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SELECCIN DE MICROORGANISMOS PARA PRODUCCIN DE VITAMINA B12

Romildo M. Sampaio, Ranulfo M. Alegre


Departamento de Engenharia de Alimentos - FEA - UNICAMP, Brasil

La fermentacin de vitamina B12 puede ser considerada un proceso industrial relativamente bien establecido, pero an necesita ser mejorado. De esta forma, la elaboracin de este trabajo fue motivada por la posibilidad de estudiar las condiciones ptimas de la fermentacin de vitamina B12. Se presentan adems, los resultados referentes a la evaluacin y optimizacin de las variables experimentales y la obtencin de parmetros cinticos de la fermentacin. Se estudiaron siete microorganismos, tres composiciones de medios de cultivo y dos tipos de substratos. Los resultados mostraron que Pseudomonas P3 y Propionibacterium jensenii tuvieron los mayores rendimientos de vitamina B12 (3,86 y 2,93 g B12/mL respectivamente) utilizando sacarosa como substrato. Palabras claves: vitamina B12, fermentacin, Propionibacterium, Pseudomonas. The key step in the great majority of studies of the B12 production is the selection of the microorganisms producers and a better understanding of the fermentation. In order to improve the vitamin B12 production, the purpose of this study was to investigate the influence of the different microorganisms producers and culture media in the vitamin production. The results showed that the higher yields - 3,86 and 2,93 g B12/mL- were achieved with Pseudomonas P3 and Propionibacterium jensenii cultivated using sucrose with main carbon source. Key words: vitamin B12, fermentation, Propionibacterium, Pseudomonas.

Introduccin
Las vitaminas son substancias orgnicas extremadamente necesarias para muchas formas de vida. Gran parte de los microorganismos vivos no pueden sintetizarlas y deben, de esta forma, obtenerlas de fuentes externas. La vitamina B12 fue descubierta como resultado de investigaciones sobre anemia megaloblstica. Su aislamiento se dio en 1948, pero su sntesis qumica completa slo fue obtenida en 1973. Sin embargo, debido al gran nmero de etapas involucradas, el procedimiento no alcanz inters industrial. Actualmente, la vitamina B12 es producida exclusivamente por va fermentativa. Segn Spalla et al. /1/, debido a sus implicaciones en reacciones qumicas importantes, la vitamina B12 origin gran inters y tiles aplicaciones en la salud, tanto de personas como de animales. La produccin mundial de vitamina B12 vara de 5 a 10 toneladas/ao, con un precio medio de $ 5 000/kg (USD) /2/. Brasil se ha tornado a un tradicional importador, con compras anuales del

orden de cinco millones de dlares (Trade Point de Campinas, So Paulo, 1997). La vitamina B12 pertenece a un grupo de molculas grandes y complejas, denominadas cobalto-corrinoides. Todos los cobaltocorrinoides cuyo ligante axial inferior de molcula es el 5,6 dimetilbenzimidazol son conocidos como cobalaminas. De la misma forma, si el ligante axial superior est constituido por un radical ciano, se obtiene la cianocobalamina o la verdadera vitamina B12. /3/ A medida que la investigacin de la vitamina B12 evolucion, se torn claro que la mejor fuente productora es representada por los microorganismos. Actualmente, ella es sintetizada por una gran variedad de bacterias, destacndose los gneros Pseudomonas , Propionibacterium y Corynebacterium. /1/ De acuerdo con Quesada-Chanto et al. /4/, Cummin y Johnson /5/ y Keuth y Bisping /6/, la uti-lizacin de Pseudomonas y Propionibacterium se ha justificado, debido al hecho de que esas bacterias y sus mutantes presentan ventajas, tales como el aumento intracelular del contenido de

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vitamina, alta productividad y un rpido crecimiento. El objetivo de este trabajo es estudiar las condiciones ptimas de produccin de vitamina B12. Para esto, fue efectuado un "screening" con bacterias del gnero Propionibacterium y Pseudomonas, as como una seleccin de la mejor fuente de substrato y de la mejor composicin del medio de cultivo.

Substrato
Se evaluaron dos azcares como principales fuentes de carbono: sacarosa y lactosa. La sacarosa provino de un azcar comercial que contena 99,8 % de pureza, mientras que la lactosa fue obtenida a partir de la ultrafiltracin del suero de queso en polvo reconstituido. El filtrado obtenido fue diluido a fin de obtenerse las concentraciones deseadas de lactosa. La ultrafiltracin del suero de queso se efectu en una unidad del tipo "Alfa-Laval-UFS 1", con una membrana "cutoff" de 10 000 Daltons.

Materiales y mtodos
Microorganismo
Se realiz un "screening" con cuatro lneas de bacterias, descritas en la literatura como buenas productoras de vitamina B12: Propionibacterium freudenreichii ATCC 9614, Propionibacterium jensenii DSM 20274, Propionibacterium shermanii ATCC 6207 y Pseudomonas sp. ATCC 13867. Los tres primeros cultivos fueron conservados en medio lquido a 4 C, mientras que la Pseudomonas sp. fue mantenida en un tubo inclinado, con 1,5 % de agar a 4 C.

Medios de cultivo
Se evaluaron tres composiciones de medios de cultivo, descritos como eficientes para el crecimiento de Propionibacterias y Pseudomonas. Cada medio fue evaluado usando sacarosa y lactosa como substrato. En esta etapa del trabajo, para el desarrollo de los experimentos se utiliz un diseo factorial completo. Los medios de cultivo empleados fueron los siguientes: Medio 1: Descrito por Florent /3/, usado para los experimentos con Pseudomonas sp. y sus mutantes. La composicin en (g/L) fue: substrato=100; extracto de l e v a d u r a = 2 ; ( N H 4) 2H P O 4= 5 ; MgSO 4 .7H 2 O=3; MnSO 4 .H 2 O=0,2; CoCl2.6H2O=0,02; ZnSO4.7H2O=0,02; Na2MoO4.2H2O=0,005; Betana=10; 5,6 DMI=0,025; pH 7,4; T=29 C, agitacin 300 r/min aireacin 1 VVM. Medio 2: Descrito por Quesada-Chanto et al. / 7/, usado para las fermentaciones con Propionibacterias. La compo- sicin en (g/L) fue: substrato=90, extracto de levadura=10; KH 2 PO 4 =2; MgSO4.7H2O=0,2; CoCl2.6H2O=0,02; FeSO4 .7H2 O=0,005; (NH4 )2HPO4=4; MnSO4.H2O=0,005; CaCl2.2H2O=0,02; 5,6 DMI=0,025; pH 6,8; T=29 C, agitacin 300 r/min, aireacin 0,5 VVM. Medio 3: Descrito por Florent y Nine /8/, usado para Propionibacterias. Su composicin en (g/L) fue: substrato=100; milosina=40; CoCl2.6H2O=0,02; 5,6

Obtencin de los mutantes


La bacteria Pseudomonas sp. fue sometida a un tratamiento qumico, usando concentraciones crecientes de 5,6 dimetilbenzimidazol (5,6 DMI), con el propsito de obtener mutantes que mostrasen mayores rendimientos de vitamina B12. Segn Garofano y Merli (apud. por Spalla et al. /1/ ), como solamente aquellos microorganismos que sintetizan vitamina B12 pueden metabolizar 5,6 DMI, es posible obtener mutantes de Pseudomonas sp. resistentes a altas concentraciones del mismo. Se hicieron experimentos usando concentraciones de 5,6 DMI variando desde 25 mg/L hasta 1 g/L. En cada experimento fueron observados cambios en relacin con la morfologa, crecimiento del microorganismo y la produccin de vitamina B12. Los mutantes obtenidos fueron aislados en placas de Petri y mantenidos en tubos de ensayo conteniendo el medio de cultivo apropiado y agar.

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DMI=0,025; pH 7,0; T=29 C, agitacin 300 r/min, aireacin 0,5 VVM.

biolgico descrito por AOAC /13/, basado en el crecimiento de un microorganismo evaluado Lactobacillus leishmanii ATCC 7830.

Fermentacin
Las fermentaciones fueron conducidas en frascos agitados (erlenmeyers de 1 000 mL), los cuales fueron adaptados para que se hiciera un control de la aireacin y del pH. En los experimentos que envolvieron Propionibacterias, que son microaeroflicas, los frascos fueron llenados con 800 mL del medio de cultivo, y las fermentaciones fueron conducidas bajo condiciones anaerbicas en las primeras 64 h y aerbicas en las 64 h siguientes. Este procedimiento fue descrito por Prez-Mendoza y Garca-Hernandez /9/. Cuando el microorganismo utilizado fue la Pseudomonas (aerbica), el erlenmeyer contena un volumen de 500 mL, con aireacin y agitacin eficientes, durante 120 h de fermentacin.

Resultados y discusin
Obtencin de los mutantes de Pseudomonas sp
Conforme fue descrito en el epgrafe tem 2.2., la bacteria Pseudomonas sp. fue sometida a un tratamiento qumico, con concentraciones crecientes de 5,6 DMI, con vistas a la obtencin de mutantes que produjeran mayores rendimientos de vitamina B12. Segn Spalla et al. /1/ como el 5,6 DMI es un nucletido importante en la biosntesis de la vitamina B12, y solamente aquellos microorganismos productores de la misma son capaces de metabolizarla, es posible obtener mutantes de microorganismos que necesiten del nucletido, pero no estn aptos para sintetizarlos, como es el caso de las Pseudomonas. Todos los mutantes aislados fueron evaluados con los dos tipos de substratos. Utilizando concentraciones de 5,6 DMI variando desde 25,0 mg/L hasta 1,0 g/L, fueron aislados tres mutantes, nombrados como Pseudomonas P1 , Pseudomonas P2 y Pseudomonas P3 , que mostraron caractersticas morfolgicas diferentes en relacin con la cultura original. Los tres mutantes fueron obtenidos cuando la concentracin de 5,6 DMI alcanz el valor de 800 mg/L, mientras que para la concentracin de 1,0 g/L no hubo crecimiento de los mismos. Los tres mutantes aislados mostraron mejoras significativas cuando los comparamos con el cultivo original. Los parmetros observados: rendimiento de vitamina B12, concentracin celular y consumo de substrato fueron mayores segn puede ser observado en la tabla 1. Adems, de acuerdo con la tabla 1, se observa que entre los mutantes el P3 present los mejores rendimientos, siendo la produccin de vitamina B12, en relacin con el cultivo original, aproximadamente 5 veces mayor cuando se utiliz sacarosa como substrato y 1,5 veces mayor cuando la lactosa fue utilizada. Tambin hubo una mayor eficiencia en el consumo del substrato, permitiendo mayores rendimientos celulares. Quesada-

Anlisis
La concentracin celular se determin al final de la fermentacin por densidad ptica. Dos alcuotas de igual volumen fueron extradas del medio de fermentacin, centrifugadas y lavadas. Posteriormente, una alcuota fue secada, mientras que la otra fue sometida a diluciones conocidas, a fin de relacionar la concentracin celular (g/L) vs absorbancia (610 nm). Ese procedimiento sigui la metodologa descrita por QuesadaChanto et al /7/. La determinacin de la vitamina B12 a partir del caldo de fermentacin fue hecha por el mtodo qumico descrito por Rudkin y Taylor /10/ y Fisher 11/, siguiendo la metodologa de extraccin descrita por Marwaha et al. /12/ y QuesadaChanto et al. /7/, basada en la complexacin y conversin de la cobalamina en cianocobalamina, en presencia de NaCN. Despus de la extraccin, la solucin final tuvo su absorbancia leda a 582 nm, contra una solucin patrn de cianocobalamina de 100 mg/mL. Cianocobalamina de la Sigma fue usada como patrn. Los resultados de la determinacin de la vitamina B12 por el mtodo qumico fueron peridicamente comparados con un mtodo micro-

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Tabla 1 Valores del rendimiento de la vitamina B12, concentracin celular y consumo de substrato, para Pseudomonas sp. y sus mutantes
Cultivo Pseudomonas Mutante P1 Mutante P2 Mutante P3 Pseudomonas Mutante P1 Mutante P2 Mutante P3 Substrato Sacarosa Sacarosa Sacarosa Sacarosa Lactosa Lactosa Lactosa Lactosa B12 (g/mL) 0,68 2,50 2,85 3,86 No Detectable No Detectable 0,95 1,40 Conc. celular (g/L) 2,40 3,30 2,65 6,06 1,80 1,93 1,70 1,49 Consumo substrato (%) 20,1 58,7 14,2 81,4 9,2 9,5 10,3 19,2

Chanto et al. /7/, tambin obtuvo mejores resultados cuando utiliz sacarosa como substrato para la produccin de vitamina B12.

Seleccin de los microorganismos


De acuerdo con los resultados descritos en el epgrafe 3.1, los experimentos para la obtencin de los mutantes permitieron seleccionar el microorganismo Pseudomonas P3 y la sacarosa como substrato, para las etapas posteriores del trabajo: anlisis y optimizacin de las variables experimentales y la obtencin de los parmetros cinticos. Adems de la Pseudomonas sp., tres bacterias ms, - Propionibacterium freudenreichii , P. jensenii y P. shermanii, fueron empleadas para la etapa de "screening". Cada una de ellas se evalu

usando dos composiciones de medio de cultivo (medio 2 y medio 3) y dos substratos (sacarosa y lactosa). La tabla 2 presenta los resultados obtenidos para las fermentaciones. Como se observa, los mejores rendimientos fueron obtenidos por el Propionibacterium jensenii, alcanzando un mximo de 2,93 g B12/mL de medio. Para esta corrida, el consumo de sacarosa fue de 16,8 % y la produccin celular de 4,78 g/L. El medio de composicin 2 y la sacarosa propiciaron los mejores rendimientos cuando se utiliz el Propionibacterium jensenii. Tal comportamiento no se repiti para el Propionibacterium freudenreichii y el P. shermanii, donde la lactosa y el medio 3 promovieron los mejores rendimientos de vitamina B12.

Tabla 2 Valores del rendimiento de vitamina B12, concentracin celular (X) y consumo de substrato, para Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii y P.shermanii
Cultivo P. jensenii P. freudenreichii P. shermanii P. jensenii P. freudenreichii P. shermanii P. jensenii P. freudenreichii P. shermanii P. jensenii P. freudenreichii P. shermanii Medio/Substrato 2 Sacarosa 2 Sacarosa 2 Sacarosa 2 Lactosa 2 Lactosa 2 Lactosa 3 Lactosa 3 Lactosa 3 Lactosa 3 Sacarosa 3 Sacarosa 3 Sacarosa B12 (g/mL) 2,93 1,78 0,83 2,02 2,08 1,43 1,72 2,14 1,38 1,98 1,29 0,97 Conc. celular (g/L) 4,78 1,08 0,56 1,72 4,51 2,39 1,30 5,57 2,43 1,84 1,60 0,79 Consumo substrato (%) 16,8 3,0 1,3 25,5 36,3 16,9 14,5 33,6 10,2 10,2 3,8 2,1

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Tabla 3 Valores de YX/S y B12/X para los mejores rendimientos de cada microorganismo
Cultivo Pseudomonas P3 Prop. jensenii Prop. Freudenreichii Prop. shermanii Medio/Substrato 1 Sacarosa 2 Sacarosa 3 Lactosa 2 Lactosa YX/S (g/g) 0,07 0,28 0,17 0,14 B12/X (mg B12/g cl.) 0,64 0,68 0,38 0,60

De acuerdo con la tabla 3, para los mayores rendimientos de vitamina B12 obtenidos con cada microorganismo, los valores del rendimiento celular, YX/S (0,07 a 0,25) no fueron elevados. QuesadaChanto et al. (1997) obtuvieron valores de YX/S de hasta 0,7; sin embargo, segn ellos, cuando se utilizan bajas tasas de aireacin se favorece la produccin intracelular de vitamina B12, disminuyendo la concentracin celular, y consecuentemente, el valor del rendimiento celular. Por otro lado, los valores obtenidos para el rendimiento B12/X (tabla 3), se situaron en el rango descrito en la literatura por algunos autores, que consiguieron valores de 0,4 a 1,12 mg B12/g clula seca para B12/ X (Quesada-Chanto et al. /4/, Marwaha et al. /12/ y Bainotti et al. /14/).

Conclusiones
Los resultados obtenidos nos permiten afirmar que de las siete lneas de bacterias estudiadas, la Pseudomonas P3 y el Propionibacterium jensenii mostraron los mayores rendimientos en trminos de vitamina B12. De la misma forma, la sacarosa pareci ser la fuente de substrato ms indicada para la continuidad de los trabajos, permitiendo la obtencin de mejores rendimientos de B12, concentracin celular y consumo de substrato, en comparacin con aqullos donde se utiliz la lactosa como fuente de substrato. En relacin con los medios de cultivo, los ms indicados fueron los de composicin 1 y 2 para Pseudomonas P3 y Propionibacterium jensenii, respectivamente.

Bibliografa
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