semilla301*
a
854.295.82 1052.613.36 1091.3413.33
Aceite 125* Aceite 287* Aceite 301*
2.470.13 3.800.23 5.210.23
Valores expresados en base hmeda. * Anlisis realizado por triplicado.
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenlicos que contiene el aceite extrado de la semilla de cha y la fraccin desengrasada de la misma semilla, esto se pens en un principio que era posiblemente causado por el mtodo de extraccin del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenlicos no son solubles en disolventes no-polares se consider que la cantidad que pudiera existir de polifenoles en la semilla se quedaran en la fraccin desengrasada y no en el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras. Sin embargo, para descartar o comprobar lo anterior, se adquiri aceite comercial de cha el cual se obtiene por prensado en fro de acuerdo a especificaciones del fabricante, y los resultados obtenidos mostraron que el mtodo de extraccin del aceite no influye en esta determinacin de fenoles totales y que todas las muestras de aceite de cha obtenido por extraccin con disolvente estn en el mismo orden de contenido de fenoles totales en comparacin con el aceite de cha obtenido por prensado en frio. Independientemente de qu cantidad de compuestos fenlicos existen en el aceite y la semilla de cha desengrasada, s se puede observar que existen valores desde 854.29 GAE hasta los 1104.71 GAE entre los diferentes tipos de semillas de cha lo cual indica que posiblemente y de ser necesario se podra distinguir una variedad de otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales.
42
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et al en 2009 y su comparacin con las diferentes muestras de aceite de cha, es aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de cha (Figura 18), a excepcin de una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo, esta diferencia es probablemente debido al tipo de la semilla y no por el mtodo de obtencin del aceite.
20
mg cido glico/100 g muestra
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
Figura 18. Fenoles totales en el aceite de cha y aceite de olivo.
Respecto a la cantidad de compuestos fenlicos presentes en la semilla de cha desengrasada puede observarse que, al ser comparados estos resultados con diferentes muestras de cereales (quinua, kaiwa) y amaranto se pone en evidencia la cantidad de polifenoles que contiene la cha, que va desde los 904.01 hasta 1172.72 GAE/100 g, mientras que los cereales de origen andino slo llegan a alcanzar los 159.02 mg GAE/100 g en el caso de la quinua (Figura 19).
43
Al ser comparada la semilla de cha con frutos que se sabe que tienen un alto contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por GarcaAlonso (2003), se observa que de igual forma que con los cereales, la semilla de cha tiene una cantidad superior de compuestos fenlicos, a excepcin de la muestra 125 que se encuentra en el mismo orden (900 mg cido glico/100 g muestra).
1400
1200 mg cido glico/100 g muestra humeda 1000 800 600 400 200 0
1172.72
985.33 910 904.01
1116.23
1167.2
159.02
97.39
34.55
Figura 19. Contenido de fenoles totales de la semilla de cha desgrasada con otros frutos. Fuente: Garca-Alonso et al. 2003.
44
4.3 DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MTODO DEL ABTS. Previamente se realiz una curva tipo de Trolox como compuesto estndar, debido a su analoga con la vitamina E, las unidades en las que se realiz la curva tipo fueron: Absorbancia vs M Trolox (Figura 20).
0.8 0.7 0.6
y = -0.0292x + 0.6899 R = 0.9904
ABSORBANCIA 734nm
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6
M TROLOX
10
12
14
16
Figura 19. Curva tipo Trolox expresada como M Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7. Cuadro 7. Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de cha y aceite.
Semilla desengrasada Semilla094 Semilla125 Semilla287 Semilla301 (M Trolox/g muestra)a 283.2835.31 493.6751.12 227.8120.37 361.5419.57 (mol Trolox/g muestra)a 56.657.06 98.7310.22 45.564.07 72.303.92 Aceite extrado de la semilla Aceite 094 Aceite 125 Aceite 287 Aceite 301 Aceite comercial de cha prensado
a
(M Trolox/g muestra)a 9.670.79 7.390.39 6.590.20 22.910.91 10.700.52
(mol Trolox/g muestra)a 1.930.16 1.480.08 1.320.04 4.580.18 2.14.10
Valores expresados en base hmeda, por triplicado.
45
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de cha del presente estudio y la fraccin desengrasada de la misma semilla, muestran una relacin directa con el contenido total de fenoles, es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de cha muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la fraccin desengrasada, estos resultados corroboran que en el aceite de cha la cantidad de compuestos fenlicos es mnima en relacin con la fraccin desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante, sin embargo, al igual que en la determinacin de fenoles totales existen diferencias importantes de actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de cha, lo cual es de inters debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos fenlicos que actan como antioxidantes. En el Figura 21 se hace la comparacin de la actividad antioxidante de las semillas de cha estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos en un estudio realizado por Garca-Alonso et al (2003) bajo el mismo mtodo (ABTS). Puede observarse que la muestra de cha 125 presenta una mayor capacidad antioxidante que el resto de las muestras de cha e incluso de frutos que comnmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza, frambuesa, manzana, granada y kiwi. Esto nos indica que al igual que en el aceite de cha, la muestra 125 proveniente del estado de Puebla, contiene un mayor poder antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo, lo cual indica que efectivamente cada muestra de semilla de cha contiene un perfil polifenlicos diferente al resto.
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenlicos que contiene cada tipo de semilla de cha analizada en el presente estudio, se puede observar que todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en antioxidantes como la frambuesa, cereza, manzana roja, granada y kiwi (Figura 21) lo cual convierte a la semilla de cha en un alimento viable para complementar la dieta diaria en antioxidantes.
46
120
98.73
100
84
mol Trolox/g muestra 80 60
82 69 56.65 40 45.56 38 72.3
40 20
Figura 21. Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de cha. Fuente: Garca-Alonso et al. 2003. 4.4 IDENTIFICACIN DE ELECTROFORESIS CAPILAR. COMPUESTOS FENLICOS MEDIANTE
4.4.1 ELECCIN DE LAS CONDICIONES PTIMAS DE ANLISIS. Con el objetivo de identificar los compuestos fenlicos presentes en las muestras de semilla y aceite de cha se realiz una base de datos en el equipo de electroforesis capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estndares incluyendo vainillina como estndar interno: Vainillina cido tnico cido clorognico cido ferlico cido p-cumrico cido vainillinico cido cafeico cido glico
47
Todos los estndares utilizados fueron grado HPLC, para garantizar su pureza. El primer procedimiento fue obtener las condiciones ptimas para que el mtodo fuera reproducible y confiable para el posterior anlisis de los extractos de las muestras de aceite y de semilla de cha desgrasada.
Se procedi a hacer una mezcla de todos los estndares mencionados anteriormente para lo cual se tom 0.5 mL de una solucin de 1000 mg/L de cada estndar disuelto en etanol al 80 % y se mezcl en un bao sonicador con el objetivo de mejorar la disolucin de la mezcla. Las condiciones utilizadas para este anlisis se muestran en el Cuadro 8. Cuadro 8. Condiciones de anlisis en electroforesis capilar. Tiempo de inyeccin Presin de inyeccin Voltaje Tiempo de anlisis 8 segundos Temperatura 0.5 psi 24 kV 30 min. Dimetro del capilar Longitud del capilar 25C 75 m 50 cm
Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tom un vial y se le coloc una alcuota de la mezcla de los estndares mencionados anteriormente, sin embargo, en 3 ocasiones la corriente dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logr finalizar el anlisis bajo esas condiciones, esta cada de corriente pudo ser provocada debido a la concentracin de metanol que contena la mezcla proveniente de la disolucin de los estndares en dicho disolvente, por lo anterior se procedi a diluir la mezcla de estndares antes de colocarla en el vial, esta dilucin se realiz con agua desionizada as como todas las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar, la dilucin de la mezcla es en relacin 1:1, para que de esta forma el metanol se redujera un 25% y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22).
48
Tambin se disminuy el tiempo de inyeccin de la muestra a 5 segundos en lugar de 8 segundos que tena anteriormente, de este modo se redujo el volumen de muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar. Bajo estas condiciones se logr obtener el electroferograma de los estndares que se muestran en la Figura 22.
0.0775 0.0750 0.0725 0.0700 0.0675 0.0650
1.-Vainillina 2.-cido tnico 3.-cido clorognico 4.-cido ferlico 5.-cido p-cumrico 6.-cido vainillinico 7.-cido cafeico 8.-cido glico
0.0775
0.0750
0.0725
2 4 5
7 8
0.0700
0.0675
0.0650
AU
0.0600 0.0575 0.0550 0.0525 0.0500 0.0475 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 Minutes 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5
0.0600
1 3
0.0575
0.0550
0.0525
0.0500
0.0475
11.0
Figura 22. Electroferograma de la mezcla de 8 estndares.
Se observ que a pesar de que slo se inyectaba una mezcla de 8 estndares, en el electroferograma se detectaban nueve seales (picos), lo cual haca dudar de la pureza de algn estndar y por consiguiente la posibilidad de tener seales ocasionadas por dichas impurezas, para corroborar dicha hiptesis se realiz el anlisis de cada estndar por separado, y efectivamente se observ que el cido tnico era el compuesto del cual se obtena ms de una seal y en muchas ocasiones no era reproducible ninguna de esas seales. Se realiz una bsqueda bibliogrfica de este compuesto en artculos que hablaban del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que este compuesto fuera utilizado como estndar, esto es probablemente por la estructura qumica del cido tnico, la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos unidos a anillos aromticos (polifenlicos) estos grupos se encuentran condensados
AU
0.0625
0.0625
49
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un polmero lo cual no lo hace apto para utilizarlo como estndar en el presente trabajo. Por la razn antes mencionada se decide excluir de la lista de estndares el cido tnico ya que no es considerado estrictamente un polifenol. Una vez determinados los estndares que se podan utilizar se procedi a realizar diferentes anlisis para verificar la reproducibilidad del mtodo. Se cambi el capilar y se procedi a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado de mtodos. Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedi a realizar el ensayo de los estndares bajo diferentes condiciones.
Las primeras condiciones de anlisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9. Cuadro 9. Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico. Presin de inyeccin Tiempo de inyeccin Voltaje de anlisis Temperatura de anlisis 0.5 psi. 5 segundos 20 kV 25C
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el comportamiento de las seales, bajo las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo problemas entre los cuales destacaron: La cada de corriente, traslape de seales, baja reproducibilidad, grandes tiempos de anlisis (30 min
aproximadamente). Por lo cual se consider volver a modificar las condiciones de anlisis. Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10.
50
Cuadro 10. Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico. Presin de inyeccin Tiempo de inyeccin Voltaje de anlisis Temperatura de anlisis 1 psi. 8 segundos 24 kV 25C
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la mayora de los anlisis la corriente se caa, esto era probablemente ocasionado por que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la corriente estable y constante. Sin embargo, con estas condiciones de anlisis se logr una mejora en el tiempo de anlisis reducindolo de 30 min a 20 min. Esto fue provocado por el aumento de voltaje, no obstante estas condiciones no eran las ptimas para realizar anlisis reproducibles. Las siguientes condiciones que se utilizaron se muestran en el Cuadro 11.
Cuadro 11. Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico. Presin de inyeccin Tiempo de inyeccin Voltaje de anlisis Temperatura de anlisis 0.7 psi. 5 segundos 24 kV 25C
Las condiciones resultaron no ser las ptimas para trabajar ocasionando que la corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse, por tal motivo se decidi cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O7.10H2O de concentracin 50 mM al 7.5 % de metanol y ajustando el pH a 9.4. Al cambiar el amortiguador, las condiciones de anlisis tambin debieron cambiar a las que se muestran en el Cuadro 12.
51
Cuadro 12. Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico. Presin de inyeccin Tiempo de inyeccin Voltaje de anlisis Temperatura de anlisis 0.5 psi. 5 segundos 28.8 kV 25C
Con estas condiciones se realiz el anlisis de 7 estndares, pero solo se observaron 5 seales de polifenoles, por lo cual se decidi disminuir el voltaje a 24 kV para verificar si era debido a un traslape de seales que no aparecan todas, sin embargo, tampoco se observ diferencia en el electroferograma. Para verificar si los estndares no se haban degradado se analizaron por pares para verificar que todos dieran seal. Se observ poca resolucin en los anlisis lo cual indic que el problema no eran los estndares sino la concentracin del regulador de pH, y se opt por disminuir la concentracin del regulador a 30 mM con pH 9.4 y 7.5% de metanol .
Posteriormente se procedi a realizar una mezcla de los 8 estndares siguientes: cido benzoico cido cafeico cido glico cido cumrico cido cinmico cido clorognico cido vainillinico vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 28.8 kV con inyeccin de 0.5 psi por 5 segundos (Figura 23), observndose una buena reproducibilidad del mtodo.
52
0.20
UV - 200nm MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PM.dat
UV - 200nm mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pm.dat
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
6 1
1.-Vainillina 2.-cido clorognico 3.-cido ferlico 4.-cido p-cumrico 5.-cido vainillinico 6.-cido benzoico 7.-cido cafeico 8.-cido glico
0.18
0.16
0.14
0.12
AU
0.10
0.10
0.08
0.08
0.06
0.06
2
0.04
7
4
8
0.04
0.02
0.02
0.00 5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5 Minutes
8.0
8.5
9.0
9.5
0.00 10.0
Figura 23. Electroferograma de la mezcla de 8 estandares.
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anlisis de pares de estos, obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura 24).
UV - 200nm CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PM.dat 0.275 UV - 200nm cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pm.dat 0.275
0.275 UV - 200nm CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PM.dat
cido cinmico-cido clorognico.
cido cafico-cido glico.
0.275
0.250
0.250
0.250
0.250
0.225
0.225
0.225
0.225
0.200
0.200
0.200
0.200
0.175
0.175
0.175
0.175
AU
AU AU
0.150
0.150
0.150
0.150
0.125
0.125
0.125
0.125
0.100
0.100
0.100
0.100
0.075
0.075
0.075
0.075
0.050
0.050
0.050
0.050
0.025
0.025
0.025
0.025
0.000 1 2 3 4 5 6 Minutes 7 8 9 10 11
0.000
0.000 1 2 3 4 5 6 Minutes 7 8 9 10 11
0.000
53
AU
AU
0.50
UV - 200nm CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PM.dat
UV - 200nm cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pm.dat
0.50
UV - 200nm CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PM.dat 0.275
UV - 200nm 6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pm.dat 0.275
0.45
cido cumrico-cido benzoico.
0.45
mezcla de seis estndares.
0.250
0.40 0.40
0.250
0.225
0.35 0.35
0.225
0.200
0.200
0.30
0.30
0.175
0.175
AU
AU AU
0.25
0.25
0.150
0.150
0.125
0.20 0.20
0.125
0.100
0.15 0.15
0.100
0.075
0.10 0.10
0.075
0.050
0.050
0.05
0.05
0.025
0.025
0.00 1 2 3 4 5 6 Minutes 7 8 9 10 11
0.00
0.000 1 2 3 4 5 6 Minutes 7 8 9 10 11
0.000
Figura 24.-Electroferogramas de cada par de estandares. Al final se comparararon todas las seales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25).
0.250
UV - 200nm 8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PM.dat
UV - 200nm 6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pm.dat
0.250
0.225
0.200
0.175
0.150
1.-Vainillina 2.-cido clorognico 3.-cido ferlico 4.-cido p-cumrico 5.-cido vainillinico 6.-cido benzoico 7.-cido cafeico 8.-cido glico
0.225
0.200
0.175
0.150
AU
AU
0.125
0.125
0.100
0.100
0.075
0.075
0.050
1 2
4 3
0.050
0.025
0.025
0.000 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 Minutes 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5
0.000
Figura 25. Electroferograma de comparacin de 8 estndares. Posteriormente una vez que ya se haba obtenido el mtodo adecuado para hacer el anlisis de fenoles mediante electroforesis capilar, se procedi a analizar una muestra comercial de aceite de cha para observar el perfil polifenlico que este mostraba (Figura 26).
54
AU
Figura 26. Electroferograma de extracto de aceite de comercial de cha.
55
Las condiciones utilizadas para este anlisis se muestran en el Cuadro 13. Cuadro 13. Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico. Presin de inyeccin 0.5 psi. Tiempo de inyeccin Voltaje de anlisis Temperatura anlisis Amortiguador de 5 segundos 24 kV 25C 30 mM de Na2B4O7.10H2O con 7.5% de metanol ajustado a pH 9.4
Se puede observar que en cada anlisis que se le realiz al extracto, los resultados no fueron reproducibles, en el primer anlisis se observa un par de saales a los 4 min aproximadamente y una seal ms alrededor de los 18 min, pero en el segundo anlisis la seal de los 18 min se recorri hasta los 27 min aproximadamente.
Posteriormente en el tercer y cuarto anlisis ya no aparece esa seal, al comparar los 4 anlisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos. Analizando los resultados obtenidos se observ que bajo las condiciones antes mencionadas no era reproducible el mtodo por lo cual no se lograba identificar los compuestos, no obstante se observan seales de compuestos fenlicos lo cual indica que el aceite de cha s contena compuestos fenlicos, sin embargo, se necesitaba establecer las condiciones para que el mtodo fuera reproducible y pudieran obtenerse conclusiones, por lo cual se volvi a trabajar con los estndares bajo ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el mtodo.
En esta ocasin se modific el dimetro interno del capilar de 75 a 50 m y la concentracin del regulador a 45 mM a pH 9.3 sin metanol, otro factor que se tom en cuenta fue la temperatura de anlisis la cual siempre haba sido a 25C y en esta ocasin se redujo a 22C, el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccin de muestra fue de 0.5 psi durante 8 segundos, la longitud efectiva del capilar fue de 45 cm, mientras que la longitud total fue de 55.3 cm.
56
Se realizaron ensayos por pares de estndares para observar si no exista un traslape entre alguno de ellos, la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el momento, aunque s exista un traslape de dos seales. Se determin que el estndar que se traslapaba era el cido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla ya que inicialmente se decidi incluirlo en la muestra como estndar interno pero este se remplaz por vainillina, por tal razn se decidi quitarlo de la mezcla para evitar que las seales se traslaparan.
Al final se analizaron los 8 estndares solubles en agua; cido cinmico, cido transcinmico, cido cafeico, cido glico, cido vainillinico, cido clorognico, cido cumrico y vainillina como estndar interno. Las condiciones ptimas que se encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro 14.
Cuadro 14. Condiciones ptimas encontradas electroforesis capilar. Tiempo de inyeccin 5 seg Temperatura Presin de inyeccin Voltaje Tiempo de anlisis 0.5 psi 30 kV
experimentalmente 22C 40 cm 50 cm
en
Longitud efectiva del capilar Longitud total del capilar
30 min. Regulador de Na2B4O7
45 mM pH 8.8
Una vez establecidas las condiciones se procedi a realizar el ensayo de la mezcla de los 8 estndares para obtener sus tiempos de migracin y evaluar la repetibilidad del mtodo para lo cual se calcul el coeficiente de variacin (C.V) segn la siguiente frmula:
C. V=
X 100
57
En el Cuadro 15, se observan los tiempos de migracin que se obtuvieron de cada uno de los 8 estndares (picos) y su desviacin estndar durante los cuatro ensayos que se realizaron. El coeficiente de variacin no deba ser mayor al 3% que es lo deseable en cualquier mtodo analtico. Cuadro 15. Tiempos de migracin de cada estndar.
Tiempos de migracin (min)
t1 corrida 1 corrida 2 corrida 3 corrida 4 MEDIA STD C.V (%) 5.34 5.41 5.43 5.58 5.44 0.0875 1.61
t2 5.53 5.6 5.63 5.79 5.64 0.0952 1.69
t3 5.74 5.82 5.85 6.01 5.86 0.0981 1.68
t4 5.84 5.94 5.96 6.11 5.96 0.0965 1.62
t5 6.38 6.51 6.53 6.7 6.53 0.1138 1.74
t6 6.63 6.77 6.8 6.98 6.80 0.1246 1.83
t7 9.92 9.99 10.23 10.67 10.20 0.2934 2.88
t8 10.83 11.03 11.18 11.69 11.18 0.3182 2.85
C.V: coeficiente de variacin, t: tiempo de migracin, STD: desviacin estndar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron tiles en la separacin de los 8 estndares de polifenoles mencionados anteriormente, sin embargo se lograron adquirir 3 estndares nuevos de polifenoles los cuales fueron: miricetina, quercetina y kaempferol. Debido a este cambio, fue necesario hacer un anlisis de cada uno de los 11 estndares. Cada uno de los 11 estndares fue analizado individualmente y se hizo un barrido de cada estndar con un detector de arreglo de diodos (DAD), para obtener su espectro de absorcin (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacin de los compuestos fenlicos.
58
40
5.66 Min 10STDnuevos
40
40
40
35
35
35
35
30
30
30
30
25
25
25
25
20
mAU
20
mAU
mAU
20
20
mAU
15
15
15
15
10
10
10
AC TRANS-CINMICO
10
VAINILLINA
200 220 240 260 280 300 320 nm 340 360 380 400 420 440
-5
-5
-5 200 220 240 260 280 300 320 nm 340 360 380 400 420 440
-5
6.60 Min AC CLOROGENICO500ppm
180
80
8.83 Min AC p-CUMARICO500ppm
180
80 70 60 50
mAU
160
70
160
140
60
AC P-CUMRICO
140
120
50
120
100
mAU mAU
100
mAU
40 30 20 10 0
40
80
30
80
60
20
60
40
10
40
AC CLOROGNICO
200 220 240 260 280 300 320 nm 340 360 380 400 420 440
20
20
0 200 220 240 260 280 300 320 nm 340 360 380 400 420 440
40
40
180
7.62 Min AC FERULICO500ppm
180
35
35
160
160
30
30
140
140
25
25
120
120
20
mAU
20
mAU mAU
100
100
mAU
15
15
80
80
10
10
60
60
40
40
AC VAINILLNICO
200 220 240 260 280 300 320 nm 340 360 380 400 420 440
20
AC FERLICO
200 220 240 260 280 300 320 nm 340 360 380 400 420 440
20
-5
-5
59
100 90 80 70 60
mAU
11.25 Min AC CAFEICO500ppm
100
50
90
13.36 Min AC GALICO500ppm
50
45 40 35 30
mAU
mAU
45
80
40
70
35
60
30
50 40 30 20 10 0 200 220 240 260 280 300 320 nm 340 360 380 400 420 440
50
25 20 15 10 5 0 200 220 240 260 280 300 320 nm 340 360 380 400 420 440
25
40
20
30
AC GLICO
15
20
10
AC CAFICO
10
9.11 Min QUERCETINA500ppm
130
50
7.88 Min KAEMPFEROL500ppm
130
50
120 45
45
120
110 100 90
110
40
100
40
90
mAU
mAU mAU
35
35
80 70 60 50
80
30
30
KAEMPFEROL
70 60
25
25
50
20
20
40 15 200
40
QUERCETINA
220 240 260 280 300 320 nm 340 360 380 400 420 440
15
30 200 220 240 260 280 300 320 nm 340 360 380 400 420 440
30
120
8.68 Min MIRICETINA500ppm

120
100
100
80
80
mAU
60
40
40
20
20
MIRICETINA
200 220 240 260 280 300 320 nm 340 360 380 400 420 440
Figura 27.-Espectros de absorcin de cada estndar estudiado.
mAU
60
60
mAU
mAU
Las condiciones ptimas de separacin de los estndares fueron determinadas despus de hacer distintas pruebas en la concentracin del regulador a 50, 52.5, 55, 60 y 70 mM de Na2B4O7.10H2O, con pH fijo de 9.4, e inyeccin de 0.5 psi durante 5 segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22C los electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28.
0.12
PDA - 200nm 10STD50mM PDA - 200nm 10std52.5mm PDA - 200nm 10std55mm PDA - 200nm 10std60mm PDA - 200nm 10std70mm
0.12
0.10
70 mM
0.10
0.08
60 mM
0.08
AU
0.06
55 mM
0.04
0.04
0.02
52.5 mM
0.02
0.00 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Minutes 15 16 17 18
50 mM
0.00
19
20
21
Figura 28. Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador. Como se puede observar en la Figura 28 slo los electroferogramas con concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las seales de los 11 componentes de la mezcla, mientras que a ms altas concentraciones del regulador solo pueden verse 10 seales, lo que indica que dos seales de los estndares se encuentran traslapadas.
61
AU
0.06
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y Perlin, 1963), por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracin de los boratos Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos, especialmente a los que se encuentran entre los 9 y 10 min.
La concentracin adecuada del regulador result ser 50 mM debido a que se obtuvo una buena separacin de los 11 estndares, y mostr una buena reproducibilidad a diferencia de las dems concentraciones en las que existan seales que se traslapaban, lo cual era indeseable. Las condiciones ptimas de anlisis se muestran en el Cuadro 16. Cuadro 16. Condiciones ptimas de anlisis halladas experimentalmente. Tiempo de inyeccin Presin de inyeccin Voltaje Tiempo de anlisis 5 seg 0.5 psi 28 kV Temperatura Longitud efectiva del capilar Longitud total del capilar 22C 41.7 cm 51.9 cm 50 mM pH 9.4
Una vez establecidas las condiciones ptimas de anlisis se procedi a realizar una mezcla de todos los estndares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron 0.5 mL de cada estndar y se mezcl en un sonicador para mejorar la disolucin de la mezcla. La mezcla se realiz con soluciones de 1000 mg/L de cada estndar disuelto en etanol al 80%, a excepcin de miricetina, quercetina y kaempferol los cuales se disolvieron en dimetilsulfxido (DMSO) al 10% en etanol. Los anlisis fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16.
62
El electroferograma de la mezcla de los 11 estndares se muestra en la Figura 29.
0.055
0.055
0.050
5
0.045
2
0.040
0.035
AU
6 8 7 9
1.-Vainillina 2.-cido trans-cinmico 3.-cido clorognico 4.-cido ferlico 5.-Kaempferol 6.-Miricetina 7.-cido p-cumrico 8.-cido vainillinico 9.-Quercetina 10.-cido cafeico 11.-cido glico
0.050
0.045
0.040
0.035
0.030
1
0.025
10
11
0.030
0.025
0.020
0.020
0.015 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14
0.015
15
Figura 29. Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracin de los 11 estndares. Cada uno de los 11 estndares fue identificado mediante su espectro de absorcin (previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo diodos) y comparndolos en la mezcla analizada gracias a una funcin con la que cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la seal (pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo, nos muestra el espectro de absorcin (Figura 30), de esa especie que previamente se analiz individualmente y de esta forma se identifica el compuesto adems junto con la informacin del tiempo de migracin de cada uno de los estndares que se muestran en el Cuadro 17.
63
AU
Figura 30. Espectros de absorcin obtenidos mediante detector de arreglo de diodos.
Cuadro 17. Tiempos de migracin de cada estndar. Estndar Vainillina Ac trans-cinmico cido clorognico cido ferlico Kaempferol Miricetina Tiempo de migracin 5.99 min 6.32 min 6.60 min 7.57 min 7.87 min 8.68 min Estndar Ac p-cumrico Ac vainillinico Quercetina cido cafeico cido glico Tiempo de migracin 8.83 min 9.03 min 9.11 min 11.30 min 13.37 min
64
4.4.2 ANLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHA Una vez establecida la base de datos de polifenoles, y las condiciones ptimas se procedi a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla de cha para identificar los posibles compuestos fenlicos. En primer lugar se analiz el aceite comercial de cha, el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por prensado en fro, el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31. Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacin fueron obtenidos bajo las condiciones ptimas mencionadas en el cuadro 16.
0.056
0.056
0.054
0.054
0.052
0.052
0.050 0.048
0.050
AU
0.046
0.046
0.044
0.044
0.042
0.042
0.040
0.040
0.038 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17 18
0.038
Figura 31. Electroferograma del aceite comercial de cha.
Las seales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ningn tiempo de migracin de alguno de los 11 estndares utilizados. La muestra de aceite 094 mostr seales de posibles compuestos fenlicos (Figura 32) debido a su tiempo parecido de migracin, en especfico cido clorognico y cido glico, por lo cual se decidi aadir una alcuota de 5 L de solucin de cada estndar de 1000 ppm, para poder confirmar o descartar la presencia de estos
AU
0.048
65
compuestos fenlicos (un aumento de la intensidad de esa seal indicara la presencia de dicho compuesto) (Figura 33).
0.06
0.06
0.05
0.05
0.04
0.04
AU
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Minutes 10 11 12 13 14 15 16 17
0.00
18
Figura 32. Electroferograma del aceite 094.
PDA - 200nm
0.055 0.050 0.045
0.055
0.050
0.045
cido clorognico
0.040 0.035
AU
cido glico
0.040
0.035
0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 4
Compuesto no identificado
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
10 11 Minutes
12
13
14
15
16
17
18
Figura 33. Electroferograma del aceite 094 aadiendo estndares. Sin embargo, como puede observarse, los estndares aadidos no corresponden con el tiempo de migracin de la seales de la muestra de aceite, lo cual indica que dicha muestra de aceite no contiene ningn compuesto fenlico de los utilizados en este trabajo.
AU
AU
66
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospech que poda contener kaempferol debido a la seal que se obtuvo alrededor de los 9 min, por lo cual se aadi una alcuota de la solucin de estndar de kaempferol para confirmar o descartar su presencia (Figura 35).
0.06
0.06
0.05
0.05
0.04
0.04
AU
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Minutes 10 11 12 13 14 15 16 17
0.00
18
PDA - 200nm
0.11 0.10 0.09 0.08 0.07

AU
0.11
Kaempferol
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 4 5 6 7 8 9 10 11 Minutes 12 13 14 15 16 17
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
18
Figura 35. Electroferograma del aceite 125 ms estndares aadidos. Al aadirle la alcuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho compuesto en la muestra debido a que no coincidi con el tiempo de migracin de la muestra.
AU
AU
67
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125, mostraron una seal alrededor de los 9 min, indicando posiblemente la presencia de kaempferol, por lo cual se procedi de igual forma a aadir una alcuota de dicho compuesto (Figura 37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad.
0.055 0.050 0.045 0.040 0.035
AU
0.055
0.050
0.045
0.040
0.035
0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Minutes 10 11 12 13 14 15 16 17
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
18
Figura 36. Electroferograma del aceite 287
PDA - 200nm
0.11 0.10 0.09 0.08 0.07

AU
0.11
0.10
Kaempferol
0.09
0.08
0.07
0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 4 5 6 7 8 9 10 11 Minutes 12 13 14 15 16 17
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
18
Figura 37. Electroferograma del aceite 287 ms estndares aadidos. Al igual que la muestra 125 de aceite, se descart la presencia de kaempferol en esta muestra debido a que no coincidi el tiempo de migracin con el de la muestra de aceite.
AU
AU
68
De igual forma se analiz la muestra de aceite 301, (Figura 38) sin embargo a pesar de que efectivamente se observaron seales, todas estas no coincidieron con ningn tiempo de migracin de alguno de los 11 estndares utilizados en el presente trabajo.
0.055 0.050 0.045 0.040 0.035
AU
0.055
0.050
0.045
0.040
0.035
0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Minutes 10 11 12 13 14 15 16 17
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
18
5.4.3 ANLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de cha desengrasada en el equipo de electroforesis capilar, en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron detectados probablemente 6 compuestos fenlicos, los cuales podan ser; cido trans-cinmico, cido clorognico, cido ferlico, kaempferol, cido glico y cido cafeico. El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostr seales de posibles compuestos fenlicos que debido a su tiempo de migracin podan ser; cido trans-cinmico, cido clorognico, kaempferol, cido cafeico y cido glico. En el extracto de la semilla 287 (Figura 41), se detectaron compuestos que posiblemente podan ser; cido trans-cinmico y cido clorognico.
AU
69
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las seales de posibles compuestos fenlicos como el cido trans-cinmico, cido clorognico, cido ferlico, kaempferol, cido cafeico y cido glico.
0.12
0.12
0.10
0.10
0.08
0.08
AU
0.06
0.06
0.04
0.04
0.02
0.02
0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17
0.00
18
Figura 39. Electroferograma de la semilla 094
0.20
0.20
0.18
0.18
0.16
0.16
0.14
0.14
0.12
AU
0.12
0.10
0.10
0.08
0.08
0.06
0.06
0.04
0.04
0.02
0.02
0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17
0.00
18
Figura 40. Electroferograma de la semilla 125
AU
AU
70
0.10 0.09 0.08 0.07 0.06

AU
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 -0.01 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
-0.01
18
Figura 41. Electroferograma de la semilla 287.
0.11 0.10 0.09 0.08 0.07 0.06

AU
0.11
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
18
Figura 42. Electroferograma de la semilla 301.
AU
AU
0.05
0.05
71
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenlicos en los extractos de semilla, se decidi aadir una alcuota de 5 L de cada estndar del cual se sospechaba su presencia en la muestra, esto se decidi realizar debido a que los tiempos de migracin de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacin con la mezcla de estndares, esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser inyectada en el equipo de electroforesis capilar. Debido a este fenmeno las seales sufrieron un desplazamiento del orden de segundos, por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicin del estndar del cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la seal se confirmaba de ese modo la presencia de dicho compuesto.
Al extracto de la semilla 094 se le aadi cido trans-cinmico y cido cafeico. Al extracto de la semilla 125 se le aadi cido glico y cido clorognico. Al extracto de la semilla 287 se le aadi kaempferol. Al extracto de la semilla 301 se le aadi cido ferlico.
As de esta forma se logr confirmar o descartar los compuestos fenlicos que se sospechaba su presencia en cada tipo de semilla, debido a que los estndares al estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma.
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar cido trans-cinmico, cido clorognico y cido cafeico. Estos compuestos lograron identificarse mediante la superposicin de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de cha que previamente se le aadieron estndares.
72
0.20
PDA - 200nm
PDA - 200nm
0.20
cido clorognico
0.18
cido cafeico
0.18
Ac trans-cinmico
0.16
0.16
0.14
0.14
0.12
AU
1 2 3 4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17
0.12
0.10
0.10
0.08
0.08
0.06
0.06
0.04
0.04
0.02
0.02
0.00
0.00
18
1.-extracto sin estndares aadidos. 2.-extracto con cido cafeico y cido transcinmico aadidos. 3.-extracto con cido clorognico aadido. Figura 43. Electroferograma de semilla 094 con estndares aadidos.
AU
73
9 Minutes
10
11
PDA - 200nm
PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar cido trans-cinmico y cido clorognico de la misma forma anteriormente mencionada.
0.18
PDA - 200nm PDA - 200nm
0.18
0.18
0.16
Ac trans-cinmico
0.16
0.14
0.16
cido clorognico
0.14
AU
1
0.10 0.08
0.14
2
3
0.10
0.08
0.06
0.06
0.04
0.04
AU
0.12
10
11
12 Minutes
13
14
15
16
17
18
0.10
0.08
0.06
0.04
1.-extracto sin estndares aadidos. 2.-extracto con cido clorognico aadido. 3.extracto con cido trans-cinmico aadido. 6 7 125 con estndares 8 aadidos. 9 Figura 44. Electroferograma de semilla
AU
0.12
0.12
10
74
En la semilla 287 (Figura 45) se detect cido trans-cinmico y cido clorognico.

0.10
0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 -0.01 3 4 5 6 7 8 Minutes 9 10 11 12
0.09
cido clorognico
0.08
Ac trans-cinmico
0.07
0.06
AU
0.04
0.03
2
3
0.02
0.01
0.00
-0.01
1.-extracto sin estndares aadidos. 2.-extracto con cido trans-cinmico aadido. 3.-extracto con cido clorognico aadido. Figura 45. Electroferograma de semilla 287 con estndares aadidos.
AU
0.05
75
En la semilla de cha 301 se identific cido trans-cinmico y cido glico (Figura 46).
0.14
Acido glico
Ac trans-cinmico
0.14
0.12
0.12
0.10
0.10
0.08
AU
0.08
0.06
0.06
0.04
200n m
0.04
A -
0.02
3
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14 15 16 17
0.02
0.00
0.00
18
AU
1.-extracto sin estndares aadidos. 2.-extracto con cido glico aadido. 3.-extracto con cido trans-cinmico aadido. Figura 46. Electroferograma de semilla 301 con estndares aadidos.
9 Min
76
El nico compuesto fenlico que fue identificado en comn en las 4 muestras de semilla de cha fue el cido trans-cinmico, y cada tipo de semilla contiene distintos compuestos fenlicos, lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el contenido de compuestos fenlicos, mostrando as que cada variedad de semilla tiene un perfil diferente de compuestos fenlicos.
Al realizar la comparacin con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984, slo se encuentra coincidencia en la presencia de cido clorognico compuesto que est presente en las muestras 094, 125 y 287 provenientes del estado de Puebla, y cido cafeico que est presente en una sola muestra (094), sin embargo, es de llamar la atencin que los flavonoles miricetina, quercetina y kaempferol, no fueron detectados en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio anteriormente mencionado s se reporta la presencia de dichos polifenoles.
Sin embargo, es destacable que en el estudio de comparacin no indican la procedencia o variedad de semilla de cha que se estudi, lo cual es muy comn en trabajos que se realizan con materiales vegetales, en los cuales no se especifica el tipo o procedencia de dicha muestra, lo cual complica una caracterizacin de acuerdo al tipo o variedad de semilla. En el presente trabajo se estudiaron 3 variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirm que cada variedad de semilla de cha contiene distintos compuestos fenlicos.
Independientemente de los compuestos fenlicos que se identificaron en los distintos extractos, s existen distintas seales con diferentes tiempos de migracin que no coinciden con alguno de los 11 estndares utilizados en este trabajo, sin embargo es evidente que estas seales son de compuestos fenlicos de diferente naturaleza a los que se adquirieron en esta investigacin.
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales, la capacidad antioxidante y los compuestos fenlicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de cha.
77
Cuadro 18. Contenido de fenoles totales, capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar. MUESTRA FENOLES CAPACIDAD COMPUESTO TOTALES (mg ac ANTIOXIDANTE IDENTIFICADO glico/100g (M Trolox/g muestra) muestra) Semilla 1.-cido clorognico. 094 1104.716.05 283.2835.31 2.-cido trans-cinmico. 3.-cido cafeico. Semilla 1.-cido clorognico. 125 854.295.82 493.6751.12 2.-cido glico. 3.-cido trans-cinmico. Semilla 1.-cido trans-cinmico. 287 1052.613.36 227.8120.37 2.-cido clorognico. Semilla 301 Aceite comercial de cha Aceite 094 1.-cido glico. 2.-cido trans-cinmico.
1091.3413.33
361.5419.57
5.920.42 11.490.53
10.700.52 9.670.79
N.D. N.D.
Aceite 125
2.470.13
7.390.39
N.D.
Aceite 287
3.800.23
6.590.20
N.D.
Aceite 301
5.210.23
22.910.91
N.D.
N.D.= No detectado.
Como puede observarse en el Cuadro 6, son interesantes los valores que se presentan en los extractos de aceite de cha, debido a que al analizar los extractos, estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante, no obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron compuestos fenlicos.
78
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se haban degradado al momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese momento, dichos extractos tenan 120 das de almacenamiento bajo atmsfera de nitrgeno y en frascos mbar a 0C, por lo cual se decidi realizar pruebas con extractos de aceite fresco (1 da de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 das. Los electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19. Cuadro 19. Condiciones utilizadas en el anlisis de extractos frescos de semilla y aceite de cha. Tiempo de inyeccin 5 seg Temperatura 22C Presin de inyeccin Voltaje Tiempo de anlisis 0.5 psi 28 kV Longitud efectiva del capilar Longitud total del capilar 41.7 cm 51.9 cm 50 mM pH 9.4
En la Figura 47 se muestran las seales del aceite 094 fresco, en el cual se observan distintas seales, y se sobrepuso la mezcla de los 11 estndares de polifenoles y logrando identificar el cido trans-cinmico.
PDA - 200nm ACEITE0941 PDA - 200nm 10std50mm
0.05
0.05
Ac trans-cinmico
0.04
0.04
AU
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
10 Minutes
11
12
13
14
15
Figura 47. Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094.
AU
79
En la Figura 48 se muestran las seales del aceite 125 fresco, en el cual se observan distintas seales, y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estndares de polifenoles, logrando identificar el cido trans-cinmico y el cido cafeico, y tambin una seal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los estndares.
0.06
PDA - 200nm
0.06
0.05
0.05
Ac trans-cinmico
0.04
cido cafeico
0.04
AU
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0.00 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14
0.00
15
En la Figura 49, se muestran las seales del aceite 287 fresco, en el cual se observan distintas seales, y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estndares de polifenoles, logrando identificar el cido trans-cinmico, cido clorognico y cido glico, sin embargo, esta muestra de aceite contuvo ms seales en comparacin con las otras dos muestras de aceite previamente analizados.
80
AU
PDA - 200nm
0.055 0.050 0.045
0.055
Ac trans-cinmico
0.050
0.045
Ac clorognico
0.040 0.035 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14
Acido glico
0.040
AU
0.035
AU
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
15
La ltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logr identificar cido trans-cinmico, cido clorognico, cido p-cumrico y quercetina, y de igual forma se obtienen seales de diferentes compuestos que no coinciden con el tiempo de migracin de los 11 estndares utilizados en este trabajo. Esta muestra de aceite es la que contiene mayor nmero de compuestos fenlicos y con mayor concentracin
81
PDA - 200nm
0.055 0.050 0.045 0.040 0.035

Quercetina Ac transcinmico
0.055
0.050
AAc clorognico
Ac p-cumrico
0.045
0.040
AU
0.035
AU
0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
15
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones, se observ que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenlicos (Figura 51) y tambin varan en la concentracin de dichos compuestos, siendo el aceite 301 el que ms compuestos fenlicos contuvo.
82
0.06
0.06
PDA - 200nm ACEITE0941
PDA - 200nm aceite125 3 seg1
PDA - 200nm aceite287 3 seg1
PDA - 200nm aceite fresco espectros
0.05
0.05
0.04
Aceite 301
AU
0.04
0.03
Aceite 287
0.03
0.02
0.02
Aceite 125
0.01
Aceite 094
0.01
0.00 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14
0.00
15
Figura 51. Electroferograma de las 4 muestras de aceite de cha.
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos fenlicos, dichos extractos tenan 120 das de almacenamiento, por lo cual se decidi volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccin
desengrasada pero frescos ( de 1 da de almacenamiento), para poder comparar los resultados obtenidos con los extractos que tenan 120 das de almacenamiento y al mismo tiempo tener un estudio completo, tanto del aceite como de la fraccin desengrasada de la semilla de cha.
83
AU
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es determinante en el contenido de compuestos fenlicos, al analizar el extracto fresco de la semilla 094 se logr identificar; cido clorognico, cido trans-cinmico, cido cafeico (Figura 52).
0.06
0.06
1. cido clorognico 2. cido trans-cinmico 3. cido cafeico

0.05
0.05
0.04
0.04
AU
0.03
0.02
0.02
1
0.01
0.01
0.00 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14
0.00
15
Figura 52. Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco.
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos fenlicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada, aunque la identificacin en este caso fue ms sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 das, debido a que las seales se encontraron mejor definidas y esto facilit la comparacin con la base de datos de polifenoles.
84
AU
0.03
En la semilla 125 se logr identificar; cido trans-cinmico, cido clorognico, cido ferlico, kaempferol, miricetina, quercetina, y cido glico (Figura 53).
0.06
0.05
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
cido trans-cinmico cido clorognico cido ferlico Kaempferol Miricetina Quercetina cido glico
0.06
0.05
0.04
0.04
1
AU
0.03
0.03
0.02
0.02
6
0.01
3 2 4
7
0.01
0.00 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14
0.00
15
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con extractos frescos y almacenados 120 das, esta misma muestra cuando se analiz con 120 das de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (cido trans-cinmico, cido clorognico y cido glico), mientras que en el extracto fresco se identificaron 7 compuestos fenlicos de la base de datos que tenemos de comparacin.
85
AU
En el extracto de la semilla 287 se identificaron; cido trans-cinmico, cido clorognico, cido ferlico, kaempferol, miricetina, quercetina, cido glico (Figura 54).
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. cido trans-cinmico cido clorognico cido ferlico Kaempferol Miricetina Quercetina cido glico
0.06
0.06
1
0.05
0.05
0.04
AU
0.04
0.03
0.03
0.02
7 5 4
0.02
0.01
6
0.01
0.00 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14
0.00
15
Al igual que en la muestra 125, en la muestra 287 se detectaron los mismos compuestos fenlicos, lo cual es contrastante al compararse con el anlisis del extracto con 120 das de almacenamiento, en el cual solo se logr identificar 2 compuestos fenlicos (cido trans-cinmico y cido clorognico).
86
AU
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron; cido trans-cinmico, cido clorognico, cido ferlico, kaempferol, miricetina, cido vainillinico, cido glico y cido cafeico (Figura 55).
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. cido trans-cinmico cido clorognico cido ferlico Kaempferol Miricetina cido vainillinico Quercetina cido glico cido cafeico
quercetina,
0.06
0.06
0.05
0.05
0.04
0.04
AU
0.03
0.03
8
0.02
7 3 1 5 4 9
0.02
0.01
0.01
0.00 5 6 7 8 9 10 Minutes 11 12 13 14
0.00
15
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nmero de compuestos fenlicos (9), adems de ser la que mostr mayor nmero de seales y de mayor absorbancia, lo cual nos indica que estn presentes en mayor cantidad.
En el Cuadro 20 se hace la comparacin de los compuestos fenlicos detectados en los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 das despus de almacenados los extractos, como puede observarse, la diferencia es relevante entre el tiempo de un anlisis y otro por lo cual es recomendable que para cualquier anlisis de compuestos fenlicos se realice lo ms pronto posible una vez que se hayan extrado los compuestos fenlicos de la matriz del alimento o muestra,
87
AU
esto es debido a que dichos compuestos fenlicos al actuar como antioxidantes se oxidan despus de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz, calor, y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacin. Cuadro 20. Comparacin de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 das.
Ac. c trans-cinamico
Ac. ac clorognico
Ac Ac. p-cumrico
Ac. Ac vainillinico
vainillina (E.I)
Kaempferol
Ac. ac ferlico
Quercetina
Miricetina
Ac. ac cafeco
aceite 094 almacenado aceite 094 fresco aceite 125 almacenado aceite 125 fresco aceite 287 almacenado aceite 287 fresco aceite 301 almacenado aceite 301 fresco semilla 094 almacenada semilla 094 fresca semilla 125 almacenada semilla 125 fresca semilla 287 almacenada semilla 287 fresca semilla 301 almacenada semilla 301 fresca
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
X X X X X X
88
ac glico Ac.
ue M ra st
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales, actividad antioxidante y los compuestos fenlicos identificados mediante electroforesis capilar, podr notarse que la fraccin desgrasada de semilla de cha muestra valores muy superiores de capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extrado de la misma, esto se relaciona con la cantidad de compuestos fenlicos identificados en la fraccin desgrasada, en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos, mientras que en la fraccin desgrasada se logr identificar hasta 9 compuestos fenlicos en el caso de la semilla 301. Cuadro 21. Contenido de compuestos fenlicos en extractos de aceite y semilla frescos.
c trans-cinmico c clorognico
Fenoles totales
c p-cumrico
c vainillinico
kaempferol
Quercetina
c ferlico
c cafeico
Miricetina
Aceite 094 fresco Aceite 125 fresco Aceite 287 fresco Aceite 301 fresco Semilla 094 fresca Semilla 125 fresco Semilla 287 fresca Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
c glico
(mg ac glico/100g muestra)
Capacidad antioxidante
(M Trolox/g muestra)
11.490.53 2.470.13 3.800.23 5.210.23 1104.716.0 854.295.82 1052.613.3 1091.3413.3
9.670.79 7.390.39 6.590.20 22.910.91 283.2835.31 493.6751.12 227.8120.37 361.5419.57
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla de cha existieron seales en la regin de los compuestos fenlicos que debido a la falta de estndares no pudieron ser identificados
89
Sin embargo, debe tomarse en cuenta que dichas seales nos indican la presencia de distintos compuestos fenlicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales. Puede observarse que el aceite 301, es el que contiene una mayor capacidad antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenlicos identificados con 4 compuestos, curiosamente no result ser el de mayor valor de fenoles totales, en lo que respecta a la semilla de cha sucedi algo similar; la semilla que contiene una mayor capacidad antioxidante fue la 125, sin embargo, el contenido de fenoles totales result ser el menor, un comportamiento similar al que se present en los extractos de aceite. La semilla con mayor contenido de compuestos fenlicos identificados mediante E.C fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se mencion anteriormente existieron compuestos fenlicos que no se identificaron por falta de estndares de polifenoles. En el aceite 301 fue en el que se logr identificar el mayor nmero de compuestos fenlicos con 4 siendo este aceite el que mostr la mejor capacidad antioxidante aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales, esto es ocasionado posiblemente por el efecto sinrgico que existe entre los compuestos fenlicos. Por el comportamiento anteriormente descrito sera interesante determinar la capacidad antioxidante de cada uno de los estndares a utilizar en futuros trabajos y en mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos fenlicos juega un papel fundamental en la determinacin de la capacidad antioxidante. Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de cha separados e identificados mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por taga et al en 1984, en el cual reporta; cido cafeico, cido clorognico, miricetina, quecetina y kaempferol, no obstante, no puede ser del todo comparable ya que en dicho trabajo no se menciona de que regin de Mxico provino dicha semilla, adems de que el mtodo de identificacin no es comparable al utilizado en el presente trabajo.
90
Es importante mencionar que tratndose de semillas la composicin qumica de sus metabolitos est determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos casos tambin por el genotipo de la misma, es por ello la importancia de saber de dnde proviene dicho alimento, de lo contrario resulta complicado la comparacin de resultados de diferentes trabajos, aunado a esto en lo que respecta a la identificacin de compuestos fenlicos presentes en la semilla de cha no existen artculos con los cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo, cabe mencionar que esta situacin fue una de las razones por las cuales se plante esta investigacin, adems de que en diferentes estudios realizados se han reportado las excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra, protenas, cidos grasos 3 y 6, y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar puede ser considerado el alimento funcional por excelencia.
91
5. CONCLUSIONES La electroforesis capilar result ser una tcnica eficiente, rpida y econmica de anlisis, y aplicable a cualquier tipo de muestra y en especfico a alimentos. El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de cha es determinante para un resultado confiable, ya que en el presente trabajo se observ que despus de 120 das de almacenamiento la totalidad de compuestos fenlicos se degradan, esto es posiblemente ocasionado por el alto contenido de cidos grasos poliinsaturados que contiene la cha y los cuales aceleran la oxidacin del misma. El estudio del contenido de fenoles totales, en la semilla de cha desgrasada y en aceite extrado con hexano mostr que: la mayor cantidad de compuestos fenlicos se mantuvieron en la fraccin desengrasada y no en el aceite. El contenido de fenoles totales de la semilla de cha desengrasada, mostr valores por encima de algunos frutos que se consideran sperfrutos como la uva roja y fresa. El contenido de fenoles totales del aceite de cha en promedio (5.8 mg cido glico/100 g de muestra) result ligeramente inferior al del aceite de olivo (15.5 mg cido glico/100 g de muestra).
Con relacin a la capacidad antioxidante total medida por el mtodo del ABTS, la fraccin desengrasada de la semilla de cha
independientemente del tipo de semilla, mostr una potente capacidad antioxidante, mientras que los extractos de aceite mostraron una capacidad antioxidante menor
92
El aceite que mostr mejor contenido de antioxidantes fue el 301, proveniente de la semilla del estado de Puebla, a pesar de no ser el que contiene mayor contenido de fenoles totales, fue el que mostr una mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de compuestos fenlicos al analizarse mediante electroforesis capilar.
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla, fue la semilla que se considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de compuestos fenlicos detectados mediante electroforesis capilar. Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de compuestos fenlicos est determinado por el suelo donde se cultiva la semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la composicin qumica del alimento. En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla de cha desengrasada, mostraron valores por arriba de algunos frutos como: granada y del kiwi, valores muy cercanos a la frambuesa, cereza y manzana roja. Lo anterior convierte a la semilla de cha en un excelente complemento en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes.
93
6. BIBLIOGRAFA Albarrn Guadalupe. 2000. Electroforesis capilar en el estudio de la oxidacin radiolitica del benceno en solucin acuosa. Sociedad qumica de Mxico. ao/vol. 44 nm. 003 p. 194-199. A.O.A.C, 1995. Methods of analysis of the A.O.A.C international XVI edition. Association of oficial analytical chemist. USA. Avello, Marcia y Suwalski, Mario. 2006. Radicales libres, antioxidantes naturales y mecanismos de proteccin. Atenea (Concepcin.), no.494, p.161-172. ISSN 0718 - 0462. Ayerza, R. and W. Coates. 1996. New industrial crops: Northwestern Argentina Regional Project. p. 45-51. In: J. Janick (ed.), Progress in new crops. ASHS Press, Alexandria, VA. Ayerza R. 1995. Oil content and fatty acid composition of cha ( Salvia hispnica) from five Northwestern locations in Argentina. Journal of the American Oil Chemists Society. 72 (9): 971-1090. Baiano G, Gambracorta C, Terracone M, Previtali C, Lamacchia and E. la Notte. 2009. Changes in Phenolic Content and Antioxidant Activity of Italian ExtraVirgin Olive Oils during Storage. Journal of Food Science. Vol. 74, Nr. 2 Ballester M, Castaer J, Rivera J, and Pascual L. 1984. Spin-charge exchange in a stable radical-carbenium ion. Journal American Chemist`s Society. 106: 3.365-3.366. Beltrn M. y Romero M. 2003. La cha alimento milenario. Industria alimentaria. Septiembre Octubre. PP. 20-29. Blanco-Metzler A., Chan V., Ortiz L. 2009. Development of SICA-COR, a food composition information system for Costa Rica Journal of Food Composition and Analysis, Volume 22, Issue 5, Pages 442-445. Blasco, A. J., Barrigas, I., Gonzlez, M. C., and Escarpa, A., 2005. Fast and simultaneous detection of prominent natural antioxidants using analytical
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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

SECCIN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO E INVESTIGACIN DEPARTAMENTO DE GRADUADOS E INVESTIGACIN EN ALIMENTOS

PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS EN ALIMENTOS PRESENTA:

FRANCISCO ERIK GONZLEZ JIMNEZ

MXICO, D. F. DICIEMBRE 2010.

Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico.

Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico.

Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico.

Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico.

Condiciones ptimas experimentalmente.

9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16 17. 18.

22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.

31. 32. 33. 34. 35.

38. 39. 40. 41. 42. 43.

47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55.

1.1.3 USOS Y APLICACIONES

1.3 COMPUESTOS POLIFENLICOS

cidos cinmicos Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones

Fuente: Robards et al. 1999.

flavononoles y sus derivados.

1.3.3 ANLISIS DE COMPUESTOS FENLICOS.

1.4.1 TIPOS DE ELECTROFORESIS

1.4.2 FLUJO ELECTROOSMTICO (FE)

Figura 7. Formacin de la doble capa elctrica.

Figura 9. Deteccin de molculas con distinta carga.

Figura 10. Inyeccin electrocintica.

Figura 11. Inyeccin por vaco.

Flavonoides e isoflavonoides en cerveza

25 mM tetraborato de sodio pH10.5

Cortacero et al. 2005.

Figura 12. Semilla 094 Aumento 10x

Figura 13. Semilla 125 Aumento 10x

Figura 14. Semilla 287 Aumento 10x

II).- ELECTROFORESIS CAPILAR.

Figura 16. Desarrollo experimental.

%carbohidratos totales = 100- (% humedad + % protena + % grasa + % cenizas + % fibra)

Na2WO4 NaMoO Mo VI amarillo e

fenol MoW11O40 Mo V azul

3.12 ANLISIS DE COMPUESTOS ELECTROFORESIS CAPILAR.

HUMEDAD % 5.840.1 5.560.1 5.680.1 6.560.1

LPIDOS a % 30.361.6 30.201.4 30.511.0 32.410.7

PROTENA a % 21.981.91 19.842.13 22.962.01 20.830.98

CARBOHIDRATOS a % 16.400.5 15.000.9 12.000.6 10.501.6

FIBRA a % 20.710.4 24.550.8 24.450.3 25.510.7

CENIZA a % 4.090.1 4.450.1 4.200.1 3.920.1

Valores expresados en base hmeda por triplicado con desviacin estndar.

2 1.8 1.6 1.4 A 765 nm 1.2

y = 0.0033x + 0.1116 R = 0.9966

854.295.82 1052.613.36 1091.3413.33

Aceite 125* Aceite 287* Aceite 301*

2.470.13 3.800.23 5.210.23

Valores expresados en base hmeda. * Anlisis realizado por triplicado.

mg cido glico/100 g muestra

Figura 18. Fenoles totales en el aceite de cha y aceite de olivo.

y = -0.0292x + 0.6899 R = 0.9904

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6

Figura 19. Curva tipo Trolox expresada como M Trolox

(M Trolox/g muestra)a 9.670.79 7.390.39 6.590.20 22.910.91 10.700.52

(mol Trolox/g muestra)a 1.930.16 1.480.08 1.320.04 4.580.18 2.14.10

Valores expresados en base hmeda, por triplicado.

82 69 56.65 40 45.56 38 72.3

Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM

Figura 22. Electroferograma de la mezcla de 8 estndares.