Tcnicas de diagnostico 1.

PCR(Polymerase Chain Reaction= Reaccin en Cadena de la Polimerasa) Es una tcnica que nos permite amplificar selectivamente un segmento especfico de DNA, hasta obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulacin Fundamento: Replicacin del ADN Complementariedad de bases Estrategia Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y renaturalizar las hebras de ADN complementario Pasos: Desnaturalizacin: 94-96 C Alineacin: Temperatura variable Extensin: 68-72 C

AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES MEDIANTE UNA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Una nueva tcnica, llamada Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) ., para incrementar el nmero de molculas de DNA blanco en las muestras. La PCR es , una amplificacin de secuencias especficas del DNA. Se basa en la utilizacin de secuencias cortas de nucletidos sintticos llamados primers o cebadores, que se hibridan de forma especifica con cada una de las cadenas de DNA , previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reaccin tenga lugar se usa una enzima, Taq pol (ADN Polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucletidos trifosfatos. La funcin natural de la DNA polimerasa consiste en reparar y replicar el DNA Se realiza una serie repetida de ciclos cada uno compuesto por 3 pasos bsicos: a. Desnaturalizacin del ADN doble cadena por la elevada temperatura (95C). b. Acoplamiento de los primers, desciende la temperatura (entre 55C-72C). c. Elongacin del primers, aqu se eleva la temperatura a 72C permitiendo la incorporacin de los deoxinucletidos. Mientras tanto se van deplecionando los primers y los deoxinucletidos, y se van sintetizando nuevas cadenas de DNA. Al final se consiguen miles de copias de DNA del fragmento de DNA limitado por los "primers ". Los fragmentos de DNA as obtenidos se pueden identificar por varias tcnicas: visualizacin en geles de agarosa o poliacrilamida mediante tincin con bromuro de etidio y examen con luz ultravioleta, o hibridacin con una sonda marcada. La combinacin de la PCR y las sondas de cidos nucleicos marcadas promete ser el mtodo ms sensible para la deteccin e identificacin de los virus. 2. Southern Blot Es una tcnica que permite detectar por hibridacin la presencia de una porcin de ADN en la muestra Fundamento: Complementariedad de bases Estrategia: Se disea una sonda con nucletidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado. El sector de ADN buscado puede ser un gen o parte del mismo. Se puede utilizar en el diagnostico molecular de patologas genticas Pasos:

Extraccin de ADN Fragmentar el ADN en porciones ms pequeas Separo los fragmentos utilizando una corrida electrofortica usando como sustrato de migracin a un gel Desnaturalizacin con solucin alcalina Hibridacin: o Se agrega la sonda sobre la membrana y se incuba o Se lava para quitar el mximo de hibridaciones inespecficas o Se revela por autoradiografa