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UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO

Divisin de Docencia Direccin de Planeacin y Desarrollo Educativo MANUAL DE PRCTICAS Instituto: INSTITUTO DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Licenciatura en:

INGENIERA AGROINDUSTRIAL 1.- Nombre de la asignatura: BIOQUMICA I 2.Semestre: TERCERO 3.- Carga horaria semanal: 10 4.- Nombre de quienes elaboraron el manual: DRA. ELIA NORA AQUINO BOLAOS INTRODUCCIN 5.- Fecha de ltima actualizacin: 8 De DICIEMBRE DEL 2004

INDICE PRACTICA Pg.

1.- Nombre de la asignatura:......................................................................................................................................i pH DE SOLUCIONES DE ACIDOS Y BASES FUERTES....................................................................................1 Introduccin...............................................................................................................................................................1 PREPARACIN DE UNA SOLUCIN AMORTIGUADORA.............................................................................4 Introduccin...............................................................................................................................................................4 REACCIONES DE CARBOHIDRATOS................................................................................................................7 Introduccin...............................................................................................................................................................7 PROPIEDADES DE LAS SUSTANCIAS PECTICAS.........................................................................................15 Introduccin.............................................................................................................................................................15 Cuestionario.............................................................................................................................................................18 REACCIONES DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS.........................................................................................19 Introduccin.............................................................................................................................................................19 PRECIPITACIN DE PROTENAS......................................................................................................................24 CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE LIPIDOS.....................................................................................28 Introduccin.............................................................................................................................................................28 Objetivo...................................................................................................................................................................29 ESTABILIDAD DE ACEITES...............................................................................................................................32 Introduccin.............................................................................................................................................................32

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PRACTICA # 1 pH DE SOLUCIONES DE ACIDOS Y BASES FUERTES Introduccin Los cidos y bases fuertes son aquellas soluciones que al ponerlas en contacto con al agua, se disocian en sus iones totalmente. Para el caso de los cidos fuertes, se tiene la siguiente reaccin: HA Por lo que: pH = log __
1__

H++A-

[ H +] Con respecto a las bases fuertes tenemos:

BOH Por lo que:

B+ + OH-

pOH = log __

1__

[ OH - ] pH = 14 pOH

Objetivos 1. Repasar los aspectos qumicos de los cidos y las bases 2. Preparar y evaluar un sistema amortiguador de pH (buffer)

Materiales y mtodos 6 vasos precipitados de 200 ml 2 pipetas volumtricas 1 piceta Reactivos Solucin de HCl 0.1 M Solucin de NaOH 0.1 M Metodologa En un vaso precipitado de 200 ml colocar aproximadamente 100 ml de solucin de HCl 0.1 M y medir su pH en el potencimetro. Posteriormente, colocar 10 ml de solucin 0.1 M de HCl, en un matraz aforado de 100 ml y diluir a la marca con agua destilada; colocar alrededor de 100 ml de la solucin preparada en un vaso de precipitado de 200 ml y medir el pH. Repetir la operacin anterior hasta la quinta dilucin y medir el pH a las distintas disoluciones. Hacer de la misma manera con el NaOH 0.1M, para calcular el pH de distintas soluciones preparadas de base fuerte. Resultados Hacer dos cuadros de resultados del experimento, uno con las soluciones de cido fuerte y otro con las soluciones de la base fuerte, que contenga ambos cuadros: nmero de dilucin, concentracin molar del cido en las distintas diluciones, pH real y pH calculado. Graficar los resultados donde se encuentre el pH en funcin de la concentracin molar del cido clorhdrico y otra grfica del pH en funcin de la concentracin molar de NaOH 2 matraces aforados de 100 ml. 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml 1 potencimetro

Cuestionario 1. Hubo diferencias entre el pH real y el calculado de las distintas soluciones? A qu se atribuyen dichas diferencias. 2. Encontrar la cantidad de gramos de HCl que se necesitan para preparar las siguientes cantidades. A)1000 ml de HCl 1M B)1000 ml de HCl 0.1M C)1000 ml de HCl 0.001M D)1000 ml de HCl 0.2M E)1000 ml de HCl 0.5M F)250 ml de HCl 1M G)300 ml de HCl 0.2M H)400 ml de HCl 0.5M I)650 ml de HCl 0.1M J)50 ml de HCl 1.2M

3. Encontrar la [ H + ] de las siguientes soluciones:

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A)HCl 0.001M B)H2SO40.01M C)HCl 0.02M D) H2SO4 0.03M E)500 ml de HCl 0.5M 4. Encontrar el pH de las siguientes concentraciones de HCl A)1.33 *10-5 moles / litro B)1.58*10-2 moles / litro C)1.18*10-3 moles / litro D)6.9*10-4 moles / litro E)1.96*10-4 moles / litro F)1.3*10-1moles / litro G)0.1 moles /litro H)1 moles/litro I)0.2 moles/litro J)2 moles /litro 5. Cual sera la concentracin de iones hidrogeno en los siguientes pH? A)8.3 B)7.2 C)6.8 D)5.9 E)5.0 BIBLIOGRAFIA 1. Daniels, L: J. y Neal A. L. 1967. Laboratory Experiments in Biochemistry. Academic Press. N.Y. 2. Litwack, G. Experimental Biochemistry. 1967. John Wiley & Sons. N.Y. 3. Laguna, J. y Pia, E. 1979. Bioqumica. 3. Ed. La prensa Medica Mexicana. 4. Plummer, D. T. 1981. Introduccin a la Bioqumica Prctica. Mc Graw Hill Latinoamericana, F)4.7 G)3.0 H)2.5 I)1.0 J)0.5

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PRACTICA # 2 PREPARACIN DE UNA SOLUCIN AMORTIGUADORA Introduccin La concentracin de los iones hidrgeno en los diferentes medios es de particular importancia para todos los organismos vivos. Cambios pequeos en la concentracin de iones hidrogeno en la sangre, pueden dar lugar a cambios considerables en la composicin qumica de sta, trayendo como consecuencia alteraciones en procesos fisiolgicos tales como la respiracin, y hasta el comportamiento. Variaciones mnimas en el pH pueden afectar la capacidad cataltica de las enzimas y por lo tanto el buen funcionamiento de los sistemas metablicos. De aqu que el uso de soluciones amortiguadoras sea de gran importancia en el estudio de la actividad enzimtica o de las reacciones involucradas en los procesos metablicos. Una solucin amortiguadora (tampn o buffer) puede definirse como una solucin de un par conjugado cido base en tal proporcin que resiste los cambios en pH cuando se le adicionan iones H+ o iones OH-. La capacidad amortiguadora de este tipo de soluciones es mxima cuando la concentracin de la especie cida es igual a la concentracin de la especie bsica. El pH de la solucin en este punto se conoce como el pK del sistema. Cuando la solucin amortiguadora est formada por un compuesto que presenta varias etapas de disociacin, dicho compuesto tendr un pK diferente para cada grupo disociable. Objetivos. 1. Conocer los principios en los que se basa la preparacin y la accin de una solucin amortiguadora. 2. Llevar acabo los clculos necesarios para preparar una solucin amortiguadora con ciertas caractersticas, y con estos datos preparar esta solucin. 3. Verificar la estabilidad de la solucin amortiguadora en cuanto al cambio del pH.

Materiales y mtodos. 2 agitadores de vidrio 2 buretas de 50 ml 2 matraces aforados de 500 ml 1 pinzas para bureta 2 vasos de precipitados de 1 000 ml Soluciones Acido ctrico monohidratado 0.1 M (300 ml) Fosfato de sodio dibsico (Na2HPO4) 0.2 M (250 ml) Amortiguador de referencia pH 4 y 7 NaOH 0.1 M (500 ml) HCl 0.1 M (500 ml) Equipo Potencimetro Metodologa 1. Preparacin de una solucin amortiguadora de c. ctrico-fosfto de sodio pH 4.5. 1.1 Realizacin de los clculos. Llevar a cabo los clculos necesarios para preparar las soluciones de: cido ctrico 0.1 M, Na2HPO4 0.2 M, NaOH 0.1 M y HCl 0.1 M 1.2 Preparacin de la solucin amortiguadora mezclando 272.9 ml de cido ctrico 0.1 M con 227.1 ml de Na2HPO4 0.2 M. Medir el pH de la solucin en un potencimetro que haya sido previamente calibrado. Reportar el resultado obtenido y las observaciones hechas. 2. Verificacin de la estabilidad de la solucin amortiguadora en cuanto al cambio en pH. 2.1 Elevacin de pH de la solucin amortiguadora A 50 ml de la solucin amortiguadora preparada en 1.2, adicionar con una bureta diferentes volmenes de la solucin de NaOH 0.1 M. (en incrementos de 10 ml hasta 50 m l). Agitar perfectamente la solucin y en seguida determinar el pH de la misma. Reportar los resultados obtenidos 2.1 Disminucin del pH de la solucin amortugiadora A 50 ml de la solucin amortiguadora preparada en 1.2, adicionar con una bureta diferentes volmenes de la solucin de HCl 0.1 M. (en incrementos de 10 ml hasta 50 m l) Agitar perfectamente la solucin y en seguida determinar el pH de la misma. Reportar los resultados obtenidos.
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2.2 Elevacin del pH del agua. Medir 50 ml de H2O destilada mediante el uso de un matraz volumtrico. En seguida, medir el pH de la misma. Adicionar al agua 20 ml de solucin de NaOH 0.1 M y agitar vigorosamente, para despus medir el pH de la mezcla. 2.3 Disminucin del pH del agua Medir 50 ml de H2O destilada mediante el uso de un matraz volumtrico. Adicionar al agua 20 ml de solucin de HCl 0.1 M y agitar vigorosamente, para despus medir el pH de la mezcla. Comparar el resultado obtenido en esta prueba, con el que se obtuvo con la solucin amortiguadora reportar los resultados obtenidos. Realizar una grfica con los valores de titulacin del amortiguador. Cuestionario 1. Porque el cido actico se considera un cido dbil y al cido clorhdrico se le considera un cido fuerte 2. Calcular el pH de una mezcla cido actico 0.1 M y de acetato de sodio 0.2 M. El pka del cido actico es de 4.76 3. En funcin a que se selecciona una sustancia reguladora en los procesos bioqumicas. Bibliografa 1. Conn E. Stumpf P. K. 1976. Outlines of Biochemistry Cap.1 Wiley internacional (Edicin en Espaol. Ed. Limusa 1976 bioqumica fundamental). 2. Suttie J. W. 1976. Fundamentos de Bioqumica Cap.1 Nueva Ed. Interamericana. 3. Calbiochem, 1975 ( D.E.Gueffroy, editor) A guide for the preparation and use of buffers in biological systems. Calbioche, Cal. 4. Williams B. L..Wilson K. 1975. Principales and techniques of practical Biochemistry Cap.1 Arnold publishers. 5. Cowgill W. Pardee B. 1964. Tcnicas de investigacin bioqumica. Ed. Alhambra.

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PRACTICA # 3 REACCIONES DE CARBOHIDRATOS Introduccin Los carbohidratos se definen como polihiroxialdehdos, polihidroxicetonas o aquellos compuestos que por hidrlisis los producen. Los carbohidratos se clasifican, con base en su estructura qumica, por el nmero de unidades en: monosacridos, oligosacridos y polisacridos. Los monosacridos, la unidad de carbohidrato, puede ser aldosas (polihidroxialdehdos) o cetosas (polihidroxicetonas) y stas a su vez se clasifican con base al nmero de carbonos, en triosas y triulosas, tetrosas y tetrulosas, pentosas y pentulosas, hexosas y hexulosas, heptosas y heptulosas, etc. Para finalmente reclasificarse cada una de ellas por el nmero de sus centros quirales. Los oligosacridos estn constituidos de 2-6 monosacridos unidos a travs del enlace glicosdico que puede ser hidrolizado por enzimas o por cidos en ciertas condiciones. Los polisacridos son carbohidratos que contienen un gran nmero de monosacridos unidos por enlaces glicosdicos; son hidrocoloides, no forman verdaderas soluciones, no tienen color ni sabor y su peso molecular puede llegar hasta varios millones. Los polisacridos son polmeros lineales o ramificados constituidos por un solo tipo de monosacridos (homopolisacridos) o por diferentes monosacridos (heteropolisacridos).

Objetivo El alumno analizar las propiedades caractersticas de los carbohidratos, derivadas de su estructura, realizando algunas reacciones generales de identificacin.

Materiales y mtodos Tubos de ensayo Pipetas Gradilla Bao mara a ebullicin Vaso de precipitados de 100 ml Cerillos Marcador Masking tape Glucosa Slida y al 2% Arabinosa al 2% Maltosa al 2% Sacarosa slida y al 2% Fructosa al 2% Glucgeno slido y al 0.2% Almidn slido y al 2% Dextrina slida y al 2% Amilosa al 0.2% a-naftol

Etanol al 96% Acido sulfrico concentrado Fluorogucinol HCI concentrado y diluido 1:3 Resorcinol Sulfato de cobre Hidrxido de potasio Tartrato de sodio Yodo metlico Yoduro de potasio

Accin de los cidos y reacciones de caracterizacin de carbohidratos Los cidos fuertes inorgnicos calientes deshidratan a las hexosas formando derivados furnicos como el hidroximetil furfural, que puede posteriormente descomponerse y formar otros compuestos como el cido levulnico y el cido frmico. Por otra parte, a las pentosas las deshidratan produciendo furfural. Estas reacciones son la base de las pruebas de Molish, Seliwanoff, Tollens y Bial para caracterizar a los carbohidratos, ya que el producto deshidratado del carbohidrato se condensa con el reactivo correspondiente produciendo compuestos coloridos caractersticos.

a- REACCION DE MOLISH-UDRANSKY FUNDAMENTO La prueba de Molish est basada en la formacin de furfural o derivados de ste a partir de los carbohidratos, que se condensan con el alfa-naftol, dando un producto violeta.

Es una reaccin muy sensible puesto que soluciones de glucosa al 0.001% y sacarosa al 0.0001% dan positiva la prueba. Esta prueba tambin es positiva para aldehdos, cetonas y algunos cidos como frmico, oxlico, lctico y ctrico.

METODOLOGIA. a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 1 ml de las soluciones a probar (marcadas con asteriscos en la tabla correspondiente) b) Agregar 2 gotas del reactivo de Molish y Mezclar. c) Dejar resbalar por la pared del tubo 1 ml de H 2SO4 concentrado. d) Un anillo color violeta en la interfase es una prueba positiva.

b- REACCION DE TOLLENS. FUNDAMENTO. La prueba de Tollens es una reaccin caracterstica para pentosas y est basada en la formacin de furfural a partir de pentosas y su posterior condensacin con el floroglucinol dando un color rojo cereza.

METODOLOGIA. a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 0.5 ml de las soluciones a probar (marcadas con asterisco en la tabla correspondiente). b) Agregar 1 ml del reactivo de Tollens y mezclar. c) Calentar en bao Mara a ebullicin por 3-4 minutos. d) Un color rojo cereza es una prueba positiva. c- REACCION DE SELIWANOFF. FUNDAMENTO. La prueba de Seliwanoff es una reaccin para diferenciar cetosas de aldosas; aunque ambas dan la reaccin, las cetosas la dan rpidamente y las aldosas lentamente.

Est basada en la formacin de durfural o en un derivado de ste y su posterior condensacin con el resorcinol dando un color rojo fuego para cetosas y rosa para aldosas. METODOLOGIA. a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 1 ml de las soluciones a probar marcadas con asterisco en la tabla correspondiente. b) Agregar 0.5 ml del reactivo de Seliwanoff y mezclar. c) Calentar en bao mara a ebullicin. d) Tomar lecturas de la coloracin a intervalos de 1 minuto durante 5 minutos. e) Un color rojo fuego es una prueba positiva para cetosas y un color rosa es una prueba positiva para aldosas.

ACCION DE LOS ALCALIS Y PODER REDUCTOR DE LOS CARBOHIDRATOS. Los lcalis pueden inducir varias reacciones qumicas en los monosacridos que dependen de la intensidad del tratamiento y de la concentracin del lcali utilizado. A bajas concentraciones (0.5 N) se favorece la isomerizacin y el equilibrio cetoenlico (aldosas cetosas). En condiciones ms severas (0.5 N), la isomerizacin se produce fuertemente y los enoles intermediarios se rompen produciendo compuestos como: formaldehdo, aldehdo gliclico, gliceraldehdo, acetona, lctico, propinico, purvico etc. En condiciones fuertemente alcalinas se generan cidos sacricos. Una reaccin caracterstica de los carbohidratos est basada en el poder reductor que le confiere su grupo aldehdo o cetona.

a- REACCION DE FEHLING. FUNDAMENTO. La reaccin de Fehling est basada en la accin reductora que tienen los azcares sobre los iones cpricos en medio alcalino, como se representa a continuacin:

Carbohidrato + Cu2 + lcali_ Carbohidrato oxidado + Cu+

El reactivo de Fehling est constituido por dos soluciones que se mezclan al momento de usarse (Solucin A de sulfato de cobre y solucin B de tartrato de sodio-potasio en medio alcalino).

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El poder reductor de los oligo y polisacridos depende, del nmero de carbonilos potencialmente libres que no estn involucrados en enlaces glicosdicos. METODOLOGIA. a) Colocar en un tubo de ensayo 2 ml de agua destilada. b) Agregar 0.5 ml del reactivo de Fehling A y 0.5 ml del reactivo de Fehling B y mezclar. c) Calentar en bao mara durante 5 minutos. d) No debe producirse un precipitado rojo ladrillo. PREPARACION DE LOS PROBLEMAS. a) Colocar en el tubo correspondiente 1 ml de las soluciones a probar (marcadas con asterisco en la tabla correspondiente). b) Agregar 0.5 ml del reactivo de Fehling A y 0.5 ml del reactivo de Fehling B y mezclar. c) Calentar en bao mara a ebullicin durante 5 minutos. d) Un precipitado rojo ladrillo es una prueba positiva. SOLUBILIDAD Y SABOR DE LOS CARBOHIDRATOS. METODOLOGIA a) Colocar en 5 tubos de ensayo de 3 ml de agua destilada. b) Agregar en el tubo correspondiente aproximadamente 50 mg de los carbohidratos a probar (marcados con asterisco en la tabla correspondiente). c) Mezclar y anotar el grado de solubilidad. d) Calentar en bao mara durante 2 minutos. e) Anotar el grado de solubilidad. f) Tomar, con ayuda de un agitador, unas gotas de las 5 soluciones y percibir su sabor. g) Hacer las anotaciones correspondientes.

REACCION DEL YODO. FUNDAMENTO. El yodo es atrapado por los polisacridos y dependiendo de la estructura de stos da una coloracin caracterstica; si el polisacrido es lineal se obtendr una coloracin azul pero si es ramificado la coloracin obtenida va del prpura al rojo.

METODOLOGIA. a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente 1 ml de las soluciones a

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b) c) d) e)

Probar (marcadas con asterisco en la tabla correspondiente). Agregar una gota de lugol y mezclar. Anotar el color producido. Calentar en bao mara. Anotar la observacin.

Resultados MOLISH TOLLENS SELIWANOFF BLANCO (AGUA) Glucosa Arabinosa Maltosa Sacarosa Fructuosa Glucgeno Almidn Dextrina Amilosa FEHLING SOLUBILIDAD YODO

PREPARACION DE REACTIVOS. 1) Glucosa al 2%.- Pesar 2 g de glucosa y disolver en 100 ml de agua destilada, refrigerar. 2) Arabinosa al 2%.- Pesar 2 g de arabinosa y disolver en 100 ml de agua destilada, refrigerar. 3) Maltosa al 2%.- Pesar 2 g de maltosa y disolver en 100 ml de agua destilada, refrigerar. 4) Sacarosa al 2%.- Pesar 2 g de sacarosa en 100 ml de agua destilada, refrigerar. 5) Fructosa al 2%.- Pesar 2 g de fructosa en 100 ml de agua destilada, refrigerar.

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6) Solucin de glucgeno al 0.2%.- Pesar 200 mg de glucgeno y disolver en 100 ml de agua caliente, al agua caliente agregar poco a poco el glucgeno. Refrigerar. 7) Solucin de almidn al 2%.- Pesar 2 g de almidn comercial y disolver en 100 ml de agua caliente, al agua caliente agregar poco a poco el almidn. Refrigerar. 8) Dextrina al 2%.- pesar 2 g de dextrina y llevar a 100 ml con agua destilada (para disolver, alcalinizar en caliente y neutralizar posteriormente), refrigerar. 9) Amilosa al 2%.- Pesar 200 mg de amilosa y disolver en 100 ml de agua destilada caliente. Refrigerar. 10)Reactivo de Molish.- pesar 5 g de alfa-naftol y disolver en 100 ml de alcohol a 96. 11)Floroglucinol al 2%.- Pesar 2 g de floroglucinol y disolver en 100 ml de agua caliente. 12)Reactivo de Tollens.- Mezclar 10 ml de HC1 concentrado con 2 ml de floroglucinol al 2% y llevar con agua destilada hasta 18 ml. 13)Reactivo de Fehling: Solucin A.- Pesar 34.65 g de sulfato de cobre y disolver 300 ml de agua destilada, llevar a 500 ml con agua y conservar en frasco con tapn de hule. Solucin B.- Pesar 125 g de KOH y 173 g de tartrato de sodio y potasio, y llevar con agua destilada a 500 ml, conservar en frasco revestido de parafina y con tapn de hule. 14) Reactivo de Seliwanoff.- Pesar 0.05 g de resorcinol y disolver en 100 ml de HC1 diluido 1:3. 15) Lugol.- Pesar 1 g de yodo metlico, 2.0 g de KI (dos partes de KI por una de yodo), mezclar en un mortero y agregar agua destilada poco a poco hasta la disolucin total. Llevar a 300 ml con agua destilada y conservar en un frasco mbar. Cuestionario 1. Explique porque la reaccin de Fehling es positiva con la glucosa y negativa con la sacarosa. 2. Cual es la diferencia estructural del glicgeno y de la glucosa 3. A que se le llama inversin de la sacarosa Bibliografa 5. Daniels, L: J. y Neal A. L. 1967. Laboratory Experiments in Biochemistry. Academic Press. N.Y. 6. Litwack, G. Experimental Biochemistry. 1967. John Wiley & Sons. N.Y.

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7. Laguna, J. y Pia, E. 1979. Bioqumica. 3. Ed. La prensa Medica Mexicana. 8. Plummer, D. T. 1981. Introduccin a la Bioqumica Prctica. Mc Graw Hill Latinoamericana,

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PRACTICA # 4 PROPIEDADES DE LAS SUSTANCIAS PECTICAS Introduccin Las sustancias pcticas son heteropolmeros de carbohidratos cuya unidad principal es el cido galactopiranosilurnico unido por enlaces glucosdicos 1-4. Alguno grupos carboxilo del cido galactopiranosilurnico pueden estar esterificados con grupos metilo formado por metil- galactopiranosilurnico, algunas de las unidades pueden estar acetiladas con c-o-c en ambos, en la cadena existe la insercin de unidades de ramnopiranosa adems laterales de una unidad cilopiranosa: cadenas laterales altamente ramificadas que contienen unidades de L-arabinofuranosa y cadenas laterales que contienen unidades de L-galactopiranosa. Las sustancias pcticas son por lo tanto sustancias muy complejas y la terminologa ms adecuada para referirse a sus varias formas es la siguiente: Protopectina. Es el trmino usado para describir el precursor insoluble de la pectina que se encuentra de manera abundante en los tejidos inmaduros de los frutos, junto con celulosa, hemicelulosa y lignina, forma parte de la estructura celular. Se considera que la protopectina es el material de cementacin para las otras sustancias. La protopectina durante la maduracin o la hidrlisis cida, produce primero cidos pectnicos y luego cidos pcticos. Acidos pcticos. Son cidos poligalactopiranosilurnicos coloidales de los cuales los grupos carboxilo se encuentran sin esterificacin alguna. Las sales de estos cidos son pectatos. cidos pectnicos. Son cidos poligalactopiranosilurnico de naturaleza coloidal parcialmente esterificados con grupos metilo y son las llamadas pectinas. La nomenclatura de las pectinas esta gobernada por el grado de esterificacin con grupos metilo. La fuerza del gel es obtenida con la pectina con sucrosa o dextrosa hasta obtener la fuerza natural del gel deseado. El tiempo o temperatura de gelacin se obtiene mezclando lotes de pectinas con diferentes tiempos o temperaturas de gelacin que se originan de las variaciones en las propiedades de la materia prima.

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Objetivos Determinar el contenido de pectina de una fruta Observar algunas propiedades de las pectinas

Materiales y mtodos Cuchillo Tabla Pela papas 3 vasos de precipitados de 150 ml 1 mechero 1 arillo 1 tela de asbesto 1 tela de algodn Papal filtro Buchner Reactivos Etanol al 95% Buffer acetato pH 2.2, 2.6, 3.0, 3.2 y 3.4 Cloruro de calcio al 2% Pectina de bajo y alto metoxilo Azcar 8 tapones para los tubos 8 tubos de ensaye de 20 ml 4 pipetas de 5 ml 9 vasos de 50 ml termmetro agitador de vidrio 1 vasos de precipitados de 800 ml 2 vasos de precipitados de 600 ml Matraz kitazato Equipo Balanza granataria Balanza analtica Resistencia

METODOLOGA 1. Estimacin de contenido de pectina de una fruta Dividir 50 gramos de manzana. Colquelas en un vaso de precipitados: Adicione 50 ml de agua y hierva hasta obtener una pulpa. Este calentamiento no debe ser prolongado. Filtre la pulpa a travs de un lienzo (o centrifugue). Precipite la pectina en el filtrado adicionndole poco a poco etanol al 95% quitando bien hasta que ya no haya precipitacin. Seque y pese los slidos formados. Calcule el peso de la pectina extrada en por ciento sobre el peso de la materia prima original 2. Observacin de las propiedades de las pectinas 2.1 Determinacin de la temperatura de gelificacin de dos pectinas con diferentes contenidos de metilacin:

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Formulacin estndar (65% s.s., pH 3.2) 0.72 g de pectina 120 g de azcar 60 ml de agua 10 ml de buffer pH 3.2 Pese un vaso de precipitados de 600 ml. Aada la pectina y 30 g de azcar. Mezcle todo muy bien (si no lo hace se formarn grumos). Adicione 60 ml de agua hirviendo y agite. Inmediatamente aada los 10 ml de buffer y el resto del azcar. Ebulla el contenido hasta obtener un 65 % de s.s. Cheque con el refractmetro o pesando. Use la siguiente formula PA X = ------------PCM Donde PA = Peso del azcar PCM = Peso del contenido del matraz X = porcentaje de slidos solubles Cuando se alcance el contenido de slidos, vacelos rpidamente en varios tubos de 19 ml en un bao de agua hirviendo (vaso de 800 ml). Remueva la fuente de calor y cierre los tubos. Deje que el agua del vaso se enfre bajo condiciones naturales. Cada determinado tiempo remueva un tubo, y lea la temperatura del agua. Invierta el tubo y ntese si la gelacin ha empezado en el fondo del tubo. Anote la temperatura a la cual empieza la coagulacin. Repita el experimento con la otra pectina. 2.2 Efecto el pH en la formacin de geles Prepare la formulacin estndar dada en el punto 2.1, pero sustituya los 10 ml de buffer por 10 ml de agua y pare la ebullicin. Cuando alcance el 71 % de s.s., aada 20 ml de solucin a cada uno de los siguientes vasos y mzclelos. Numere 5 vasos de precipitados de 100 ml y aada de acuerdo a lo siguiente 1. 2 ml de agua 2. 2 ml de buffer de pH 2.2 3. 3 ml de buffer pH 2.6 4. 3 ml de buffer pH 3.0 5. 2 ml de buffer de pH 3.4.

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Djelos reposar y observe al final del periodo de laboratorio del estado fsico (ejemplo lquido, gel dbil, gel fuerte). Almacene sus vasos y repita las observaciones la semana siguiente. 2.2 Formacin de geles con pectinas de bajo metoxilo. En un vaso de precipitado tarado ponga 30g de azcar, y 1g de pectina de bajo metoxilo, mzclelo bien. Aada 70ml de agua caliente y 5ml de buffer 3.0. Ebulla hasta disolver bien el contenido, agregue 10ml de solucin de cloruro de calcio al 2% (CaCl2) y ebulla hasta tener PCM (peso neto) de 100g, vace el contenido en 4 vasos de precipitado pequeos y djelos reposar hasta el siguiente periodo de laboratorio, y entonces obsrvelos

Cuestionario 1. Por qu los tomates antes de enlatarlos (como tomates enteros) se sumergen en una solucin de cloruro de calcio? 2. Qu tipo de pectina usaras para fabricar un postre en forma de gel a partir de leche y jugo de frutas? 3. Menciona las tres fuentes principales para extraer pectinas

Bibliografa Glickman, M., 1969. Gum Tecnology in the Food Industry, 1 Academic Pess, New York Wight, 1971, Polysaccharyde Conformation, Part VII: Model Building computation : for 1-4 Galacturonan and the kicking function of L-rhamnose Residues in Pectic Substances, j. Chem. Soc. (8): 1366

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PRCTICA No. 5 REACCIONES DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS Introduccin Las protenas son polmeros de alto peso molecular, compuestos por aminocidos unidos entre s por enlaces peptdicos, que cuando se solubilizan son de dimensiones coloidales. Presentan propiedades qumicas y fsicas que dependen directamente de factores extrnsecos, como puede sel el pH, la temperatura, la presencia de sales, etc. Existen varios mtodos para la identificacin y cuantificacin de las protenas, pero la mayora tiene como principio alguna reaccin qumica caracterstica de los grupos R de los diferentes aminocidos. Puede decirse que las protenas reflejan las propiedades qumicas de los residuos de aminocidos que contienen, por lo que la mayora de las reacciones coloridas de identificacin dependen de la existencia de un aminocido especfico en ellas. Objetivos El alumno realizar algunas reacciones coloridas especficas para la identificacin de los aminocidos que constituyen a una protena. El alumno comprender la importancia de estas reacciones para distinguir las protenas.

Materiales Y Mtodos. Acido oxlico (sol. Saturada) Acido actico glacial Reactivo de biuret Gelatina al 5% Peptona al 5% Albmina al 5% Tirosina al 1% Triptofano al 1% Fenilalanina al 1% Cistena al 1% Arginina al 1% Hidrxido de sodio al 10% Acetato de plomo al 5% Ninhidrina al 1% en butanol saturado con regulador de fosfatos 0.06M, pH 7.4. Acido ntrico concentrado. Hidrxido de amonio concentrado Oxido rojo de mercurio Nitrito de sodio Magnesio en polvo o granallas

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Gradilla Tubos de ensayo Pipetas de 1,5 y 10 ml Vaso de precipitados de 100 ml Bao mara Agitador de vidrio Pinzas para tubo REACCION DEL PLOMO PARA CISTEINA.- Es una reaccin caracterstica para grupos sulfhidrilos. METODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema 2 ml de NaOH al 10% y calentar ligeramente. Adicionar de 3 a 5 gotas de acetato de plomo al 5% y calentar nuevamente hasta ver la aparicin de un precipitado negro. b) Anotar los resultados y observaciones en la tabla correspondiente. REACCION DE LA NINHIDRINA.- Es una reaccin caracterstica para grupos amino libres. METODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema, 5 gotas de la solucin de Ninhidrina en butanol. Observar a temperatura ambiente la aparicin de un color azul o violeta que se debe a la presencia de los grupos amino libres; si es necesario, calentar en bao mara 1 2 minutos los tubos en los que no aparece el color. b) Anotar los resultados y observaciones en la tabla correspondiente. REACCION DE HOPKINS-COLE.- Esta reaccin es caracterstica del anillo indol y por lo tanto del triptfano, por ser ste el nico aminocido que contiene este grupo. El reactivo contiene cido glioxlico que se prepara por reduccin del cido oxlico con magnesio en polvo o amalgama de sodio. Numerosos aldehdos pueden dar una reaccin similar con triptfano. La naturaleza del compuesto colorido formado no se conoce totalmente. Los cloratos, nitritos y cloruros interfieren en la reaccin. METODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problemas, 5 gotas del reactivo de Hopkins-Cole y mezclar bien. Estratificar cuidadosamente con 1 ml de cido sulfrico concentrado, procurando que se forme un lmite bien definido entre ambos lquidos. La aparicin de un anillo violeta-rojizo en la interfase es una prueba positiva de la presencia del triptfano. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados y observaciones.

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REACCION DE MILLON.- El reactivo de Millon contiene una mezcla de nitritos y nitratos mercricos en cido ntrico concentrado. Debido a la presencia del grupo fenlico se produce un compuesto de color rojo. METODOLOGIA. A) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema de 2 a 5 gotas del reactivo de Millon y calentar en bao mara. La aparicin de un color rojo ser una prueba positiva. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados y observaciones. REACCION XANTOPROTEICA.- Esta reaccin es positiva tanto para aminocidos aromticos activados como protenas en solucin, aunque es mucho ms sensible cuando stas se encuentran perfectamente secas. Esta reaccin depende de la nitracin de los anillos bencnicos activados produciendo un color amarillo. La prueba resulta negativa para protenas que no contengan aminocidos aromticos activados. Ciertos derivados del benceno, como el cido pcrico, reaccionan formando los nitro derivados amarillos. METOLODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema, 1 ml de cido ntrico concentrado, calentar la mezcla y enfriar. Estratificar cuidadosamente con 1 ml de hidrxido de amonio concentrado. La paricin de un color amarillo o naranja en la interfase ser prueba positiva. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados obtenidos. REACCION DEL BIURET.- Esta es una prueba general para protenas y pptidos de cadena no menor de 3 unidades de aminocidos. Una utilidad de esta reaccin es seguir el proceso de una hidrlisis protenica, ya que la reaccin ser negativa cuando la hidrlisis sea completa. METODOLOGIA. a) Adicionar 1 ml de la solucin problema 2 ml de NaOH al 10% y de 3 a 5 gotas del reactivo de biuret (solucin de CuSO 4 al 0.5%), mezclar bien. La formacin de un color violceo o la precipitacin de hidrxido cprico ser una prueba positiva. Si el color de la reaccin del biuret no se presenta inmediatamente, deja reposar de 10 a 15 minutos. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados y observaciones. Reaccin para Reaccin grupos SH de Reaccin Reaccin de Milln Reaccin Reaccin de de Hantoproteica biuret

la de Cole

Ninhidrina HopkinsGelatina Peptona

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Albmina Aspartame Tirosina Triptofano Fenilalanina Cistena Arginia Agua Interpretacin. PREPARACION DE REACTIVOS. 1. Reactivo de Millon.- El reactivo se prepara aadiendo 60 g de xido de Mercurio a una mezcla de 45 ml de HNO3 concentrado y 50 ml de H2O. Cuando el xido de mercurio se ha disuelto, se aade 50 ml de una solucin de nitrito de sodio al 30%. El reactivo de millon contiene nitritos y nitratos mercricos. 2. Reactivo de Hopkins-Cole.- Se prepara aadiendo 10 g de magnesio en Polvo en 20 ml de agua destilada. Agregar lentamente 250 ml de una solucin fra y saturada de cido oxlico. La reaccin se produce con gran rapidez, desprendiendo tanto calor que se debe enfriar el matraz en la corriente de agua mientras se aade el cido. Cuando se ha terminado de aadir el cido. Agitar el contenido y verterlo sobre un papel filtro para separar el oxalato de magnesio insoluble. Se vierte un poco de agua sobre el filtro, se acidifica de magnesio al quedar largo tiempo en reposo, y se lleva a un litro de agua destilada en un matraz aforado. Esta solucin contiene nicamente la sal magnsica de cido glioxlico. 3. Nitrito de sodio al 30%.- Pesar 30 g de nitrito de sodio y llevar a 100 ml con Agua destilada. 4. Soluciones de aminocidos al 0.5%.- Pesar 0.5 del aminocido a preparar y Llevar a 100 ml con agua destilada. Si no se disuelve fcilmente, adicionar algunas gotas de solucin de NaOH o HCI para mejorar su solubilidad. Calentar un poco si es necesario. 5. Ninhidrina al 1% en butanol saturada con regulador de fosfatos 0.0006 M, PH 7.4.- Pesar 5 g de Ninhidrina y llevar a 500 ml con butanol. Mezclar 500 ml de regulador de fosfatos 0.006M, pH 7.4 con los 500 ml de Ninhidrina al 1% en butanol, agitar en embudo de separacin, eliminar la fase interior (acuosa) y usar la fase superior orgnica. 6. Regulador de fosfatos 0.006M, pH 7.4.- Pesar 2.136 g de Na 2 HPO4*12H2O y llevar a 1000 ml con agua destilada en un matraz aforado. Pesar 0.816 g de 0.816 g de KH2PO4 y llevar a 1000 ml con agua destilada en un matraz aforado. Mezclar en proporciones 8:2 de Na2HPO4 y KH2PO4 respectivamente; ajustar el pH si es necesario. 7. Reactivo de biuret.- pesar 0.5 g de sulfato de cobre y llevar a 100 ml con Agua destilada.

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Cuestionario 1. Cuales son los aminocidos esenciales y con que pruebas especficas se podran identificar? 2. A que se le denomina zwitterion? 3. Bibliografa 1. Clark, J: M: Bioqumica Experimental, Ed. Acribia, Espaa, (1966). 2. Daniels, J.L. y A. L. Neal, Laboratory Experiments in Biochemistry, Academic Prees. Inc. , N.Y., pp. 129-141, (1967). 3. Dotty, L.B. y M.J. Morten, Laboratory Instruments in Biochemistry, Mosby Co., pp 29-31 (1971). 4. Johnston, B.R., Laboratory Manual of Biochemistry, Burges Publishing Co., Minnesota, pp. 1-13, 41-54, (1958). 5. Legget, B.J., Techniques in Protein Chemistry, Elsevier Publishing Co., pp. 349351, (1967). 6. Litwack, G., Bioqumica Experimental, Ed. Omega, S:A:, Barcelona, pp. 169180, (1967). 7. Maraculla, J.M. y F.M. Goi, Biomolculas, Ed. Revert, pp 79-91, 107-113, (1978).

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PRCTICA No.6 PRECIPITACIN DE PROTENAS Introduccin Para entender la precipitacin de las protenas de debe tomar en cuenta que la protena es una molcula cargada positiva y negativamente de tal manera que las molculas reaccionan entre s, sea con iones pequeos de cargas opuestas o con el agua. Se pueden sealar tres tipos de interacciones: 1. protena- protena 2. protena-agua 3. protena-iones pequeos Si la interaccin 1 es grande y la 2 pequea, la protena tender a ser insoluble. Si sucede lo contrario, entonces la protena ser insoluble. Existen cinco formas de precipitar protenas: 1. Precipitacin por salacin (salting-out) Si se disminuye la precipitacin efectiva del agua en una solucin proteica aadiendo una sal muy soluble, aumenta la interaccin protena-protena producindose un precipitado de protena. Este procedimiento se ha llamado en ingls "salting-out" o en espaol "salado". Las sales ms empleadas para este efecto son las de sulfato de amonio y sulfato de sodio. 2. Precipitacin por solventes orgnicos Al aadir solventes orgnicos como etanol o acetona a una solucin acuosa de protenas, se baja la constante dielctrica del agua disminuyendo efectivamente la interaccin protena-agua, y aumentando la interaccin protena-protena favoreciendo as la precipitacin. Si esto sucede a ms de cero grados centrgrados, las protenas se desnaturalizan; de ah que este tipo de precipitacin cuando se usa con protenas enzimticas se tenga que hacer a menos de cero grados centgrados. En ste tipo de precipitacin se debe tomar en cuenta factores como pH, electrolitos, presencia de metales pesados, etc., pues tiene efecto en la precipitacin. 3. Precipitacin por formacin de sales Las sales de metales pesados precipitan las protenas porque el ion del metal pesado muy probablemente se combina con la forma aninica de la protena. La

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protena en el lado alcalino de su punto isoelctrico existe como in negativo y as al combinarse con el in del metal o catin, formar protenatos de por ejemplo proteinato de mercurio, proteinato de plomo, proteinato de plata, etc. En cambio los reactivos alcaloidales precipitan las protenas al combinarse el radical acdico del reactivo alcaloidal con la forma catinica de la protena que predomina en l lado cido del punto isoelctrico. Se forma entonces precipitados que podramos llamar por ejemplo tanato de protena, fosfomolibdato de protena, etc. 4. Precipitacin isoelctrica Una manera muy sencilla de precipitar las protenas es simplemente ajustar el pH de la solucin a su punto isoelctrico. Se forma entonces un precipitado reversible que se disolver tanto del lado alcalino como del lado cido del punto isoelctrico. 5. Precipitacin por calor La mayora de las protenas globulares incrementan su solubilidad al aumentar la temperatura, dentro de un rango de 0 a 40C. A temperaturas mayores de 40 a 50C, la mayora de las protenas son inestables y se empieza a desnaturalizar. Con este fenmeno hay una prdida de solubilidad en la zona de pH neutro, pudindose precipitar la protena. Objetivo 1. Estudiar diversos procedimientos de precipitacin de protenas 2. Obtencin de protenas aplicando diversos mtodos de precipitacin Materiales Y Mtodos 1. MUESTRAS Clara de huevo Clara de huevo diluida en agua (1:5) 2. MATERIALES 11 Tubos de ensaye 2 Pipetas de 5 ml 5 Pipetas de 1 ml 1 Gradilla 2 Vasos de precipitados de 400 ml 1 Bureta 1 Pinza para bureta 1 Agitador magntico 1 Termmetro 1 Buchner 1 matraz kitasato 3 Bases para caja petri 1 Esptula REACTIVOS Y EQUIPO Solucin de etanol al 90% Solucin de nitrato de plata al 5% Solucin de cloruro de mercurio al 5% Solucin de cido ctrico al 5% HCl concentrado Solucin saturada de sulfato de amonio Solucin de cloruro de sodio al 1% Reactivo de biuret Buffer pH 7 Estufa de vacio a 50C Potenciometro

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1 Probeta de 100 ml Papel filtro whatman # 4 1 Vaso de 4 1 Bolsa de dilisis Tela de algodn METODOLOGA 1. Agentes desnaturalizantes de protenas 1.1 Calor Colocar 5 ml de clara de huevo sin diluir en un tubo de ensaye y calentar en bao de agua en ebullicin durante 5 minutos. Enseguida enfriar y comparar el aspecto de la clara que fue calentada con el de la clara normal. Reportar las observaciones hechas. 1.2 Alcohol Colocar 5 ml de clara de huevo sin diluir en un tubo de ensaye. Transferir el tubo a un bao de hielo y dejarlo reposar durante 5 minutos. En seguida adicionar 5 ml de alcohol al 96%. Comparar con l aspecto de la clara normal. Reportar las observaciones hechas. 1.3 Metales pesados Colocar 1 ml de clara de huevo diluida en cada uno de dos tubos de ensaye. Adicionar a uno de ellos 5 gotas de nitrato de plata al 5% y al otro 5 gotas de cloruro de mercurio al 5%. Comparar el aspecto de la clara tratada con metales pesados con el de la clara normal. Reportar las observaciones hechas. 1.4 cidos orgnicos fuertes Colocar 1 ml de clara de huevo diluida en un tubo de ensaye y agregar 15 gotas de solucin diluida de cido pcrico al 5%. Comparar el aspecto de la clara tratada con cido pcrico con la clara normal. Reportar las observaciones hechas. 2. Precipitacin de protenas 2.1 Por cido y calor Verter 200 ml de leche descremada en un vaso de precipitados de 400 ml. Adicionar lentamente cido clorhdrico concentrado hasta alcanzar un pH de 4.5, agitando la mezcla leve, pero continuamente durante toda la adicin. Una vez alcanzado l pH, observar la apariencia de la leche. Posteriormente calentar la mezcla a 55C durante 10 minutos, y enseguida filtrar a travs de una tela de algodn perfectamente limpia. Guardar l precipitado, y l filtrado obtenido filtrarlo nuevamente a travs de papel filtro whatman # 4 usando vaco. Juntar los precipitados obtenidos y extenderlos en tantas cajas petri como sea necesario para despus secar la protena en la estufa de vaco a 50C. Una vez que el secado haya concluido, pesar la cantidad de protena obtenida y determinar el rendimiento. Reportar los resultados obtenidos y las observaciones hechas. 2.2 Por salting out

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Romper dos huevos y separar la clara vacindolo en un vaso de 400 ml. Agitar suavemente las claras para romper las membranas, evitando hasta donde sea posible la formacin de espuma. Medir la cantidad de clara obtenida haciendo uso de una probeta y posteriormente transferirla a un vaso de precipitados de 400 ml. Adicionar una cantidad igual de solucin saturada de sulfato de amonio, agitar suavemente y dejar reposar la mezcla durante 20 minutos. Transcurrido el periodo de reposo filtrar la mezcla a travs de una tela de algodn perfectamente limpia. Posteriormente disolver l precipitado obtenido en 250 ml de una solucin de NaCl al 1% para despus transferir la solucin a una bolsa de dilisis y dejar dializar durante un periodo de 10 a 24 horas en aproximadamente 3 litros de agua destilada. Transcurrido el periodo de dilisis, verter el contenido de la bolsa en un vaso de precipitados y tomar de ah una muestra para efectuar la prueba de Biuret.
Resultados

Reportar las observaciones hechas y los resultados obtenidos. Cuestionario 1. Describa que es el punto isoelctrico de una protena y como se calcula. 2. Cuales estructuras de las protenas se pierden durante su precipitacin isoelectrica 3. Porque las protenas forman precipitados en ciertas condiciones y geles en otras. Bibliografa 2. Clark, J: M: Bioqumica Experimental, Ed. Acribia, Espaa, (1966). 3. Daniels, J.L. y A. L. Neal, Laboratory Experiments in Biochemistry, Academic Prees. Inc. , N.Y., pp. 129-141, (1967). 4. Dotty, L.B. y M.J. Morten, Laboratory Instruments in Biochemistry, Mosby Co., pp 29-31 (1971).

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PRCTICA No. 7 CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE LIPIDOS Introduccin Para diferenciar la gran cantidad de lpidos que pueden encontrarse en alimentos y productos biolgicos, es necesario efectuar diversos anlisis fsico y qumicos. En esta prctica se efectuarn algunos representativos, como son: 1. El ndice de refraccin, determinacin sencilla y rpida que en trabajos de rutina permite identificar un compuesto o detectar adulteraciones, por comparacin con el ndice de refraccin del aceite o cido graso patrn, puro. 2. El ndice de acidez, que se define como la cantidad de mg de KOH necesarios para neutralizar la acidez libre de 1g. De muestra Si se conoce la frmula del cido graso se puede calcular fcilmente el ndice de acidez terico correspondiente al cido graso puro. Cuando se emplee NaOH en lugar de KOH para efectuar la titulacin, debe convenirse el resultado a su equivalente en KOH. Trabajando con NaOH de normalidad N, la frmula para calcular el ndice de acidez ser: a.= 40 N.V.56 = 56NV M.40 M 40 Es el peso molecular del NaOH. 56 Es el peso molecular de KOH. 56/40 Es el factor que permite convertir el peso de NaOH a peso de KOH. V Es el volumen en m1 de NaOH de normalidad N, requerido en la titulacin (restando el volumen que se gaste en el blanco). M Es el peso de muestra en gramos. El ndice de yodo sirve para determinar el grado de insaturacin de un cido graso o aceite, debido a que el yodo es absorbido nicamente en los dobles o triples enlaces. En este caso, se determinar nicamente en forma cualitativa, para saber si el compuesto tiene doble enlaces. El ndice de yodo se define como la cantidad de yodo, expresada en gramos, que absorben 100g de muestra.

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La formacin de los complejos de cidos grasos con urea, permite la obtencin de compuestos cristalinos fcilmente aislables, cuyo punto de fusin y forma de cristalizacin ayudan a la identificacin del cido graso. Para la identificacin del colesterol y otros esteroides, se han descrito varias reacciones sencillas como la de Salkowski y la de Liebermann- Burchard. El fundamento de estas reacciones es la formacin de derivados de los esteroides, cuando se tratan con cidos. El color y su intensidad varan segn el esteroide, el tipo de cido y la concentracin de ste. Objetivo El objetivo de la prctica es conocer algunas propiedades fsico qumicas representativas de los lpidos, sobre todo de los que se encuentran en los alimentos y en los productos biolgicos Materiales Y Mtodos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Aceite de oliva y de maz (20 m1). Acidos oleico, esterico y palmco ( 25 g de cada uno). Colesterol (1 gramo). Solucin de lugol (ver prcticas anterior). Anhdrido actico ( 10 m1). Acido sulfrico concentrado (10 m1). Solucin de almidn ( ver prctica anterior) Disolucin de urea en metanol: Pesar 3 g disolverlos en 20 m1 de metanol, calentando suavemente si es necesario. 9. Etanol neutralizado: A una muestra de 5 m1 de Etanol, agregue 5 gotas de indicador de fenolftaleina ( ver adelante) y neutralice con NaOH 0.1. N. Con el dato as obtenido, calcule cunto debe agregar a 100 m1 de Etanol. Mida 100 ml. de Etanol y agrguele el. 10. .NaOH 0.1 N: Medio litro; si no se prepara con disolucin comercial, titlence con HCI valorado. 11. -Disolucin indicadora de fenolftaleina al 1% en etanol al 75% 20m1. METODOLOGIA 1. Indice de refraccin. Determine el I. R. De un aceite vegetal, en el refractmetro de Abbe, y anote los siguientes datos: Tipo de refractmetro empleado-------------------------------------Longitud de onda--------------temperatura------------I.R. obtenido--------------Aceite Empleado-------------------I.R. indicado en tablas----------------------29

2. ndice de acidez. Pese exactamente una muestra entre 10 y 15 g de aceite de maz, sobre un vaso de precipitados o un matraz previamente tarado. Agregue 50 m1 de Etanol neutralizado. Introduzca el matraz en un bao de agua mantenimiento a 60C y titule, sin dejar de calentar, agregando 10 gotas de disolucin de fenolftaleina y poniendo en la bureta NaOH 0.1 N el cual se agrega hasta obtener color rosa resistente. Aplicando la frmula indicada en la Introduccin, calcule el ndice de acidez. 3. Formacin de complejos de cido grasos con urea. Disuelva 1 g de un cido graso en 5 m1 de disolucin de urea en metanol. ( Si el cido graso es slido, disulvalo en metanol, calentando suavemente). Agite intensamente y luego deje enfriar hasta cero grados en bao de hielo o en refrigerador. Filtre, seque los cristales y obsrvelos al microscopio. Determine su punto de fusin y dibuje los cristales . 4. Absorcin de yodo por cidos graso insaturados. Ponga en un tubo de ensayo 2 m1 de aceite de oliva o de cido olico.Agregue 5 gotas de lugol y agite. Esta mezcla debe ser rojiza, como la disolucin de yodo. Caliente a la flama y observe que el color va cambiando. Cuando el color inicial ha desaparecido totalmente, deje enfriar y agregue 10 gotas de disolucin de almidn se observar que no hay formacin del color azul lo cual indica que no hay yodo libre en la mezcla. Si se agreg lugol en exceso, aparecer el color azul, por haber sido incompleta la absorcin. 5. Identificacin del colesterol. a) Reaccin de Salkowski. En un tubo de ensayo perfectamente seco, ponga 100 mg aprox. De colesterol. Agregue 3 3m1 de cloroformo para disolverlo. Reparta esta disolucin en 2 tubos para efectuar, con la mitad, la reaccin siguiente: A uno de los tubos agregue 1 m1 de H2 SO4 concentrado, deslizndolo por las paredes, sin agitar. La capa superior y la inferior tomarn colores distintos. Observe el tubo de lado, contra un fondo semioscuro, para apreciar la fluorescencia. Anote lo observado. b) Reaccin de Liebermann. Agregue 5 gotas de anhdrido actico y dos gotas de H2SO4 concentrado, a la otra porcin de disolucin de colesterol en cloroformo. Mezcle suavemente y anote el color que adquiere inicialmente y los cambios que se van observando en el mismo. RESULTADOS 1. Indice de refraccin-----------Aceite empleado---------------2. Volumen de NaOH gastado--------------Normalidad: -------------Peso muestra-------Clculos efectuados: Indice de acidez: -------------3. Forma de los cristales: 4. Punto de fusin----------------------30

de

la

5. Reaccin de Salkowski: ------------------------------------6. Reaccin de Liebermann: -------------------------------------------------------------------------------------------------------Cuestionario 1. Calcule el ndice de acidez terico de cido graso empleado. 2. Calcule la cantidad de yodo absorbida por 2 m1 de aceite de oliva (o de cido oleico, si emple ste), midiendo el volumen de las 5 gotas que adicion y tomando en cuenta que la concentracin de yodo en g / m1 en el reactivo de lugol es 0.025. Asumir que la relacin es estequiomtrica y la adsorcin, total. 3. Escriba la frmula estructural del colesterol y su nombre qumico completo. 4. Defina el ndice de refraccin y haga una breve monografa sobre el mismo, relacionndolo en especial con la dispersin pticarotatoria y otras aplicaciones tiles en Bioqumica. Bibliografa Pierre Crabb, 1974 Actividad ptica, dispersin rotatoria ptica y dicroismo circular en qumica orgnica OEA, Washington ps.7-9. Mazur, B. Harrow, 1973 Bioqumica bsica 10 a ed. P. 322 Ed. Interamericana. Manuel Urquiza, 1969 Experimentos de fisicoqumica p. 127 y ss. Ed. Limusa- Wiley. Glasstone, 1968 Tratado de qumica fsica p. 477 y ss.Ed. Aguilar, S.A.

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PRCTICA No. 8 ESTABILIDAD DE ACEITES Introduccin Los lpidos constituyen uno de los 4 componentes bsicos de los alimentos, siendo la fuente ms concentrada de energa, adems de ser el grupo que tiene mayor influencia en textura, palatabilidad y que contribuye al aroma y sabor de muchos alimentos. Una clasificacin general de los lpidos se da en cuanto al estado fsico que presentan a una temperatura ambiente y su fuente. As estn las grasas, que son lpidos de origen animal y que, en su mayora, se encuentran slidos. Se tiene tambin a los aceites, que por lo general provienen de semillas vegetales y estn lquidos a temperatura ambiente. Las grasas y aceites estn formados por cidos grasos esterificados con un alcohol, el glicerol es el ms abundante. Debido a la longitud de la cadena Hidrocarbonada principalmente. A la existencia de dobles ligaduras en la misma, los aceites son muy susceptibles de sufrir cambios por ataque. Dichas ligaduras, presentando un fenmeno de deterioro que se traduce en formacin de aromas y sabores objetables a la calidad del aceite. Existen 3 mecanismos por los cuales pueden suceder las reacciones de deterioro de los lpidos: a) Rancidez hidroltica b) Rancidez oxidativa c) Reversin En todos los mecanismos de deterioro influyen de manera determinante factores fsicos, como temperatura, oxgeno, luz, presencia de metales, etc. Objetivos. Determinar la influencia de factores sobre la estabilidad qumica y sensorial de aceites. Materiales Y Mtodos
Aceite comestible de origen vegetal 1 litro

Matraces Erlenmeyer de 500 ml

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Matraces Erlenmeyer de 250 ml Bomba para pecera

1 1

Calentador elctrico 1 Termmetro 1 Balanza electrnica Bureta Refrigerador. Etanol neutralizado. Fenolftaleina 1% Solucin de KOH 0.02 N Metodologa. Calentar, por cuadruplicado, 150 ml de aceite hasta 200C. Retirar del mechero y dejar enfriar a temperatura ambiente. Los 250 ml restantes sern el control 2. A cada matraz someterlo a una de las siguientes condiciones: Matraz 1. 2. 3. 4. 5. Almacenar a temperatura ambiente oscuro (control 2) Someterlo a una oxigenacin constante Almacenar a temperatura ambiente con el matraz abierto o expuesto a la luz Almacenar en matraz abierto dentro del refrigerador Almacenar en matraz cerrado y a oscuridad (control 1)

Anotar los cambios que se observen desde el calentamiento y durante el almacenamiento en cuanto a olor, color y apariencia del aceite el tiempo de observacin es de 2 semanas, cada 3 das. Realizar la determinacin de acidez libre al control el martes y el viernes durante 15 das. Para determinar el ndice de acidez. Se pesan 5 g de muestra en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, se agregan 50 ml de alcohol previamente neutralizado a la fenolftaleina con KOH 0.02 N. Se calienta en bao Mara a ebullicin incipiente y se titula con NaOH 0.1N, usando fenolftaleina como indicador. Se debe agitar fuertemente despus de cada adicin del lcali para asegurar la completa neutralizacin de los cidos libres. El vire se presenta en una coloracin ligeramente rosa permanente por un minuto.

% cido olicos = (ml gastados x N x 0.0288 x 100 ) peso de la muestra

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RESULTADOS Da % acidez

Anlisis sensorial

Cuestionario. 1. Qu son los cidos grasos y como se presentan en los lpidos? 2. Cules son los cidos grasos ms abundantes? 3. Describa el mecanismo de la reaccin de la rancidez oxidativa 4. Por qu no es conveniente refrigerar los aceites 5. Qu mtodos analticos se utilizan para determinar la estabilidad de grasas y aceites? 6. Es el cambio de color de un aceite indicativo de la rancidez de aceites vegetales? Por qu? Bibliografa 1. Daniels, L: J. y Neal A. L. 1967. Laboratory Experiments in Biochemistry. Academic Press. N.Y. 2. Litwack, G. Experimental Biochemistry. 1967. John Wiley & Sons. N.Y. 3. Laguna, J. y Pia, E. 1979. Bioqumica. 3. Ed. La prensa Medica Mexicana. 4. Plummer, D. T. 1981. Introduccin a la Bioqumica Prctica. Mc Graw Hill Latinoamericana,

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