HEMOCULTIVO 1. INTRODUCCIN A pesar de la disponibilidad de nuevos antibiticos, se estima que en los Estados Unidos ocurren alrededor de 200.

000 casos de septicemia al ao con un 20 a 50% de mortalidad La infeccin del torrente sanguneo o bacteriemia, constituye un cuadro clnico grave con una incidencia en Chile de 1,8 /1000 egresos hospitalarios. Sin embargo existe un porcentaje de sub-notificacin importante. Actualmente no se la considera una enfermedad de notificacin obligatoria. El hemocultivo o cultivo microbiolgico de la sangre constituye en los casos de septicemia, el nico examen que permite su confirmacin. Se define como hemocultivo al cultivo microbiolgico de una muestra de sangre obtenida por una puncin independiente. En el ltimo tiempo han ocurrido varios cambios, tales como el aumento del nmero de pacientes inmunocomprometidos, la necesidad de aislar microorganismos no habituales y el advenimiento de sistemas automatizados para los hemocultivos. Es por ello que es importante revisar algunos aspectos como: Indicacin de los hemocultivos, clasificacin de estos, toma de la muestra (momento de la obtencin, nmero de hemocultivos, volumen de sangre), diferenciacin de bacteriemia versus contaminacin, sangre por catter versus puncin perifrica, utilidad de los hemocultivos anaerbicos, utilidad de los hemocultivos con resinas, microorganismos especiales, sistemas de hemocultivos e impacto de la automatizacin e interpretacin de los resultados obtenidos.

2. OBJETIVOS.

La bacteriemia es la expresin ms neta y clara de la infeccin bacteriana, y no hay que olvidar que las bacterias son causa del mayor nmero de infecciones que pueden ser tratadas y curadas. Por tanto, una de las tcnicas ms tiles en un laboratorio de microbiologa clnica es la realizacin de un hemocultivo para la deteccin de dicha bacteriemia. 3. METODOLOGIA Y MATERIALES MTODO DE OBTENCIN DE LA MUESTRA

La muestra debe obtenerse por puncin perifrica (venosa o arterial), siempre por una nueva puncin y debe ser la primera muestra que debe obtenerse si existe indicacin de otros exmenes. La muestra obtenida por catter venoso central en una muestra inadecuada, ya que estudios de microscopa electrnica han revelado que el 100% de los catteres se colonizan con microorganismos de la piel a las 48 horas de instalados . Por esto, la recuperacin de microorganismos en el hemocultivo obtenido a travs del catter puede corresponder al arrastre de las bacterias que estn colonizando la superficie interna ms que a la presencia de bacterias en el torrente sanguneo, con un aumento de los falsos positivos de 1,7 a 3,8%. PREPARACIN DE LA PIEL

Este aspecto es esencial si se quiere evitar la contaminacin de los hemocultivos, ya que en la actualidad con los sistemas automatizados de hemocultivos que evitan la manipulacin de los mismos, prcticamente no existe la posibilidad de que los hemocultivos se contaminen en el laboratorio. Despus de la palpacin de la vena, la piel debe ser lavada con povidona yodada, lavador quirrgico, con gluconato de clorhexidina al 2-4% o con agua y jabn. La desinfeccin de la piel se realiza con povidona yodada, tintura de yodo o con clorhexidina alcohlica, segn lo que se haya utilizado como lavador, aplicado en forma excntrica desde el sitio de puncin elegido. Se debe esperar que el antisptico se seque para que ejerza su accin residual . Si se utiliza tintura de yodo, se debe retirar completamente con agua para evitar quemaduras. Siempre la puncin debe ser efectuada con guantes, que deben ser estriles cuando se requiere nuevamente la palpacin de la vena. VOLUMEN DE LA MUESTRA

Se considera actualmente una de las variables ms crticas en el aumento de la positividad de los hemocultivos. Dado que la mayora de las bacteriemias son de baja magnitud (< 1 a 10 ufc/ml) a mayor volumen de muestra obtenido, mayor es la sensibilidad del hemocultivo. Se sabe que por cada ml adicional de muestra que se inocule en la botella aumenta la positividad entre un 2 a 5%. Recientemente, en un

estudio pareado, Mermel y Maki demostraron una disminucin significativa (p<0.001) de la positividad de los hemocultivos cuando se obtenan en promedio 2,7 ml (69%) versus 8,7 ml ( 92%). Por esto es que las recomendaciones son obtener el mximo de volumen que la botella sea capaz de tolerar manteniendo la relacin 1:5 a 1:10 entre la muestra y el volumen de medio de cultivo, esta dilucin permite neutralizar las propiedades bactericidas de la sangre y de los agentes antibacterianos que puedan estar presentes en la muestra. Para la gran mayora de los sistemas automatizados este volumen es de 10 ml para adultos y es variable para los nios segn la edad: 1 a 2 ml para recin nacidos, 2 a 3 ml para lactantes de 1 mes a 2 aos, 3 a 5 ml para nios mayores de 2 aos y 10 ml para adolescentes. INOCULACIN DE LAS BOTELLAS

En el caso de los sistemas automatizados, se debe descontaminar el tapn de goma antes de puncionar la botella con alcohol y esperar que se seque, ya que el fabricante no garantiza la esterilidad de ste. Existen controversias respecto al cambio de aguja antes de inocular la muestra en la botella, sin embargo un meta-anlisis reciente demuestra que el cambio de aguja disminuye el porcentaje de contaminacin . En el caso de los sistemas manuales que no son sellados, se debe destapar el frasco para inocular la muestra. Este procedimiento tiene riesgo de contaminacin por lo que se debe tener mxima precaucin en no tocar las paredes exteriores de la botella con la aguja. OBTENCIN DE LA MUESTRA DE SANGRE.

Se considera ideal para el diagnstico de cualquier bacteriemia la realizacin de 3 hemocultivos (3 extracciones de sangre para inocular en dos frascos con medio de cultivo cada una de ellas) tomados con un intervalo de tiempo mnimo de 15 minutos entre ellos, y utilizando lugares de venopuncin diferentes por cada extraccin. Hay que tener en cuenta que la extraccin de la sangre debe realizarse en condiciones de asepsia para evitar contaminar la muestra con la microbiota que coloniza la piel del paciente o de la persona que realiza la extraccin. Por este motivo, antes de realizar la extraccin de la sangre se debe pintar ampliamente con povidona iodada la piel prxima a la zona a pinchar, as como los dedos ndice, medio y pulgar de la mano utilizada para la palpacin de la vena y la parte superior de los frascos con el medio de cultivo por donde se va a inocular la sangre. En cuanto al volumen de sangre necesario para la deteccin de la bacteriemia, se considera adecuada la cifra de 1020 mL de sangre por extraccin (510 mL por frasco) en adultos y 2 mL en nios pequeos (1 mL por frasco). La sangre se inocula en los frascos que se incuban inmediatamente en estufa a 37 C hasta 7 das. ANLISIS MICROBIOLGICO PRELIMINAR.

Los frascos de hemocultivo deben vigilarse diariamente y observar si existe crecimiento. La observacin macroscpica puede indicar la presencia de crecimiento si aparece hemolisis, turbidez, sedimento o produccin de gas. A partir de los frascos que presentan evidencia de crecimiento despus de la incubacin se les debe realizar una tincin de Gram y un subcultivo en diferentes medios y atmsferas de incubacin, que permitan el crecimiento de bacterias tanto aerobias como anaerobias. HEMOCULTIVOS PARA MICROORGANISMOS ESPECIALES

Micobacterias En general Mycobacterium tuberculosis cursa con cortos perodos de bacilemia an en pacientes con SIDA por lo que su recuperacin a partir de una muestra de sangre es menos frecuente que M. avium- intracelullare y otras micobacterias no tuberculosas. El mtodo de lisis-centrifugacin ha sido el mtodo ms ampliamente utilizado, ya que las micobacterias son microorganismos intracelulares y la lisis celular permite la liberacin de las micobacterias lo que favorece su desarrollo, sin embargo es un mtodo laborioso que requiere manipulacin de la muestra y resiembra en medios para micobacterias. En BACTEC 13A radiomtrico (Becton Dickinson) se puede inocular la muestra directamente en la botella del hemocultivo sin un procesamiento previo. El tiempo de deteccin depende de la concentracin de Mycobacterium en la sangre y de la especie de Mycobacterium que produce la infeccin. La reciente introduccin de botellas para sangre en el sistema BACTECMYCO/F Lytic (Becton Dickinson) ha mostrado resultados comparables con los de lisis-centrifugacin. Hongos Las fungemias constituyen una infeccin cada vez ms frecuente principalmente en pacientes inmunosuprimidos. En la actualidad el mtodo de eleccin es el de lisis-centrifugacin que recupera levaduras y hongos dimrficos. Sin embargo las levaduras tambin se recuperan a partir de sistemas automatizados de hemocultivos, pero requieren subcultivo en medios adecuados y una incubacin prolongada. Brucella spp. Los sistemas automatizados disponibles en la actualidad permiten una buena recuperacin de Brucella. Tambin lisis-centrifugacin es un mtodo de eleccin que recupera Brucella mejor que el tradicional mtodo de Castaeda. Es necesario en los casos en que existe la sospecha clnica de Brucella, que la muestra se incube ms de 7 das y en el caso de los sistemas automatizados, se recomienda el subcultivo ciego terminal a los 7 y 14 das.

Campylobacter spp. Se recupera bien a partir de los sistemas automatizados y por lisis-centrifugacin, sin embargo el subcultivo debe ser en medios suplementados para lograr el aislamiento del microorganismo e incubados a la temperatura y atmsfera que requiere esta bacteria fastidiosa. Legionella spp. Hay pocos casos descritos de bacteremia por Legionella. En sistemas automatizados se requieren los subcultivos terminales ciegos en medios de cultivos suplementados. HACEK El trmino HACEK es un acrnimo para un grupo de bacilos gram negativos fastidiosos que incluyen a Haemophilus aphrophilus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens y Kingella kingae. Estas bacterias se recuperan en hemocultivos de pacientes con endocarditis infecciosa, aunque pueden aislarse a partir de otros focos infecciosos. Las recomendaciones para los hemocultivos en que exista la sospecha clnica de infeccin por HACEK son: Mantener la incubacin inicial por 7 a 14 das y efectuar subcultivo terminal a los 7 y 14 das. Bartonella henselae Agente etiolgico de la angiomatosis bacilar en pacientes con SIDA y de la enfermedad por araazo de gato. El mtodo recomendado para su aislamiento en sangre es el de lisis-centrifugacin con cultivo del sedimento en agar sangre de cordero con atmsfera de 5 % de CO2 por un perodo de incubacin de al menos 7 das 3.1 MATERIALES Un frasco de hemocultivo previamente inoculado e incubado a 37 C. Jeringuillas con aguja. Colorantes para la tincin de Gram. Portaobjetos. Una placa con medio de agarsangre. Una placa con medio de agarchocolate. TCNICA. 1ER DA

1. Homogeneizar bien el frasco del hemocultivo mediante inversiones del mismo. 2. Utilizando la jeringuilla realizar una extraccin del hemocultivo aparentemente positivo e inocular primero una placa de agar sangre y otra de agar chocolate con 2 3 gotas cada una, y posteriormente extender otras 2 3 gotas en un porta para realizar una tincin de Gram. 3. Extender el inculo en las placas de agar sangre y agar chocolate con el asa estril, para obtener colonias aisladas. 4. Incubar a 36 C en atmsfera de CO2 (jarra con vela). 5. Dejar secar la extensin al aire y posteriormente fijar al calor suavemente. 6. Realizar la tincin de Gram. 4. RESULTADOS 1. Anotar los resultados de la observacin macroscpica del hemocultivo. 2. Indicar el resultado de la tincin de Gram: 2 DA 1. Observar el crecimiento en las placas de agar sangre y agar chocolate. Anotar si es positivo en ambas y el aspecto de las colonias: tamao, brillo, mucosidad, hemolisis en agar sangre. 2. Hacer una tincin de Gram de una colonia representativa de cada placa y compararla con la de la vspera: 3. Dependiendo del resultado, proceder como sigue: Cocos Grampositivos en cadenas: El resultado negativo en la prueba de la catalasa permite sospechar que se trata de Streptococcus o Enterococcus. Inocular un tubo de bilisesculina, para investigar si se trata de Enterococcus, y una placa de agar sangre, colocando discos de bacitracina (si es hemoltico) y optoquina (si es hemoltico), para investigar especies de Streptococcus Cocos Grampositivos en racimos: El resultado positivo en la prueba de la catalasa permite sospechar que se trata de Staphylococcus o de Micrococcus (procedente de una contaminacin de la piel al tomar la muestra). Sembrar un tubo de Kligler en superficie y picadura para distinguir el metabolismo fermentativo de Staphylococcus del oxidativo de Micrococcus. Bacilos Gramnegativos: Si se sospecha la presencia de Haemophilus, por la tincin de Gram y la ausencia de crecimiento en agar sangre, sembrar una placa de agar Mueller Hinton y ensayar factores V y X. En otros casos, sembrar un tubo de Kligler en superficie y picadura, para distinguir si se trata de bacilos no fermentadores (por ejemplo, Pseudomonas, Alcaligenes o Acinetobacter), o de enterobacterias (fermentacin de

glucosa positiva). Bacilos Grampositivos no esporulados: Hacer la prueba de la catalasa y sembrar las pruebas de hidrlisis de esculina, movilidad y CAMP

RESULTADOS PREINFORME Informar de inmediato al mdico si se observan bacterias al Gram, indicando: cantidad, morfologa y agrupacin. Si dispone de sistemas automatizado, informe las horas transcurridas hasta la positividad. INFORME DEFINITIVO Indicar el perodo de incubacin durante el cual no se observ desarrollo cuando se emite un informe negativo. Para un hemocultivo positivo informar el microorganismo identificado con su respectiva susceptibilidad a antimicrobianos cuando corresponda. Se debe notificar al clnico todos los resultados, incluidos los presuntos contaminantes. ENVO AL LABORATORIO DE REFERENCIA Enviar al Laboratorio de Referencia del Instituto de Salud Pblica en caso de aislamiento de bacterias como: Salmonella spp., Brucella, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae provenientes de cuadros invasores, Haemophilus influenzae, Leptospira ( solo muestras de suero), para confirmacin y vigilancia epidemiolgica de acuerdo a lo indicado en el reglamento N 712 sobre notificacin de enfermedades transmisibles.