REBIOL. Vol. 29, N 1: enero - junio, 2009 Organo oficial de la Facultad de Ciencias Biolgicas. Universidad Nacional de Trujillo.

Trujillo-Per

Artculo original

Actividad entomopatgena de cuatro especies de hongos sobre Prodiplosis longifila (Dptera: Cecidomyiidae)
Entomophathogenic activity of four fungi species on Prodiplosis longifila (Diptera: Cecidomyiidae)
Filver Retegui Ch1, Juan Wilson Krugg2, Gaspar Ayquipa Aycho3 y Socorro Neyra Paredes4.
1 Exalumno de la Escuela AP de Microbiologa y Parasitologa, 2Departamento de Microbiologa y Parasitologa, 3Departamento de Ciencias Biolgicas, 4aExlumna de la Escuela AP de Ciencias Biolgicas. Universidad Nacional de Trujillo

RESUMEN
Se determin la capacidad entomopatgena de los hongos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus, Verticillium lecanii, sobre la emergencia del dptero Prodiplosis longifila en condiciones de laboratorio. El experimento se realiz empleando 10 pre pupas como unidad experimental del insecto, con cuatro tratamientos ms un testigo y cuatro repeticiones, las mismas que fueron colocadas en placas Petri conteniendo arena estril hmeda, inoculndose por aspersin con una suspensin de 109 esporas/mL de cada especie de hongo, paralelamente se asperj al testigo agua destilada estril, incubndose todos los tratamientos por 10 das a 27oC y 69% de HR. En invernadero se usaron 15 brotes de esprrago utilizando los mismos tratamientos con tres repeticiones, colocndose alrededor de cada brote 100 pre pupas de P. longifila, a los que se inocularon, por aspersin con los 5 tratamientos, aislando a cada brote en una jaula de madera, mantenindose as durante 10 das a 30.2oC y 52.5% de HR. El porcentaje de mortalidad de prepupas y pupas se determin mediante la frmula de Abbot, encontrndose 75 y 69%, 71 y 73%, 62 y 50%, 59 y 44% ocasionado por M. anisopliae, B. bassiana, P. fumosoroseus y V. lecanii en condiciones de laboratorio e invernadero respectivamente. Palabras clave: Actividad entomopatgena, Beauveria bassiana, Metarrizhium anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus, Verticillium lecanii Prodiplosis longifila.

___ ABSTRACT
In the laboratory was carried out being employed 10 pre pupas as experimental unit of Prodiplosis longifila Gagn, with 4 processing more a witness and 4 repetitions, the same that were placed in plates Petri containing humid sterile sand, being inoculated for sprinkling with a suspension of 10 9 spores/ml of Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus, Verticillium lecanii and parallel al witness was sprinkled sterile water distilled, being incubated to all the for 10 days to 27oC and 69% of HR, with the purpose to evalue the enthomophatogenic capacity of fungi species. In greenhouse 15 bud of asparagus utilizing were utilized the same processing with 3 repetitions, being placed around each bud 100 pre pupas of P. longifila, to the ones that they were inoculated, by sprinkling with the 5 processing, separating to each bud with a cage of wood and being maintained for 10 days to 30,2oC and 52,5% of HR. The percentage of mortality of prepupas and pupas the

formula was determined by means of of Abbot, being found 75 and 69%, 71 and 73%, 62 and 50%, 59 and 44% caused by M. anisopliae, B. bassiana, P. fumosoroseus and V. lecanii in conditions of laboratory and greenhouse respectively. Key words: Entomopatogenic activity, Beauveria bassiana, Metarrizhium anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus, Verticillium lecanii, Prodiplosis longifila.

INTRODUCCIN Entre 1878 y 1879 el control microbiano de insectos marc importancia con el trabajo en control de larvas del lepidptero Anisoplia austriaca con el hongo Metarhizium anisopliae realizado por Metchnikoof1.8. En Per, el primer informe de la presencia del hongo B. bassiana fue realizado en 1971 al determinarse que era el agente causal de una epizootia en larvas de Diatraea saccharalis y puparios de Paratheresia claripalpis2. Los principales hongos para el Manejo Integrado de insectos plaga pertenecen a la clase Deuteromycetes (Verticillium, Paecilomyces, Beauveria y Metarhizium). Las esporas de estos hongos atacan la cutcula externa y el intestino de los insectos huspedes, germinan dando lugar a las hifas que penetran al hemocele, pudiendo causar la muerte del insecto por la produccin de una toxina que debilita el sistema inmunolgico del hospedero o por la utilizacin directa de fluidos del cuerpo del insecto, producindose en este ltimo caso un extenso desarrollo de hifas externas, para que una vez utilizadas las reservas del organismo del insecto, ste muera por falta de alimento y el hongo termine esporulando gran cantidad de conidias5,6. Prodiplosis longifila Gagn mosquilla del brote es un dptero pequeo de color negro amarillento de aproximadamente 1,5 mm de longitud. Los huevos son alargados, ligeramente curvados con sus extremos ovalados de superficie lisa y las larvas de tipo vermiforme. El tercer estadio larval se transforma en pre pupa, tornndose de color anaranjado para luego saltar al suelo donde forma un cocn ovoide constituido con hilos de seda y cubierto de piedrecillas de arena9. La incidencia de esta plaga ha sido ocasionada por el indiscriminado uso de insecticidas orgnicos que han causado la destruccin de los enemigos biolgicos y la aparicin de resistencia en las poblaciones sobrevivientes3. Por la importancia econmica de P. longifila en estos ltimos aos en el cultivo de esprrago y considerando que actualmente el control qumico de la plaga ha ocasionado un desequilibrio biolgico con la aparicin de otras en el ecosistema esparraguero, y teniendo en consideracin la tendencia del uso de mtodos biolgicos para controlar las poblaciones de la plaga, el presente trabajo tuvo como objetivo conocer la actividad entomopatgena de Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus, Verticillium lecanii sobre la emergencia de las formas adultas de Prodiplosis longifila en condiciones de laboratorio e invernadero. MATERIAL Y MTODOS El trabajo se realiz en el Laboratorio de Fitopatologa del Departamento de Microbiologa y Parasitologa, Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de Trujillo y en el fundo MORAVA, Alto Moche, provincia de Trujillo. Material biolgico utilizado Se emplearon cultivos puros de Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus y Verticillium lecanii, adquiridos en el Programa Nacional de Control Biolgico, Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA) y pre pupas de Prodiplosis longifila colectados en el fundo MORAVA. Aplicacin de los hongos en condiciones de laboratorio Propagacin y estandarizacin del pre inculo Cultivos puros de los 4 hongos fueron resembrados en frascos de Roux conteniendo Agar Papa Dextrosa, inmediatamente despus se ajust a pH 5,6 0.2, luego se incub a temperatura ambiente durante 7 das, posteriormente se agreg solucin de Tween 80 al 0,1% obtenindose suspensiones de esporas que fueron recibidas en matraces estriles.

Posteriormente, se hizo un recuento de la cantidad de esporas/mL en una cmara de Neubauer y se estandarizaron las suspensiones a una concentracin de 109 esporas/mL, como testigo se emple agua destilada estril (ADE) con un pH de 6,8. Aplicacin del inculo (Bioensayo) Del campo de cultivo se colectaron en vasos descartables brotes de esprrago infestados con larvas de P. longifila, luego se colectaron las pre pupas en el momento en que stas saltaban de los brotes. Se emplearon 40 pre pupas de P. longifila divididos en 4 grupos de 10 cada uno colocndose cada grupo en una placa de Petri conteniendo arena estril hmeda; luego estos ejemplares fueron inoculados por aspersin con la suspensin testigo (ADE), luego se incub a 27oC y 69% HR por 10 das. Paralelamente se hizo lo mismo con las suspensiones de esporas de B. bassiana, M. anisopliae, P. fumosoroseus y V. lecanii a una concentracin de 109 esporas/mL. Aplicacin de los hongos en condiciones de invernadero En un rea de 40 m2 se sembraron coronas de esprrago las cuales fueron regadas por goteo; posteriormente, se construyeron 15 jaulas de madera de 40x40x80 cm forradas con poliseda blanco, excepto una cara lateral la cual fue forrada con plstico blanco y untada con aceite para poder evaluar la poblacin de adultos que emergieron de las pre pupas que no fueron afectadas por los hongos. Se pes 400 g de arroz en una bolsa de polipropileno de 16x11 cm x 2 micras, luego se agreg 100 mL de agua destilada y se grap. Posteriormente se esteriliz en autoclave a 121 oC y 15 Ib de presin x 30 min, se dej enfriar y se adicion 30 mL de una suspensin de esporas. Se dej incubar por 15 das, despus se realiz un control de calidad contndose en la cmara de Neubauer 109 esporas/g. A 50 g del sustrato (109 esporas/g) se agreg 10 mL de aceite agrcola, se removi la bolsa para soltar las conidias, luego se adicion 1 L de agua y se agit. Posteriormente se verti el contenido en un colador colocado sobre un balde, obtenindose una suspensin del hongo listo para su aplicacin. En invernadero se seleccionaron 15 brotes de esprrago para los 5 tratamientos (B. bassiana, M. anisopliae, P. fumosoroseus, V. lecanii y el testigo), cada uno con 3 repeticiones. Luego se coloc un plstico debajo de cada brote, a nivel del suelo, agregndose encima arena fina para facilitar el conteo de pre pupas y pupas. Posteriormente, se colocaron 100 pre pupas en el suelo circundante a cada brote para luego ser inoculadas por aspersin con el preparado de hongos a una concentracin de 109 esporas/mL, como testigo se utiliz solamente agua. Finalmente, se cubri a cada brote con la jaula de madera por un perodo de 10 das. Evaluacin de la actividad entomopatgena Se procedi a reaislar el hongo patgeno, tanto del experimento en laboratorio como del invernadero, desinfectando las pre pupas en hipoclorito de sodio al 2%, enjuagndose 3 veces con agua destilada estril, luego se coloc en una cmara hmeda. Posteriormente, se verific observando la muestra al microscopio para saber si se trataba del mismo que se utiliz como inculo causante de la muerte del insecto por la accin entomopatgena del hongo. Determinacin del porcentaje de mortalidad Se emple un diseo completamente randomizado (DCR) utilizando la frmula de Abbot, los promedios del porcentaje de mortalidad fueron analizados mediante el anlisis de varianza (ANAVA) con un nivel de confianza del 95% complementndose con la prueba de la Mnima Diferencia Significativa (MDS). RESULTADOS Y DISCUSIN Los porcentajes de mortalidad de pre pupas y pupas de Prodiplosis longifila en condiciones de laboratorio de 27oC 0,5 y 69 % de HR, durante 10 das, fueron 75,00; 71,88; 62,50; 59,38 % para Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosororeus y Verticillium lecanii respectivamente (Fig. 1).

Al observar los porcentajes de mortalidad de las pre pupas y pupas de P. longifila en condiciones de laboratorio se observan diferencias, siendo M. anisopliae el que presenta una mejor actividad tanto enzimtica como txica, tal como menciona para el caso de la larva del lepidptero Palaemontes pugio7.
Fig. 1. Porcentaje de mortalidad de 4 hongos entomopatgenos sobre pre pupas y pupas de Prodiplosis longifila en laboratorio a 27 0.5 C y 69 1.0% de HR durante 10 das.
80 70 60

73.68

69.23

% de Mortalidad

50.20 44.37

50 40 30 20 10 0 B. bassiana M. anisopliae P.

V. lecanii

Hongos Entomopatgenos fumosoroseus

Fig. 2. Porcentaje de mortalidad de 4 hongos entomopatgenos sobre pre pupas y pupas de Prodiplosis longifila en invernadero a 30.2 2.0C y 52.5 3.5% de HR durante 10 das.

80 71.88 70

75.00

62.50 59.38 60

% de Mortalidad

50 40 30 20 10 0 B. bassiana M. anisopliae P. fumosoroseus V. lecanii

Hongos Entomopatgenos

Asimismo, la actividad entomopatgena de los 4 hongos sobre las pre pupas y pupas de P. longifila, se deben a las diferentes etapas o mecanismos de accin que ejercen estos hongos sobre sus hospederos, tales como la adhesin o mecanismos de contacto, la penetracin de la cutcula, as como la produccin de metabolitos secundarios o toxinas; por lo tanto, la eficiencia o no de estos mecanismos pueden alterar la patogenicidad de estos hongos. Con respecto al mecanismo de penetracin, este se lleva a cabo mediante dos procesos, uno fsico y otro qumico, por accin de enzimas producidas (proteasa, quitinasas y lipasas) principalmente la N acetilglucosaminasa1. Por lo tanto, probablemente existe un estmulo determinado para esta penetracin, el cual puede ser diferente o no, segn el

hospedante y el patgeno, presentando B. bassiana, P. fumosoroseus y V. lecanii un paquete enzimtico que podra ser insuficiente lo que influira en su patogenicidad. La patogenicidad del hongo sobre los insectos depende adems de una compleja relacin entre la agresividad del hongo para entrar en la cutcula y la fortaleza del sistema inmunolgico del insecto para prevenir el desarrollo del hongo; esto puede ser influenciado por la eficacia de los hemocitos en encapsular y melanizar al patgeno evitando su germinacin4. Por consiguiente, la accin fagocitaria de los hemocitos puede haber sido evitada por metabolitos secundarios producidos por stos hongos, obtenindose quizs una mejor eficacia de una toxina secretada por M. anisopliae (dextruina E) que paraliza los hemocitos, facilitando la germinacin de la espora y penetracin e invasin de las hifas que causan una mayor mortalidad. Los porcentajes de mortalidad de pre pupas y pupas en condiciones de invernadero de 30,2 oC 2,0 y 52,5 % de HR, durante 10 das, fueron 73,68; 69,23; 50,20 y 44,37 %, para B. bassiana, M. anisopliae, P. fumaroseus y V. lecanii respectivamente (Fig. 2). El hongo B. bassiana present mayor porcentaje de mortalidad de pre pupas y pupas bajo condiciones de invernadero (Fig. 2). Al respecto, se ha reportado estudios sobre la actividad entomopatgena de 2 cepas de B. bassiana, 4 de Paecilomyces sp. y 2 de V. lecanii sobre ninfas de Trialeurodes vaporariorum en 2 ensayos, la primera considerando una humedad relativa de 95% y temperatura constante de 26,9 0,5oC y la otra con humedades de 58, 76 y 49,9% y con temperatura de 27,8 1,0oC, encontrando que a la HR mas baja (49,9%) fueron ms efectivos los hongos V. lecanii cepa V2 con 74% de mortalidad y Paecilomyces cepa PG con 63%; mientras que en una HR alta (95%) todas las cepas de estos hongos manifestaron ms del 65% de mortalidad a ninfas de T. vaporariorum, concluyendo que la HR fue el factor que ms influy sobre la patogenicidad4. En las Tablas 1 y 2 se observan las poblaciones estadsticas de los 4 hongos estudiados a nivel de laboratorio e invernadero respectivamente, segn el anlisis estadstico de Mnima Diferencia Significativa (MDS). En la Tabla 1 se muestra que todos los hongos pertenecen a una misma poblacin estadstica, debido probablemente que las condiciones ambientales y de manipuleo a nivel de laboratorio son ms homogneas, producto del cual no existen diferencias significativas. En la Tabla 2 los hongos B. bassiana y M. anisopliae pertenecen a una poblacin, es decir, ambos hongos estadsticamente tienen igual actividad entomopatgena, por consiguiente es lo mismo trabajar con cualquiera de ellos; sin embargo se recomienda utilizar aquel que posea un mayor porcentaje de mortalidad. Mientras, que P. fumosoroseus y V. lecanii constituyen otra poblacin estadstica que presentan el menor porcentaje de mortalidad. Sin embargo, se observan diferencias significativas entre las dos poblaciones de hongos estudiados, debido probablemente a factores externos que influyeron en su patogenicidad como temperatura, humedad, fertilizacin del suelo entre otros.
Tabla 1. Anlisis de Mnima Diferencia Significativa (MDS) del porcentaje de mortalidad de 4 hongos entomopatgenos sobre pre pupas y pupas de Prodiplosis longifila en laboratorio.
Poblacin estadstica Hongos entomopatgenos Beauveria bassiana Metarhizium anisopliae Paecilomyces fumosoroseus Verticilium lecanii

Nivel de confianza: 95 %; Error: 5 %

Tabla 2. Anlisis de Mnima Diferencia Significativa (MDS) del porcentaje de mortalidad de 4 hongos entomopatgenos sobre pre pupas y pupas de Prodiplosis longifila en invernadero.

Poblacin estadstica

Hongos entomopatgenos Beauveria bassiana Metarhizium anisopliae Paecilomyces fumosoroseus Verticilium lecanii

1 2

Nivel de confianza: 95 %; Error: 5 %

CONCLUSIONES Los mayores porcentajes de mortalidad en pre pupas y pupas de Prodiplosis longifila lo presentaron Metarhizium anisopliae con 75,00 y 69,23 %, y Beauveria bassiana con 71,88 y 73,68 % en condiciones de laboratorio e invernadero respectivamente, con nivel de confianza del 95 %. El menor porcentaje de mortalidad lo present Paecilomyces fumosoroseus con 62,50 y 50,20 y Verticillium lecanii con 59,38 % y con 44,37 % en condiciones de laboratorio y de invernadero respectivamente, con nivel de confianza del 95%. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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Correspondencia: Filver Reategui Ch. E-mail: