ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS PECTIMETILESTERASA, POLIGARACTURONASA Y CELULASA DURANTE LA MADURACIN DE FRUTOS DE PARCHITA DE MARACUY.

(Passiflora edulis f

flavicarpa Degener) Autoras: Laura Aponte y Angel Guadarrama

La maracuy es una planta de origen tropical cuyos frutos presentan un sabor particular intenso y una alta acidez. La gran aceptacin en los mercados internacionales, hacen de este cultivo uno de los ms promisorios y rentables dentro de las lneas de los frutales en Venezuela, lo cual resaltaron la importancia e inters de investigar, sobre sus caractersticas, ya que en el presente no se cuenta con suficiente informacin. Palabras claves para el siguiente texto: maduracin, senescencia, cambios tipo cromtico, Los frutos, en general, presentan cambios visibles en sus caractersticas organolpticas por efecto del proceso de maduracin y senescencia; entre estos cambios los del tipo cromtico son muy frecuentes, as se tiene que la evaluacin del color en el caso particular de la parchita maracuy, los cambios de tonalidades que van desde el verde al amarillo como ndices de madurez. Otra caracterstica de la maduracin del fruto est constituida por la prdida de la firmeza (liberacin del agua ligada y desintegracin del tejido), la cual est estrechamente relacionada con la alteracin enzimtica de la laminilla media y pared celular de los frutos las cuales estn constituidas principalmente por sustancias pcticas, celulosa y hemicelulosa. La celulosa se ha vinculado con la hidrlisis de la celulosa de la pared celular lo cual resulta en la prdida de cohesin de la estructura fibrilar de la matriz de polisacridos de la pared celular.

(La celulosa es un polisacrido fibrilar que se organiza en microfibrillas y representa entre el 15% y el 30% del peso seco de las paredes celulares vegetales)
La PME ha sido consecuentemente relacionada con la degradacin de las sustancias pcticas de la laminilla medianera de la clula, componente de la pared celular que acta ligado entre las clulas controlando los movimientos de materiales solubles; est se encuentra activa especialmente en frutos. El control de la actividad de la PME se encuentra referido a travs del conocimiento de su dependencia a ciertos parmetros, como la temperatura y el pH, y ocupa gran importancia en la industria alimenticia quienes procuran mantener las caractersticas texturales de los frutos y sus productos procesados. Como se ha mencionado, la PME est involucrada en la prdida de la estabilidad de los jugos vegetales a travs de la deesterificacin de las pectinas, seguida por la coprecipitacin de los pectatos con los materiales insolubles presentes en los jugos. La desestabilizacin es observada frecuentemente cuando los productos vegetales han sido sujetos a tratamientos trmicos

obtenindose productos estriles y estables; puede ser causada por actividades enzimticas residuales que hayan pasado el tratamiento trmico. La PG es otra enzima involucrada tambin con la degradacin de las sustancias pcticas y se ha sugerido que en los frutos en maduracin la PME prepara la pared para la hidrlisis a ser ocasionada por el efecto de la PG, la cual ataca los residuos pcticos desmetilados. La principal responsable de la solubilizacin total de las pectinas insolubles es la PG conllevando de esta manera al ablandamiento del fruto por cambios en la estructura de la pared. La actividad de la celulasa se incrementa en forma gradual y al mismo tiempo que la PME.

MATERIALES Y METODOS

Se utilizaron frutos de parchita de maracuy procedentes del stos se cosecharon en cuatro estados de madurez, directamente de las plantas, la seleccin se hizo sobre la base de una escala de coloracin en donde el estado verde presentaba 0% de coloracin amarilla, el estado de madurez fisiolgico con un 25% de coloracin amarilla, el estado maduro con un 75% de coloracin amarilla y por ltimo el estado sobremaduro con un 100% de coloracin amarilla hacia marrn. Esta clasificacin fue respaldada a nivel de laboratorio a travs de anlisis fsicos con la medicin de la firmeza (por medio de un penetrmetro) y el peso fresco (a travs de una balanza), ambos en el fruto entero; y qumicos, por medio de la medicin de los slidos solubles totales (uso de un refractmetro manual) y pH (uso de un pH metro 420A Orion), ambos en la pulpa del fruto. Tambin se determin el contenido de clorofila total (mtodo propuesto por Hiscox e Israelstam, 1979) en el epicarpio del fruto y contenido de carotenoides totales (mtodo propuesto por McCollum, 1953) medido en la pulpa del fruto. Se realizaron los anlisis bioqumicos con la determinacin y caracterizacin de cada una de las enzimas citadas para los estados de madurez ya establecidos. La determinacin de la actividad de la PME fue por el mtodo de Hagerman y Austin (1986), (investigar finalidad segn lo que le obtener la absorbancia) La evaluacin de la actividad de la poligalacturonasa se realiz por el mtodo de MacDonnell et al. (1945); se determin la prdida de viscosidad en comparacin al testigo. Para la obtencin del pH ptimo, se realizaron las mediciones de las actividades de las enzimas con sus mtodos respectivos, aunque se ajustaron las mezclas de reaccin a varios pH iniciales entre 2 a 8 para la PME, 3 a 9 para la PG y 4 a 8 para la celulasa En la obtencin de la temperatura ptima, la excepcin la constituy la temperatura de reaccin para cada enzima las cuales fueron entre 5 a 50C para las enzimas. En la determinacin de la estabilidad enzimtica al calor los diferentes extractos enzimticos se sometieron a temperaturas de 90 y 100C con intervalos de tiempos de 1, 3, 6 y 9 minutos segn el mtodo establecido. La investigacin se efectu bajo un diseo completamente aleatorizado, con tres repeticiones.

RESULTADOS Y DISCUSION

Los frutos de parchita maracuy tienden a perder peso hacia el estado sobremaduro; mientras que en los estados del verde al maduro se concentran los mayores valores de peso fresco. Estos frutos en el estado verde son muy firmes, perdindola a medida que el fruto pasa al estado de madurez, y sta se reduce progresivamente hasta el estado sobremaduro cuando los mismos se arrugan y resecan como consecuencia de la prdida de humedad; el contenido de slidos solubles totales se va incrementando gradualmente, obteniendo su pico en el estado maduro, para luego disminuir en el estado sobre maduro. Se observ un pH ms cido en el estado verde, que aumentaba ligeramente hacia el sobremaduro. El contenido de carotenoides totales se increment desde el estado verde hasta el maduro luego disminuy hacia el sobremaduro, en cambio el contenido de clorofila total disminuy notoriamente a medida que se avanz en el estado de madurez. Todos estos anlisis permitieron evidenciar la separacin entre cada uno de los estados tratados y proceder a determinar la actividad enzimtica para cada uno, caracterizndolas en aquellos en donde se encontr la mayor actividad.

COMO SE PUDO OBSERVAR SE OBTUVIERON RESULTADOS DE EL ESTADO DE MADUREZ VS CARACTERISTICAS DE IMPORTANCIA (Ph, brix, etc) respecto a ello se presentaran los siguientes graficos respecto a las enzimas de estudio.
Enzima Pectinmetilesterasa

Se pudo constatar que la actividad de la PME tiende a aumentar hacia el estado de madurez fisiolgica, para luego disminuir de forma gradual en los estados maduro y sobremaduro. Se dedujo que el estado de madurez fisiolgica es donde se concentra la mayor actividad de esta enzima para estos frutos incrementando as el ablandamiento. La cintica fue evaluada en el extracto crudo a diferentes concentraciones de sustrato (0.06; 0.12; 0.25; 0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 6.0; 8.0 y 10) mg/ml de pectina ctrica. La concentracin ptima de sustrato se ubic a los valores de 2.0 y 4.0 mg/ml de pectina ctrica. En todos los casos observados se evidencian de diferentes fuentes, sus valores estn muy por debajo del obtenido para el fruto de parchita; este hecho sugiere que la PME de este fruto presenta poca afinidad hacia el sustrato utilizado. En el ensayo para la temperatura ptima, se observ que la mayor actividad, segn tendencia se obtuvo a los 10 C; considerndose sta como la temperatura ptima (Figura 2) claro est, segn las medias hay un amplio rango de temperatura en las cuales la enzima ejerce su efecto, sin tener una disminucin total de la actividad.

El comportamiento presentado por la PME es de mayor actividad hacia pH cidos, ya que a pH de 3 fue donde se localiz la mxima actividad (Figura 3) y disminuy la actividad por encima y por debajo de ste. En la estabilidad al calor se verific, que si bien a los 90 y 100C se mantuvo la actividad (Figura 4), ya que no se presentaron diferencias entre los tiempos a una misma temperatura, tambin se tiene que, la enzima PME se present aparentemente estable a la temperatura de 90C y a los 100C se observ una disminucin en su accin en comparacin con la temperatura anterior. Varios ensayos tecnolgicos han sido utilizados para resolver el problema de la clarificacin de los jugos y stos se resumen en tratamiento trmico (105-115C) para inactivar la PME. Esta tecnologa puede ser usada para la estabilizacin de los jugos; sin embargo, debe tenerse mucho cuidado para evitar cambios en el sabor y aroma de los mismos como consecuencia de este tratamiento.
Enzima Poligalacturonasa

Se comprob que la actividad de la Poligalacturonasa (PG), mostr tendencia a incrementarse durante el proceso de maduracin (Figura 4), ocurriendo mayor porcentaje de prdida de viscosidad en el estado sobremaduro, por tanto es la fase de maduracin del fruto que ms sufre la accin de la PG. La cintica fue evaluada en el extracto crudo a diferentes concentraciones de sustrato (0.06; 0.2; 0.25; 0.5; 1.0; 2.0 y 4.0) mg/ml de cido poligalacturnico. La concentracin ptima se ubic a los 2.0 mg/ml de cido, esta result ser menor; indicando posiblemente ms afinidad hacia este sustrato.

La temperatura ptima para la PG fue de 30C, ya que hubo mayor disminucin de viscosidad en comparacin con las dems temperaturas (Figura 5), indicando una mayor actividad de esta enzima. La tendencia mostrada de la PG para el pH, fue con el aumento de la prdida de viscosidad desde pH cidos hasta acercarse a la neutralidad, es decir, desde 3 hasta 6. A pH 6 se encontr la mayor accin de esta enzima y por encima de ste, se observ una disminucin marcada de la actividad (Figura 6). En la estabilidad al calor, la PG present una leve disminucin en un tiempo de tres minutos a 90C, para luego estabilizarse; a esta temperatura no hubo inactivacin, pero se pudo notar que la accin de esta enzima es realmente baja (Figura 7). A los 100C, en nueve minutos, prcticamente se disminuy el efecto y se hizo menos estable en comparacin a los 90C. En

este caso, la presencia de actividad, si bien disminuida, incluso en tratamiento calrico a 100C por nueve minutos puede deberse a la presencia de isoenzimas y/o al tipo del fruto.
Enzima celulasa

Se realiz el procedimiento indicado en la metodologa para medir actividad de celulasa y en los tres experimentos que se realizaron no se encontr actividad detectable en ningn estado, por lo que se sugiere que si el fruto de parchita maracuy presenta actividad de esta enzima, entonces esta expresin ha de ser nfima. Hasta el momento, aparentemente no se tiene informacin sobre la celulasa en parchita maracuy, por esta razn no se procedi en su anlisis y caracterizacin.