Tema 15

Tecnologa de DNA recombinante

1.Endonucleasas de restriccin 2.Hibridacin de cidos nucleicos 3.Clonacin gnica 4.Expresin de DNA recombinante 5.Reaccin en cadena de la polimerasa 6.Reemplazamiento gnico e inactivacin gnica

Conceptos bsicos
La tecnologa de DNA recombinante es un conjunto de mtodos empleados para localizar, aislar, alterar, estudiar y recombinar secuencias de DNA. Cules son las aplicaciones de la tecnologa de DNA recombinante?: La investigacin de la estructura y la funcin de los genes a nivel molecular La creacin de nuevos productos comerciales (biotecnologa) El diagnstico y el tratamiento de enfermedades Cules son las principales tcnicas de DNA recombinante?: Tcnicas de corte del DNA en localizaciones especcas (enzimas de restriccin) Mtodos para obtener numerosas copias de un fragmento de DNA especco (clonacin gnica) La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Mtodos para localizar secuencias de DNA (hibridacin de cidos nucleicos) Procedimientos para introducir secuencias de DNA en clulas receptoras Tcnicas para inducir mutaciones en secuencias de DNA especcas Mtodos de expresin de DNA recombinante

Endonucleasas de restriccin
La ingeniera gentica se desarroll gracias al descubrimiento de las enzimas de restriccin (o endonucleasas de restriccin) que son capaces de reconocer y cortar secuencias especcas de DNA de doble cadena.

Estas enzimas las producen de forma natural las bacterias y las utilizan como defensa contra los virus cortando su DNA. El DNA propio se protege frente a la digestin mediante metilacin de las dianas de corte. Las secuencias reconocidas por las enzimas de restriccin son normalmente palndromos. Los productos de la digestin pueden ser extremos cohesivos o extremos romos.

Endonucleasas de restriccin
extremos cohesivos

extremos cohesivos

extremos cohesivos

extremos cohesivos

extremos romos.

extremos romos.

extremos romos.

extremos cohesivos

Digestin y ligacin de DNA

Un fragmento de DNA puede cortarse con una enzima de restriccin y despus unirse a otro fragmento con extremos complementarios empleando la DNA ligasa.

DIGESTIN

Solo pueden unirse fragmentos que tengan extremos complementarios (cohesivos) o extremos romos. LIGACIN

El nuevo fragmento de DNA generado mediante ligacin es DNA recombinante.

Enzimas importantes en ingeniera gentica

Nucleasas Ligasas DNA polimerasas

Mapas de restriccin
Partimos de una preparacin de DNA lineal de 7Kb Se somete a digestin con las enzimas HindIII y SalI

Se construyen dos modelos tericos que son consistentes con los resultados de las digestiones simples

La digestin doble HindIII - SalI descarta el modelo 2 Necesitamos ms datos para saber si los sitios de corte estn efectivamente en el extremo 5, o bien estn en el extremo 3

Hibridacin de cidos nucleicos

La capacidad de los cidos nucleicos de hibridar entre s ha sido muy importante en el desarrollo de la ingeniera gentica. La temperatura de hibridacin y la fuerza inica del tampn de hibridacin son parmetros esenciales para controlar las condiciones de estringencia de la hibridacin.

Hibridacin de cidos nucleicos - Southern blot

El anlisis Southern blot es una tcnica que se emplea para localizar secuencias de DNA o fragmentos de DNA en una poblacin de molculas de DNA separadas mediante electroforesis.

1er paso: electroforesis en gel de agarosa

2 paso: transferencia (blotting)

Hibridacin de cidos nucleicos - Southern blot

3er paso: hibridacin con una sonda marcada

4 paso: autorradiografa Al nal del proceso podemos saber el tamao del fragmento que hibrida con nuestra sonda. Southern blot - DNA Northern blot - RNA Western blot - Protenas

Clonacin gnica
La clonacin gnica consiste en la obtencin de numerosas copias idnticas de una molcula de DNA. Para clonar un fragmento de DNA se emplean vectores de clonacin.

Vectores de clonacin
Un vector de clonacin es una molcula de DNA replicante y estable a la cual puede incorporarse un fragmento de DNA extrao (inserto) para la introduccin en una clula mediante tcnicas de transformacin o transfeccin.

Vectores de clonacin
Caractersticas esenciales de un vector de clonacin: Un origen de replicacin que asegure que el vector pueda replicase dentro de una clula Marcadores de seleccin Una regin con sitios de restriccin nicos donde poder insertar un fragmento de DNA

marcadores de seleccin

sitio de clonacin mltiple (MCS) oriC

Vectores de clonacin
EcoRI EcoRI

Ligacin inserto

Religacin vector

Clonacin gnica
Una vez que el fragmento de DNA ha sido clonado en un vector es necesario amplicar el nmero de copias del plsmido recombinante.

E. coli

Transformacin Otros tipos de vectores:

cultivo celular

aislamiento del DNA plasmdico

Vectores lanzadera - permiten su replicacin en dos huspedes (bacterias/levaduras) Vectores epismicos - elevado nmero de copias por clula Vectores centromricos - una copia por clula Cromosomas articiales de levaduras - una copia por clula capaz de segregar como los cromosomas Vectores de expresin - permiten dirigir la expresin de un ORF clonado

Vectores lanzadera - epismicos

E. coli / mamferos E. coli / levadura

YACs - yeast articial chromosomes

Principales caractersticas de los YACs:

Las Los
clula

bras del huso mittico se adhieren al centrmero y segregan

igual que los cromosomas de levaduras telmeros garantizan la estabilidad de los YAC dentro de la

Los YAC pueden albergar insertos muy grandes (hasta 1Mb)

Tambin existen modicaciones de los YAC ue pueden usarse en otros eucariontes. Los BAC se emplean en bacterias y se utilizan para clanr fragmentos de hasta 500 Kb.

Vectores de expresin
Los vectores de expresin contienen promotor, secuencias de unin al ribosoma y terminador que dirigen la expresin de un ORF determinado

northern

western

Vectores de expresin - protenas de fusin

Existen tcnicas que permiten fusionar una protena de inters a otra protena que sirva para localizar la fusin, o bien para puricar la protena de fusin. atg promotor rbs GST
sitios restriccin

MCS terminador

atg promotor rbs GST ORF terminador

GS T

protena

Vectores de expresin - protenas de fusin

sitio de corte proteasa ORF terminador

atg promotor rbs

GST

GS T

protena

GS T

protena

PCR - reaccin en cadena de la polimerasa

Cada gen es un fragmento diminuto de DNA celular. Para abordar el estudio molecular de un gen debemos aislarlo y amplicarlo. Antes de 1983 la nica tcnica disponible era la clonacin gnica. En 1983 Kary Mullis ide una nueva tcnica para amplicar DNA en un tubo de ensayo. Se denomin Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) y fue una autntica revolucin para la ingeniera gentica. La base de la PCR es la replicacin catalizada por una DNA polimerasa con tres elementos esenciales:

Un molde de DNA monocatenario Un cebador (primer) con un grupo 3-OH libre Dideoxinucletidos (dNTPs)
La PCR consta de tres pasos que se van repitiendo:

Desnaturalizacin del DNA molde (94C) Anillamiento de los primers al DNAss

(40-65C)

molde

Extensin de la nueva cadena de DNA (68-72C)

PCR - reaccin en cadena de la polimerasa

La PCR requiere dos tecnologas innovadoras

Una DNA polimerasa que no se desnaturaliza a 90C Un termocliclador automtico

Algunas limitaciones de la PCR son:

Requiere

el conocimiento previo de parte de la secuencia que

se quiere amplicar para poder disear los primers

El DNA contaminante puede ser un problema El tamao de los productos de PCR no puede
10-20Kb Despus de 25 ciclos habr 225 molculas

ser mayor de

Un alto contenido G+C del DNA puede inhibir la reaccin

PCR - reaccin en cadena de la polimerasa

Reemplazamiento gnico y knock-out

El proceso de recombinacin homloga de secuencias de DNA permite realizar cambios en el genoma para cambiar o inactivar un gen u otro elemento gentico.

gen X

gen X

reemplazamiento gnico gen X mutante

knok-out (disrupcin) no gen X

Clonacin reproductiva y teraputica