LA CITOMETRA DE FLUJO: La citometra de flujo es una tcnica de anlisis celular que implica medir las caractersticas de dispersin de luz

y fluorescencia que poseen las clulas conforme se las hace pasar a travs de un rayo de luz. Objetivos principales de la citometria de flujo:

- Identificar y enumerar subpoblaciones celulares nicas y definidas. - Seleccionar y separar fsicamente subpoblaciones de clulas deseadas (por defleccin electrosttica ; esta tecnologa de separacin se llama "electronic cell sorting") - Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas

Para el anlisis de las clulas en un citometro de flujo, las clulas deben encontrarse individualmente en suspensin en un fluido y atraviesan un finsimo tubo transparente sobre el que incide un delgado rayo de luz lser. Al atravesar el rayo de luz, las clulas interaccionan con este causando dispersin de la luz, basndose en la difraccin de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamao de las clulas que pasan (parmetro denominado Forward Scatter) y al medir la reflexin de la luz de manera lateral se evala la granularidad o complejidad de estas (parmetro denominado Side Scatter).

Las clulas sanguneas pueden analizarse prcticamente de manera directa, las clulas de tejidos slidos deben primero dispersarse. Las clulas pueden hacerse pasar a muy altas velocidades (pueden llegar a alcanzarse velocidades cercanas a las 100,000 clulas por segundo). o Esquema de disposicin de elementos en un citmetro de flujo:

Una fuente emisora de luz monocromtica, usualmente un haz de luz lser (A) enva un rayo que es colimado (L1) y enfocado (L2) por medio de lentes sobre la cmara de flujo laminar (C), luego de atravesar la cmara el rayo de luz directa es detenido por una pantalla (s), mientras que la luz dispersada es enfocada por otra lente (L3) sobre un fotodiodo (D1), esto constituye el detector de dispersin frontal (FSC). La luz dispersada lateralmente y la fluorescencia se enfocan por medio de una lente sobre un espejo dicroico (M) que refleja la mayor parte de la luz de igual longitud de onda a la producida por la fuente (A), atraviesa un filtro (F1) e incide sobre un detector. Esto constituye el sistema de deteccin de dispersin lateral (SSC).La luz que no es reflejada por el espejo dicroico, ya que tiene una longitud de onda diferente a la emitida, lo atraviesa e incide sobre un filtro interferencial (F2) que puede ser ajustado para una determinada longitud de onda, discriminando as entre diferentes fluorforos, para finalmente incidir sobre un tubo fotomultiplicador (D3), esto constituye el detector lateral de fluorescencia (SFL).

El impacto de cada clula con el rayo de luz produce seales que corresponden a diferentes parmetros de la clula y que son recogidos por distintos detectores.

Parametros: - Caractersticas Morfolgicas de la clula : tamao y complejidad del citoplasma - Caractersticas antigenicas de la clula : Inmunofenotipo. Parametros fisicos

Su tamao relativo (forward scatter-FSC) Su granularidad relativa o complejidad interna ( side scatter SSC).

Fluorescencia relativa (FL1, FL2, FL3): Determinacin cuantitativa de caractersticas antignicas, bioqumicas y biofsicas de clulas individuales

Como se detectan estas caractersticas celulares: El citmetro de flujo detecta como las clulas interactan con un rayo lser en trminos de cmo la clula :

desva la luz incidente (parmetros FSC y SSC) emite fluorescencia (parmetros FL1. FL2. FL3)(1). Seales de dispersion :

- Forward Scatter (FS) :luz dispersada frontalmente en ngulo cnico pequeo (0-10 grados) coincidente con luz incidente y es proporcional a tamao de la partcula que produce la dispersin. La luz es desviada a bajos ngulos entre 1 y 10 grados Generalmente proporcional al tamao celular Detectada a lo largo del eje del rayo de luz incidente en direccin delantera - Side Scatter (SSC) : luz dispersada lateralmente es proporcional al la complejidad de la estructura celular. Luz es desviada a altos ngulos Proporcional a la granularidad de la clula y su complejidad Detectado a 90 grados del eje de luz incidente.

Realizacin de citometria de flujo:

Se hace en 3 etapas independientes : Fase pre-citometra: preparacin de los reactivos, preparacin de las clulas, diseo del protocolo y coloracin de las clulas con los reactivos fluorescentes. Fase de citometra de flujo : involucra el procesamiento de las clulas marcadas y la recoleccin de los datos para cada una de las medidas (parmetros) realizados en cada clula individual. Fase de anlisis: anlisis de los datos recolectados La mezcla de clulas teidas con diferentes fluorocromos es forzada a pasar a travs de una aguja creando una delgada fila de lquido que contiene las clulas. A medida que cada clula pasa en frente del lser, desva el rayo incidente y las molculas teidas unidas a la clula van a ser excitadas y emiten luz fluorescente. Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las emisiones fluorescentes, la informacin es digitalizada y procesada por el computador. Los resultados son presentados a manera de histogramas o "dot-plots" Fluorescencia: Un fluorocromo es una molcula qumica que absorbe la luz a una determinada longitud de onda (ENERGIA ) energa de excitacin y emite a una longitud superior (MENOR ENERGIA) Interacciona con la luz de excitacin procedente de el lser. Se utiliza unido a anticuerpos especficos (monoclonales ) para antgenos de la clula. La cantidad de fluorescencia con la cual una clula se tie es proporcional a la cantidad de sitios de unin. Cmo se obtiene la luz fluorescente. Unin de sitios especficos con anticuerpos marcados con fluorocromos El fluorocromo absorbe energa del lser El fluorocromo libera energa absorbida por : Vibracin y disipacin del calor. Emisin de fotones a una mayor longitud de onda llamada fluorescencia.

Reactivos fluorescentes:

- Marcadores fluorescentes de unin covalente: Isoticianato de Fluoresceina, Picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas. - Marcadores fluorescentes de unin no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de acrimina, yoduro de propidio, rh12. - Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente . Pequeas molculas orgnicas (FITC, biotina): unin covalente directa con grupos amino libres en anticuerpos Protenas fluorescentes (ficoeritrina, aloficocianina): se unen a anticuerpos a travs de algunos reactivos. Aplicaciones de la citometria de flujo:

Hematologa : tipificacion y conteo de clulas , reticulocitos y anlisis de medula sea .

Farmacologa :estudios de cintica celular Inmunologa :subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular Oncologa :Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos Microbiologa :diagnostico bacteriano y virico ,estudios de sensibilidad a los antibiticos

Gentica: Cariotipo y diagnostico de portador y diagnostico prenatal. En la biologa marina, las propiedades autofluorescentes del plancton fotosinttico pueden ser explotadas por citometra de flujo para tal de caracterizar la abundancia y estructura de las comunidades marinas. En la ingeniera de protenas, la citometra de flujo se usa conjuntamente con la exhibicin de levadura y la exhibicin bacteriana para identificar las variantes de protenas exhibidas en membrana con las propiedades deseadas.

INMUNOTIPIFICACIN Es el proceso para determinar marcadores expresados en la superficie celular. Esta deteccin se hace empleando anticuerpos monoclonales antgenoespecficos marcados con un fluorocromo dirigidos al marcardor que queremos Para esto, es necesario aislar previamente las clulas a analizar ( por ejemplo linfocitos, a partir de sangre total, por gradiente de ficoll ). Las clulas son luego estimuladas a producir los marcadores ponindolas en contacto con un antgeno capaz de estimular su sntesis. evaluar.

Posteriormente estas son incubadas con una sustancia denominada brefeldina A (BFA) cuya funcin es impedir que las clulas expulsen las citoquinas que estn sintetizando, haciendo entonces que se acumulen en su interior.Despus las clulas son fijadas, permeabilizadas y finalmente marcadas con los anticuerpos especficos. Una vez realizado este ltimo procedimiento, las clulas estn listas para ser ledas en el citmetro (2, 5).

ENSAYO

DE

CAPTURA

DE

SECRECION

Se ha utilizado para cuantificar la secrecin de citoquinas a partir de linfocitos T El procedimiento utilizado es : Encapsulacin de la clula en una microgota de agarosa con biotina Incorporacin de un anticuerpo dirigido contra la citoquina que queremos detectar Unin no especfica y retencin del anticuerpo en la matriz de agarosa Incorporacin de un segundo anticuerpo que reconoce la unin antgeno- anticuerpo ya formada. Este segundo anticuerpo est marcado con un fluorocromo Las microgotas se analizan en el citmetro, midiendo la fluorescencia emitida por el fluorocromo, que es proporcional a la unin antgeno-anticuerpo (6).

- DETERMINACION DEL CONTENIDO CELULAR DE DNA Una suspensin de clulas es coloreada con un colorante fluorescente que se une estequiomtricamente con el DNA. La cantidad de colorante unido es entonces proporcional a la cantidad de DNA. Las clulas coloreadas se introducen entonces en el citmetro y la luz fluorescente emitida es proporcionarle al contenido de DNA de cada clula. Este anlisis nos da informacin adems sobre la distribucin de las clula en las diferentes fases del ciclo celular (G1, S, G2 o M). Sin embargo no es posible diferenciar G2 y M ya que en las dos se encuentra el mismo contenido de DNA. Se han desarrollado modelos matemticos para establecer el porcentaje de clulas que se encuentran en cada fase. Esta informacin puede complementarse utilizando antgenos cuya expresin est restringida a un momento del ciclo celular en particular. Por ejemplo en las fases G1 y S tempranas hay un incremento en la excrecin del antgeno celular nuclear proliferante (PCNA) : por otra parte el antgeno Ki-67 es una protena nuclear que se incrementa linealmente a travs de todo el ciclo celular alcanzando la concentracin mxima en G2 y M. Al marcar ests protenas con anticuerpos especficos unidos a un fluorocromo, podemos entonces establecer con mayor precisin la fase del ciclo celular en que se encuentra la clula.

La medida del contenido de DNA tambin ha sido utilizada para determinar el grado de aploida de clulas malignas y el porcentaje de estas que se encuentran en fase S. Algunos autores sugieren que esta informacin es til para conocer el tamao del tumor, el estado nodal y el estado de expresin de marcadores para ayudar a establecer el pronstico del tumor (5,7). -APOPTOSIS: La apoptosis es la muerte celular programada. Hay varias enzimas implicadas en este proceso celular. Dichas enzimas pueden ser determinadas por citometra de flujo al ser unidas a anticuerpos marcados con fluorocromos (por ejemplo la dipeptidilpeptidasa, calpaina, aminopeptidasa y catepsina D , las dos ltimas implicadas en el proceso de apoptosis inducido por citoquinas y expresadas en la superficie celular.

-FAGOCITOSIS : Marcando bacterias con un colorante fluorescente, se puede analizar el proceso de facocitosis de estas por parte de macrfagos y neutrfilos. - VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO: Anlisis de un nmero estadsticamente significativo de clulas ( 1000 a ms de 100.000 clulas). Mltiples marcajes de una sola clula. Anlisis de alto numero de partculas en corto tiempo (5.000 eventos /seg. ). Alta sensibilidad y objetividad. Medidas separadas de cada clula (no slo el promedio). Medidas cuantitativas : discriminacin de las clulas segn la cantidad de marcador. Mltiples parmetros : define subpoblaciones complejas. Miles de clulas por segundo (1). DESVENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Poca informacin morfolgica de la clula No proporciona informacin de la localizacin celular en un tejido

Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de clulas / hora) Necesita suspensin de clulas individuales (1). Costos de la tecnologa Mtodo destructivo. Incapacidad de visualizar las clulas que se analizan.