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BIOTECNOLOGA
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Biologa Molecular
Ingeniera Gentica
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Sntesis de Sondas de ADN
Clonacin
Produccin de Protenas humanas Recursos humanos qumicos raros
Nuevos Antibiticos
Terapia Gnica
La ingeniera gentica, conocida tambin como manipulacin gentica, surge en los aos 70 (siglo XX) cuando se consigue introducir material gentico de una especie en clulas de otra especie muy distinta.
La biotecnologa manipula y modifica microorganismos o clulas obtenidas de animales y plantas en el mbito industrial (medicina, farmacia). No se incluyen actividades que manipulen animales o plantas enteras, aunque stas son necesarias posteriormente. En la naturaleza se produce una transferencia de material gentico entre bacterias, fenmeno llamado transformacin. La transferencia de forma artificial se realiza mediante la tcnica del ADN recombinante. A sta se han ido sumando otras tcnicas de ingeniera gentica que se analizan seguidamente.
Conjunto de tcnicas nacidas de la Biologa molecular que permiten manipular el genoma de un ser vivo
cromosoma
Homo sapiens
gen
Mediante la ingeniera gentica se pueden introducir genes Escherichia coli en el genoma de un individuo que carece de ellos
Aislamiento y manipulacin de fragmentos de ADN de un organismo para introducirlo en otro (ADN recombinante)
Nathans D., Arber W., y Smith H. (premio Nobel de Fisiologa y Medicina en 1978 por el descubrimiento de las enzimas de restriccin y su aplicacin en Gentica Molecular)
Se basa en la capacidad de ciertas bacterias que contienen enzimas llamadas restrictasas o endonucleasas de restriccin (actualmente se comercializan ms de cien enzimas diferentes) que cortan el ADN por sitios especficos que reconocen, obtenindose fragmentos de restriccin. Para que se puedan unir despus los fragmentos de ADN extrao y el ADN que se utilizar como vector, se han de cortar ambos con la misma restrictasa. Comparando dichos fragmentos, se construyen los mapas de restriccin, los cuales se usan para comparar genomas de especies diferentes y establecer cambios evolutivos as como para detectar mutaciones cromosmicas como delecciones e inserciones.
Restrictasa (Bacteria origen) EcoR1 (Escherichia coli) Secuencia reconocida ...G-A-A-T-T-C... ...G-T-T-A-A-G... Fragmentos de restriccin A-A-T-T- C... G... G... ...C-T-T-A-A
Molcula A
Molcula B
Digestin de ambas molculas con la misma enzima de restriccin, BamHI Extremos cohesivos Mezclar
ADN recombinante
Mediante la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR en ingls) se pueden obtener grandes cantidades de ADN que permiten diferentes anlisis, a partir de cantidades mnimas. Se basa en el proceso de replicacin del ADN, para ello se utilizan unos oligonucletidos que se han de disear como cebadores que inician la replicacin "in vitro". La replicacin se repite multitud de veces duplicando en cada ciclo la cantidad de ADN obtenido.
Esta sntesis artificial de ADN se ha de realizar a altas temperaturas para que las dos cadenas de ADN no se enrollen entre s, lo cual puede realizarse gracias a una enzima ADN polimerasa obtenida de una bacteria termfila.
Esta tcnica tiene mltiples utilidades: realizar pruebas de paternidad o averiguar la autora de un delito; diagnosticar enfermedades hereditarias antes del nacimiento, analizar restos de tejidos en huesos para hacer estudios filogenticos; realizar secuenciaciones de genomas (mucho ms rpido que a partir de la clonacin en clulas), etc.
Figura 1: Clonacin de ADN por la reaccin en cadena de la polimerasa
En 1983 Kary Mullis da a conocer esta tcnica y en 1993 recibi el Premio Nobel de Qumica por este descubrimiento
72C copia de cada una de las hebras de ADN por la ADN polimerasa
35 ciclos
La transformacin de bacterias con ADN extrao se produce en muy pocas clulas (baja eficacia) en condiciones de laboratorio. Por ello, se emplean vectores genticos que funcionan como taxistas que transportan a un cliente el ADN recombinante. Los vectores ms usados son: a) un plsmido (fragmento extra de ADN bicatenario circular de unos 4,3 kb, que existe en algunas especies de bacterias).
Si la introduccin de ADN extrao se realiza en clulas eucariotas no reproductoras se denomina al proceso transfeccin. Si la introduccin se realiza en clulas reproductoras de plantas y animales, la alteracin gnica va a estar presente en todas clulas del cuerpo, en este caso se habla de transgnesis
La multiplicacin de las clulas que contienen el ADN recombinante (ADNr), ya sea en un plsmido o en un csmido, o en su propio ADN (si se us un virus vector), produce una clonacin de ste, es decir, la produccin de mltiples copias idnticas de ADNr que lleva el gen extrao, una copia en cada clula. Pero cada clon de clulas tendr un fragmento de ADN extrao distinto. Al conjunto de estas copias de ADNr diferentes se denomina biblioteca genmica. Lo que se tiene que hacer ahora es seleccionar el clon de clulas (colonia crecida en agar) en cuyo interior est contenido el fragmento de ADN con el gen que interesa. Esto se consigue mediante la obtencin de una molcula de ADN complementario (ADNc) a partir de su propio ARNm procedente del gen extrao que se ha expresado.
Plsmido
Plsmidos
gen de resistencia a la ampicilina
2
Extremos cohesivos
Plsmido
Virus
Ciclo lisognico
Ciclo ltico
(f)
(g)
(h)
Genoma de hongos: 44 millones de pares de bases Huesped: Escherichia coli Vector: Bacterifagos capacidad: 20 mil pares de bases
Genoma humano: 3000 millones de pares de bases Huesped: Saccharomyces cerevisiae Vector: YAC (cromosoma artificial de levadura) MegaYAC (capacidad: 1 milln de pares de bases)
La tcnica de la clonacin de ADN ha permitido obtener gran cantidad de este cido nucleido para que pueda realizarse su secuenciacin y conocer la composicin qumica de cada gen, conocimiento que se considera de incalculable valor. Esto ha posibilitado la obtencin de secuencias de genomas completos (son cada vez ms los organismos y virus que son secuenciados, incluida la especie humana).
La tcnica de Sanger (o del didesoxi), que es como se llama, se basa en la sntesis de ADN, usando como molde una versin monocatenaria del ADN que va a ser secuenciado. La tcnica utiliza cuatro nucletidos especiales, los didesoxinucletidos (de aqu el nombre de la tcnica) que provocan la terminacin de la sntesis de fragmentos de ADN, los cuales segn su longitud se situarn en distintos sitios en una placa de gel y de ah se deduce la secuencia de nucletidos.
ACTTTGTCCACGGCCTAAGCGTTTTTTGCCC
Secuenciacin de genomas
Existen en la naturaleza unos centenares de especies de microorganismos (bacterias, levaduras, mohos, algas unicelulares) que producen sustancias que presentan algn inters para la especie humana.
Cuadro II: Algunos de los principales productos industriales obtenidos con la ayuda de los microorganismos
Los productos que tienen un inters comercial se pueden agrupar en cuatro clases: a) productos del metabolismo primario( dixido de carbono, etanol, cido actico, aminocidos, etc.).
b)
c) d)
Deteccin de mutaciones
Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayora estn daadas o degradadas)
Diagnstico prenatal / Diagnstico preimplantacin de enfermedades hereditarias o determinacin del sexo del feto previamente a su implantacin en procesos de fecundacin in vitro
Secuenciacin de genomas
2.
(insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulacin antes se obtenan a partir de los tejidos que las producen o fluidos corporales)
Mediante ingeniera gentica se construye una sonda de ADN, marcada (marcaje fluorescente), con la secuencia complementaria del ADN enfermo
Si aparecen bandas fluorescentes demuestra que la persona presenta la anomala Hibridacin? Renaturalizacin No hibridacin? del ADN con la sonda fluorescente Desnatura lizacin del ADN ADN de la persona que se quiere diagnosticar
Plantas transgnicas
ncleo cromosoma
Transgnesis= introduccin de ADN extrao en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las clulas en los organismos multicelulares.
Ingeniero gentico natural tras sutitucin de genes onc por genes de inters
cromosoma clula vegetal tumores Proliferacin de hormonas crecimiento. Se forman tumores en las zonas de la lesin
Anticuerpos animales, interfern, e incluso elementos de un polister destinado a la fabricacin de plsticos biodegradables
Transgnesis en animales
Gen humano
Gen hbrido
rata
Clonacin de animales
La industria farmacutica produce actualmente toda una gama de sustancias que obtiene de microorganismos como son: sustancias antimicrobianas (sobre todo antibiticos de diversos tipos), vacunas, vitaminas, hormonas peptdicas (como la insulina, la hormona del crecimiento o somatotropina), factores hipotalmicos (como la somatostatina, ver figura) y enzimas.
Escherichia coli
El proceso de fermentacin ha sido manipulado por el hombre de diversas formas para obtener toda una serie de alimentos y bebidas.
As, por fermentacin lctica se produce queso y yogur; la fermentacin alcohlica se emplea para la elaboracin de pan fermentado (en este caso se aprovechan las burbujas de dixido de carbono para esponjar el pan) y bebidas alcohlicas como el vino, la cerveza (ver figura 3), sidra, etc. En la fermentacin alcohlica se emplean diferentes especies de levaduras (hongos unicelulares) del gnero
Saccharomyces
Diversos tipos de industrias utilizan microorganismos para la obtencin de sustancias de inters como aminocidos (cido glutmico en forma de glutamato monosdico usado como potenciador de sabores y aromas); cidos orgnicos como ctrico, actico (utilizado en la fabricacin de acetatos, pelculas fotogrficas, etc.); butanol (empleado en la fabricacin de plastificantes), etanol (como combustible), enzimas como proteasas (usadas en detergentes), etc.
En las industrias mineras se utilizan micoorganismos para extraer por biolixiviacin metales preciosos, metales pesados, uranio y petrleo.
En los animales el ADN extrao o transgn se introduce en zigotos de modo que el embrin que resulte haya integrado el transgn en todas las clulas y origine un organismo transgnico. Una forma de conseguir la transgnesis es mediante la tcnica de la microinyeccin de zigotos, en la que se inyecta con una micropipeta el material gentico que se desee. Otra posibilidad es utilizar clulas embrionarias en las que se inocula el transgn mediante diversas tcnicas (electroporacin, transfeccin con virus o por microinyeccin).
Aparato de microinyeccin
Las aplicaciones son mltiples, como con las plantas, desde el uso de animales como biorreactores para la produccin de protenas de inters (humanas o de otro tipo), hasta el estudio de genes especficos y la posibilidad de la terapia gnica en humanos. Cuando el ADN extrao que se introduce no afecta a clulas germinales, sino a las clulas somticas, se denomina al proceso tranfeccin y para conseguirla se usan distintas tcnicas. Las clulas transfectadas tienen gran inters en la obtencin de lneas celulares alteradas capaces de producir compuestos comerciales.
Fases en la transfeccin de ADN segn diversas tcnicas
Qu es la clonacin?
Obtencin de organismos genticamente idnticos En el campo de la Ingeniera gentica consiste en aislar y multiplicar un gen, o en general, un trozo de ADN
En Animales superiores consiste en obtener un individuo a partir de una clula o de un nucleo de otro individuo
Clonacin de animales
Terneros clonados y manipulados genticamente (fbrica de anticuerpos humanos) genes para anticuerpos humanos recombinantes clulas drmicas clonacin
Objetivo: Tratamiento de enfermedades inmunolgicas Futuro: Tratamiento de una amplia gama de enfermedades ocasionadas por bacterias y virus, como hepatitis, ntrax (utilizada como arma biolgica)
La empresa escocesa PPL Therapeutics logra retirar de los cerditos el gen que provoca el rechazo en transplantes a humanos "alfa 1,3
galactosil transferasa"
Paso importante en favor del xenotrasplante (transferencia de clulas u rganos de una especie a otra)
Ayudar a superar la escasez de rganos humanos para hacer trasplantes de todo tipo
La posibilidad de clonar animales mamferos, tanto a partir de clulas embrionarias como de clulas diferenciadas (caso de la oveja Dolly), abre la puerta para la clonacin de humanos. Para mayor polmica se publica en 1993 un experimento de clonacin humana hecho con embriones humanos que no podran haber sobrevivido, pero que mediante la disgregacin de sus clulas se obtuvieron 48 embriones clnicos (idnticos genticamente) que fueron posteriormente destruidos.
Clonar personas enteras est prohibido en muchos pases y condenado por muchas instituciones, pero clonar tejidos humanos con fines teraputicos es pedido por multitud de cientficos, sobre todo desde que se puede dirigir la diferenciacin de clulas madre hacia la obtencin de tejidos concretos.
Tcnica de clonacin
La clonacin humana ya se est intentando de forma clandestina por varios laboratorios en el mundo
La clonacin reproductiva no arroja los resultados suficientes, no existen garantas como para decir 'Vamos a clonar un ser humano'
Por cada intento de clonacin hay detrs miles de fallos, Para obtener a Dolly: 277 fusiones de abortos y malformaciones ovocitos con clulas mamarias, solo genticas 29 embriones fueron aptos. De estos solo uno result un xito
CREACIN DE UN EMBRIN ARTIFICIAL (con clulas adultas) -embrin somticoOBJETIVO LTIMO: TRATAMIENTO de ENFERMEDADES 1 Cultivo de blastocisto OBJETIVO LTIMO: AUTOTRASPLANTES (no hay rechazo) Fecundacin
Fusin de clula somtica y ovulo enucleado En caso de existir deficiencias a nivel gentico se puede hacer terpia gnica a nivel de clulas madre
7 Administracin de clulas diferenciadas a tejidos daados 5 Formacin de clulas diferenciadas a tejidos daados
Las clulas madre abren la posibilidad a un nuevo mundo en las terapias de los trasplantes
Calificada como una tcnica "ineficaz e imperfecta" por cientficos como Iam Wilmut, "padre" de la oveja Dolly, la clonacin ha encontrado en las clulas "madre" su primera razn de ser. Retos tcnicos 1. Las clulas embrionarias de ratn originan teratomas y teratocarcinomas en animales adultos
2.
3.
Declaracin Universal de Derecho Humanos y Genoma Humano de la UNESCO (1997), adoptada en 1998 por la Asamblea General de ONU (busca un balance entre una
continuacin en las investigaciones y la salvaguarda de los derechos humanos)
Frente a los mltiples beneficios de la ingeniera gentica pueden surgir algunos problemas
Problemas ecolgicos
desaparicin de especies con consecuencias desconocidas, nuevas contaminaciones debidas a un metabolismo incontrolado, etc...
Poder conocer y modificar el patrimonio gentico humano puede ser una puerta abierta al eugenismo "Eugenesia: la ciencia del incremento de la felicidad humana a travs del perfeccionamiento de las caractersticas hereditarias".
El genoma es...
El conjunto completo de genes de un organismo, donde se guarda toda la informacin genetica.
Previo al comienzo del Proyecto: 5000 genes. En 1996 el consorcio haba localizado 16.000 genes, en 1998 la cifra aument a 30.261 genes. Se estima que el nmero de genes humanos es de 60000 a 80000.
N de Genes
Este proyecto de investigacin tiene como objetivo averiguar la secuenciacin completa de nucletidos de los 23 pares de cromosomas humanos, para conocer la composicin qumica exacta de todos los genes (genoma) y su ubicacin en cada uno de los cromosomas, as como toda la informacin adicional extra no codificante (el llamado ADN basura) y estudiar su funcin.
En 1997, el Genoma humano fue declarado patrimonio de la Humanidad por la UNESCO, para evitar que se comercialice con l. En junio del ao 2001 se presenta una primera aproximacin de la secuencia completa, descubrindose que tenemos muchos menos genes (unos 30.000) de los inicialmente previstos (100.000).
Ubicacin de algunas enfermedades genticas conocidas en el mapa gentico humano
Las enfermedades genticas debidas a un solo gen defectuoso ascienden a ms de 4000, de las cuales 345 afectan al cromosoma X, por lo que sern transmitidas a los nios varones, si su madre posee uno de esos defectos genticos. La terapia gnica est siendo considerada la cuarta revolucin de la medicina (despus de las medidas de salud pblica, la anestesia, y las vacunas y antibiticos). Para su aplicacin se siguen dos estrategias: a) Insertar una copia sana de un gen en las clulas del paciente con una enfermedad gentica, para compensar el efecto del gen defectuoso ( esto se consigui con una nia que tena una inmunodeficiencia grave). b) Introducir un gen especialmente diseado para que proporcione una nueva caracterstica a las clulas (por ejemplo, introducir en linfocitos un gen que produzca un inhibidor del virus del sida en pacientes afectados por el VIH).
Las vacunas contienen un agente patgeno causante de una enfermedad infecciosa, pero o est muerto o est atenuado (son cepas muy poco virulentas). Tambin se puede vacunar con subunidades del patgeno, stas pueden hoy da fabricarse mediante ingeniera gentica en gran cantidad. Las subunidades son protenas con poder antignico. As, se ha conseguido obtener la vacuna de la hepatitis B mediante la tecnologa del ADN recombinante. El gen de la subunidad proteica del virus de la hepatitis fue introducido en la bacteria Escherichia coli y en la levadura Saccharomyces cerevisiae, las cuales produjeron en cultivo la protena del virus. Los anticuerpos sirven como defensa frente a enfermedades infecciosas y sustancias extraas, pero adems son un medio de curacin para aquellos enfermos que no son capaces de producirlos. La tcnica de los anticuerpos monoclonales permite obtener gran cantidad de ellos y sin impurezas; consiste en inmortalizar las clulas responsables de su fabricacin, las clulas plasmticas que se forman por activacin de los linfocitos B. La forma de conseguirlo es hibridando clulas plasmticas y clulas tumorales con capacidad para multiplicarse indefinidamente (clulas de mielomas), el resultado son clulas hbridas llamadas hibridomas que se pueden clonar. Cada clon (procedente de un solo hibridoma) producir un anticuerpo monoclonal.
La biotecnologa se puede aplicar a otras facetas de la vida social adems de las mencionadas. De entre todas ellas es de destacar su utilizacin en relacin con el derecho y la ciencia forense.
En el esclarecimiento de un crimen puede ser crucial la prueba que aporte el bilogo forense al determinar la huella gentica del criminal a partir de un resto de saliva en un cigarrillo (contiene clulas de la mucosa bucal), una mancha de sangre (leucocitos), restos de semen (espermatozoides) o un simple pelo (clulas del folculo piloso). La tcnica que se aplica es la del perfilado del ADN o prueba del ADN . Se basa en la presencia de regiones en el material gentico no codificante que se denominan minisatlites , y que contienen muchas repeticiones en tndem de una pequea secuencia de nucletidos. Para su deteccin se utilizan sondas gnicas (oligonucletidos marcados con tomos radiactivos), de modo que cada sonda detecta un minisatlite. Estos minisatlites son de diferente longitud en cada persona puesto que el nmero de repeticiones en tndem es variable. La huella gentica tambin puede utilizarse para realizar pruebas de paternidad y para identificar a personas desaparecidas de las que se tengan sus huesos; esto ocurri con los restos seos de los miembros de la familia del ltimo zar de Rusia asesinados por los bolcheviques.
Tcnica utilizada en la prueba del ADN