Ingeniera Gentica

Plataformas para el clonado molecular

Mariano N. Belaich, Vanina A. Rodrguez, Facundo Temprana

Universidad Nacional de Quilmes

Ingeniera gentica

Construcciones genticas

Construcciones genticas
La generacin de construcciones genticas nos introduce en el clonado molecular.

El clonado molecular consiste en multiplicar copias idnticas de una molcula.

En nuestro caso, las molculas son cidos nucleicos, y la multiplicacin la logramos utilizando materia viva.

Construcciones genticas
Plano Plataforma Insumos Softwares Vectores de clonado cidos nucleicos naturales y artificiales Enzimas Electroforesis/incubadores/PCR Estrategias y protocolos

Herramientas
Equipamiento Procedimientos

Construcciones genticas
Plano Plataforma Insumos Softwares Vectores de clonado cidos nucleicos naturales y artificiales Enzimas Electroforesis/incubadores/PCR Estrategias y protocolos

Herramientas
Equipamiento Procedimientos

Clonado molecular
Identificar objetivo In silico Diseo in silico Aislar la plataforma

Aislar el inserto
Apertura de la plataforma Compatibilizacin de extremos Ligacin Transferencia horizontal Seleccin de ORG/plataforma Seleccin de ORG/plataforma Recombinante In vivo In vitro

Plataformas de clonado
Denominamos plataforma o vector de clonado a las molculas de cidos nucleicos con la capacidad de multiplicar en algn organismo, permitiendo a su vez la posibilidad de insertarles secuencias que no le son propias. Deben ser de dsDNA o tener intermediarios que lo sean.

REQUISITOS

Replicacin dentro de Recepcin de secuencias clulas adecuadas heterlogas

Sistema de seleccin para recombinantes

Plataformas de clonado

Plataformas de clonado
Plsmidos
Molculas de dsDNA, generalmente circulares, propias de bacterias y algunos eucariotas como las levaduras

Virus

Molculas de cidos nucleicos protegidos por protenas y/o membranas lipdicas que parasitan a los organismos

Cromosomas artificiales

Molculas de dsDNA artificiales que poseen los componentes mnimos indispensables para comportarse como cromosomas de un organismo particular

Plataformas de clonado: Plsmidos

Los plsmidos son molculas de dsDNA extracromosmicas, generalmente circulares covalentemente cerradas, con la capacidad de replicacin autnoma.

Plataformas de clonado: Plsmidos

Los plsmidos son extracromosmicos porque no codifican factores esenciales para la vida.

La capacidad de replicacin autnoma de los plsmidos significa que codifican maquinaria proteica que controla cundo y cunto replica

Plataformas de clonado: Plsmidos

Elementos extracromosmicos

CURADO

Plataformas de clonado: Plsmidos

Elementos extracromosmicos

Plataformas de clonado: Plsmidos

Elementos extracromosmicos

Plataformas de clonado: Plsmidos

Elementos extracromosmicos

Plataformas de clonado: Plsmidos

Elementos extracromosmicos

Plataformas de clonado: Plsmidos

Elementos con capacidad de replicacin autnoma

Maquinaria de Replicacin

Generalmente utilizan la de la clula hospedadora Controlado por secuencias genticas propias

Inicio de la Replicacin

Control del nmero de copias

Controlado por secuencias genticas propias (Relajado o estricto) Generalmente, controlado por secuencias genticas propias

Particin en clulas hijas

Plataformas de clonado: Plsmidos

Sistemas de particin de plsmidos

Sin mecanismo

Plataformas de clonado: Plsmidos

Sistemas de particin de plsmidos

Por medio de funciones par

Plataformas de clonado: Plsmidos

Sistemas de particin de plsmidos

Por medio de Toxina/antdoto

Plataformas de clonado: Plsmidos

Componentes de un plsmido mnimo

En este esquema el plsmido posee un ORI ColE1

Plataformas de clonado: Plsmidos

Componentes de un plsmido mnimo

Genes que codifican ventajas

Genes que codifican resistencias a antibiticos (

antR)

Sustancias producidas por organismos que matan (bactericida) o limitan el crecimiento (bacteriosttico) de las bacterias. Actualmente se producen mediante sntesis qumica.

Plataformas de clonado: Plsmidos

Componentes de un plsmido mnimo

Ejemplos de antibiticos utilizados

Gen de resistencia

Kanamicina

(afecta la traduccin)

kan R

(protena que fosforila a la droga)

Cloranfenicol (afecta la traduccin) Tetraciclina (afecta la traduccin) Ampicilina (afecta la sntesis de pared)

cat R (protena que acetila a la droga) tet R (bomba de membrana que expulsa la
droga)

ampR

(protena que hidroliza la droga)

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular
Los plsmidos son excelentes plataformas para el clonado molecular dado que pueden ser multiplicados en bacterias y seleccionados verticalmente debido a que aportan ventajas (por ejemplo, resistencia a antibiticos). Las bacterias son organismos fciles de multiplicar en condiciones de laboratorio, pudindose obtener altas cantidades de biomasa en cortos tiempos y con bajos costos. Escherichia coli es la bacteria Gram negativa ms estudiada, existiendo cepas que son completamente inocuas para el ser humano. La combinacin de plsmidos y Escherichia coli resulta ser la alternativa ms simple y utilizada en el clonado molecular como sistema de plataforma para la construccin de secuencias quimricas de inters.

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular

Placa de medio de cultivo ms antibiticos.

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular

Placa de medio de cultivo ms antibiticos.

UFC (Unidad formadora de Colonia)

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular

1974

1977

1982

1985

1988

1992

pMB1

pBR322

pUC18

pUC118 pBlueScript pZErO

Existen otros muchos plsmidos, pero estos muestran cmo fueron incorporndose diferentes componentes de secuencia con fines particulares.

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular: pMB1

1974

1977

1982

1985

1988

1992

pMB1

pBR322

pUC18

pUC118 pBlueScript pZErO

Este plsmido deriva de un aislamiento clnico. Posee mltiples resistencias a antibiticos y un origen estrechamente relacionado con el ColE1 (15-20 copias).

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular: pBR322

1974

1977

1982

1985

1988

1992

pMB1

pBR322

pUC18

pUC118 pBlueScript pZErO

Este plsmido es el primer vector comercial. Posee resistencias a antibiticos y un origen de replicacin ColE1 (15-20 copias).

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular: pBR322

La molcula posee sitios de reconocimiento a Endonucleasas de Restriccin dentro de todas las secuencias indicadas

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular: pUC18

1974

1977

1982

1985

1988

1992

pMB1

pBR322

pUC18

pUC118 pBlueScript pZErO

Este plsmido surge a partir del pBR322, incorporando un nuevo sistema para la seleccin de construcciones recombinantes.

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular: pUC18

El clonado molecular se realiza en el MCS, interrumpiendo de este modo el gen selector de recombinantes. El ORI fue mutagenizado para generar ms copias (alrededor de 700).

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular: pUC18

Placa de medio de cultivo ms antibiticos y ms X Gal

UFC azules indican actividad Beta-galactosidasa

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular: pUC118

1974

1977

1982

1985

1988

1992

pMB1

pBR322

pUC18

pUC118 pBlueScript pZErO

Este plsmido surge a partir del pUC18, incorporando un ORI de fago filamentoso, lo cual permite la obtencin de las cadenas nucleotdicas por separado.

Plataformas de clonado: Plsmidos

Plsmidos particulares en funcin de su aplicacin: pUC118

Es un vector prcticamente idntico al predecesor pUC18. La diferencia radica en la presencia de secuencias correspondientes al origen de replicacin de los fagos filamentosos.

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular: pBlueScript

1974

1977

1982

1985

1988

1992

pMB1

pBR322

pUC18

pUC118 pBlueScript pZErO

Este plsmido surge a partir del pUC118, incorporando secuencias promotoras de fagos flanqueando al MCS. Las mismas sirven para generar transcriptos in vitro, o para amplificar el inserto con primers universales mediante PCR.

Plataformas de clonado: Plsmidos

Plsmidos particulares en funcin de su aplicacin: pBlueScript

Es un vector prcticamente idntico al predecesor pUC118. La diferencia radica en la presencia de secuencias promotoras de fagos a los flancos del MCS.

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular: pZErO

1974

1977

1982

1985

1988

1992

pMB1

pBR322

pUC18

pUC118 pBlueScript pZErO

Este plsmido cambia el gen de seleccin (resistencia a kanamicina) y el gen selector de recombinantes (secuencia codificante para una toxina).

Plataformas de clonado: Plsmidos

Historia de su aplicacin en el clonado molecular: pZErO

Es un vector de clonado que introduce un nuevo mecanismo para la seleccin de construcciones recombinantes. Si el plsmido no es interrumpido en el MCS, se codifica la toxina CddB, la cual no permite que la bacteria replique. Es un plsmido asesino.

Plataformas de clonado: Plsmidos

Plataformas de clonado: Plsmidos

Plsmidos particulares segn aplicacin

Existen plsmidos que aportan funciones diferenciales a las secuencias insertadas, en funcin de las secuencias que rodean al MCS.

Por ejemplo

Plsmidos para expresin de protenas

Plsmidos para el anlisis de promotores

Plataformas de clonado: Plsmidos

Plsmidos particulares segn aplicacin: Plsmidos de expresin

Plataformas de clonado: Plsmidos

Plsmidos particulares segn aplicacin: Plsmidos para anlisis de promotores

Plataformas de clonado: Plsmidos

Plsmidos particulares segn aplicacin: Plsmidos para anlisis de promotores

Reporter genes
(genes indicadores)

Codifican protenas de fcil deteccin, ya sea por su actividad enzimtica o por alguna propiedad fisicoqumica

GFP (Green Fluorescence Protein) DsRED B-galactosidasa Luciferasa

Plataformas de clonado: Plsmidos

Plsmidos particulares segn aplicacin: Plsmidos para anlisis de promotores

GFP (Green Fluorescence Protein) y variantes

Plataformas de clonado: Plsmidos

Plsmidos particulares segn aplicacin: Plsmidos para anlisis de promotores

DsRED

Plataformas de clonado: Plsmidos

Plsmidos particulares segn aplicacin: Plsmidos para anlisis de promotores

Luciferasa

Plataformas de clonado: Virus

Los virus son entidades formadas por las mismas macromolculas que los organismos. Poseen un genoma, el cual se encuentra protegido por una cpside proteica y/o una envoltura membranosa.

La principal diferencia con los organismos es que no son capaces por s solos de transformar y almacenar la energa.
Poseen la capacidad de multiplicar cuando ingresan a la clula hospedadora adecuada.

Plataformas de clonado: Virus

En el clonado molecular en bacterias, los virus ms utilizados son el fago lambda y el fago P1

Micrografa electrnica de fagos Esquema de Fagos icosadricos

Plataformas de clonado: Virus

Placa de medio de cultivo conteniendo bacterias que han sido infectadas

Plataformas de clonado: Virus

Placa de medio de cultivo conteniendo bacterias que han sido infectadas

UFP (Unidad Formadora de Placas)

Plataformas de clonado: Virus

Ciclo ltico del fago lambda

Adsorcin

Inyeccin DNA Lisis

Replicacin DNA viral Ensamblado

Sntesis de cpsides

Plataformas de clonado: Csmidos y Fsmidos

Existen plataformas de clonado basadas en el genoma del fago lambda, las cuales despus de ligar las molculas de inters requieren de una encapsidacin in vitro.

Por otro lado, existen los csmidos y los fsmidos. En ambos casos, son plsmidos que replican como tales en Escherichia coli, pero al poseer la regin COS del fago lambda pueden ser encapsidados in vitro.

Plataformas de clonado: Cromosomas artificiales

Los cromosomas artificiales son fragmentos de dsDNA que contienen los requerimientos de secuencia mnimos y necesarios para comportarse y segregarse como molculas genmicas.

BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

Son molculas de cccdsDNA que contienen ORI plasmdicos de control estricto (1-2 copias).

YAC (Yeast Artificial Chromosome)

Son molculas de cccdsDNA que contienen ORI plasmdico relajado y ORI de levaduras estricto. Poseen secuencias telomricas y centromricas para comportarse como un cromosoma en levaduras.