ESTUDIO TERICO-EXPERIMENTAL DEL CAMBIO DE ESCALA DE LA PRODUCCIN DE CIDO GIBERLICO POR EL HONGO Gibberella fujikuroi, EN BIORREACTORES DE TANQUE AGITADO

Por Edgar Honorato Snchez Resumen El cido giberlico (GA3) se produce a escala industrial por el hongo G. fujikuroi en biorreactores de tanque agitado en medios de cultivo con micelio libre y su produccin est influenciada considerablemente por las condiciones del cultivo; algunos de los factores importantes en la obtencin de altos rendimientos de GA3 incluyen el pH, la temperatura, el tiempo de incubacin, la optimizacin del medio de cultivo, aireacin y agitacin. En la parte experimental se va a trabajar a escala-piloto con las mejores condiciones que se han encontrado a escala-laboratorio para la produccin de GA3. En la parte terica del proyecto se va a utilizar la herramienta de CFD, especficamente el software Fluent, para simular en 3D la hidrodinmica de los biorreactores; el cual nos ayudar a obtener un mayor conocimiento y entendimiendo del bioproceso. El objetivo global es desarrollar una metodologa de trabajo experimental y terica que permita sistematizar el estudio de factibilidad tcnica-econmica del proceso de produccin de GA3 con base biotecnolgica, vinculando la investigacin del proceso a escala-laboratorio con la produccin a mayor escala. Dirigida por: Dr. Eleazar M. Escamilla Silva

1. Introduccin Las hormonas vegetales o fitohormonas son sustancias que existen en la naturaleza y permiten acelerar el crecimiento de las plantas, el proceso de floracin y el desarrollo del fruto. En Mxico el empleo de fitohormonas es muy conocido en el sector agrcola, ya sea en la produccin de hortalizas y frutas. Sin embargo, a pesar de ser un mercado amplio y de grandes beneficios econmicos, se estima que su empleo representa nicamente el 2% de la venta total de agroqumicos en el mbito nacional (Medina-Ortiz y Larque-Saavedra, 1999). Frente a este escenario y como respuesta a las necesidades de los agricultores mexicanos, en las ltimas dos decadas diferentes centros de investigacin e instituciones acadmicas de Mxico se han dado a la tarea de producir un tipo de fitohormonas, conocidas como giberelinas, especficamente el GA3, a partir del hongo filamentoso G. fujikuroi. El GA3 es una hormona vegetal que regula el crecimiento en las plantas (Karakoc y Aksz, 2006); el empleo de reguladores de crecimiento estimula la germinacin de las semillas, estimula la induccin de hojas y flores, acta en el amarre del fruto, aumenta el peso y tamao del fruto, intensifica el crecimiento de forrajes y pastos, mejora la calidad y rendimiento de la produccin y es efectivo en cualquier tipo de clima; se pueden utilizar en una amplia gama de cultivos tales como: hortalizas, frutales, ornamentales, granos y forrajes (Negrete-Rodrguez, 2002). Disear biorreactores agitados a escala industrial con el mismo rendimiento alcanzado a escala laboratorio representa un enorme desafo debido a los cambios continuos en la biorreaccin. El impacto que sufre el microorganismo en todo el proceso de biotransformacin es multifactico, en parte debido a su complejidad como entidad viviente y a la complejidad resultante de las condiciones dentro del biorreactor. En consecuencia, no existen modelos generales para el escalamiento de biorreacciones que puedan tener en cuenta
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la enorme diversidad de la biologa del microorganismo utilizado. Por lo tanto, el cambio de escala a nivel industrial depende de los resultados experimentales de plantas piloto y de laboratorio (Asenjo, 1995). 1.1 Escalamiento de biorreactores La aproximacin tradicional del escalamiento sta basada en la Teora de modelos y de los Principios de similitud (Diaz y Acevedo, 1999), en el cual dos procesos se pueden considerar totalmente similares si ocurren en un espacio geomtrico similar y si todos los nmeros adimensionales necesarios para describirlos tienen el mismo valor numrico (Zlokarnik, 2006). El escalamiento de biorreactores, de acuerdo con Galindo (1996) y Lonsane (1992), se define como el conjunto de tcnicas que conducen a predecir, con un riesgo mnimo, las condiciones bajo las que debe operar un equipo a cualquier otra escala, mayor o menor, con base a resultados experimentales en la escala disponible. El objetivo del escalamiento, por lo tanto, es reproducir los resultados de la escala disponible en la que se pretende, respetando un factor de escala y un principio de similitud, es decir, reproducir a una escala ms grande el comportamiento de una biorreaccin que se realiz y optimiz a una escala menor (Diaz y Acevedo, 1999). Adems, el escalamiento tiene como propsito seleccionar las condiciones de operacin y procedimientos de produccin que aseguren que el efecto de las diferentes variables sobre el proceso sern las mismas en unidades de diferente tamao. En la prctica se utilizan varios criterios para efectuar el cambio de escala, todos ellos basados en resultados experimentales, y de sta forma, existen relaciones que resumen los criterios empleados para el cambio de escala en tanques agitados por medios mecnicos y las relaciones entre variables de operacin y diseo (Quintero, 1990). El cambio de escala en
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biorreactores con geometra similar podra llevarse a cabo, en gran proporcin, en los casos en lo que se requiere en ambos sistemas igualdad de: (1) Potencia de agitacin por volumen (Pg/V), (2) Coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (KLa), (3) Estrs de agitacin mximo, (4) Tiempo de mezclado, entre otros. Los parmetros mencionados anteriormente estn relacionados unos con otros y tambin con las variables del sistema, pero en diferentes formas (Gouveia y otros, 2000; Cruz y otros, 1999; Metz y otros, 1979; Cooper y otros, 1944). Por lo tanto, se pueden obtener resultados diferentes para el mismo problema dependiendo del criterio empleado. Por esta razn, siempre se debe tratar de seleccionar como base de escalamiento, la propiedad de transporte que sea ms crtica para el desempeo eficiente del bioproceso (Ascenjo, 1995). Uno de los criterios de escalamiento de uso ms general en las biorreacciones aerobias es mantener constante el KLa. El razonamiento de esto es que el suministro de oxgeno para el crecimiento celular es generalmente la operacin limitante en los bioprocesos industriales. ste es el caso cuando la demanda de oxgeno es alta (rpido crecimiento de los microorganismos, altas concentraciones de masa celular) o cuando las caractersticas reolgicas del caldo ofrecen una alta resistencia a la transferencia de masa (Diaz y Acevedo, 1999). Adems, el criterio de mantener constante el KLa es para asegurar una cierta

capacidad de transferencia de oxgeno la cual puede hacer frente a la demanda de oxgeno del cultivo. Sin embargo, lo que realmente importa no es la capacidad de transferencia de oxgeno, sino la velocidad de transferencia de oxgeno, que es el producto del KLa y del potencial de la transferencia total de masa (CL* - CL) (Diaz y Acevedo, 1999). 1.2 Dinmica computacional de fluidos (CFD)

Hoy en da, el aumento contino en el poder de cmputo, los avances en los algoritmos numricos y el desarrollo comercial de software de CFD han generado un gran potencial para simulaciones tridimensionales ms exactas y eficientes. CFD es una herramienta de la ingeniera con gran aceptacin en el rea de ingeniera qumica en los ltimos aos (Kasat y otros, 2008; Vlachakis, 2006; Zhu y otros, 2006; Lu, 2004; Ranade, (2002); Deen, 2001; Michele, 2001; Zhu y Stokes, 1997; Bakker, 1992). En comparacin con los modelos semiempricos, CFD tiene como objetivo solucionar (completo o simplificado) las ecuaciones fundamentales (masa, momentum y energa) que describen un fenmeno de flujo. Cada vez ms se estn haciendo investigaciones para predecir simulaciones de biorreactores usando CFD, algunos ejemplos son los siguientes: Trgardh (1988) utiliz un modelo en 2D para predecir el proceso de la levadura en un tanque agitado, donde la fase de gas fue descrita por un modelo simplificado; Noorman (1993) simul un reactor agitado de 30 m3 con cuatro turbinas Rushton durante una fermentacin de Saccharomyces cerevisiae; Friberg (1998) simul, en 3D, un fermentador industrial de 30 m3 con cuatro turbinas Rushton utilizando el modelo Euleriano y un modelo de turbulencia - para la fase lquida modificado especficamente para tanques agitados. Utilizando los softwares Fluent y MixSim, Schtze y Hengstler (2006) simularon el escalamiento de un biorreactor de tanque agitado considerando la aproximacin marcos de referencia mltiple (MRF) para el impulsor, el modelo de Mezclado para el flujo gas-lquido, el modelo de turbulencia - y para la distribucin del tamao de burbujas un modelo de balance de poblacin con la formulacin del mtodo de cuadratura de momentos. Utilizando tambin Fluent, Elqotbi et al. (2006) simularon la produccin de cido glucnico por medio de la fermentacin aerobia del microorganismo Aspergillus niger basado en el modelo Euleriano y el modelo MRF obteniendo una buena aproximacin con los datos
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experimentales. Recientemente, Krishna-Bodla (2007) investig, utilizando Fluent, el potencial de escalamiento del proceso de fermentacin de tjido celular en cinco biorreactores diferentes de tanque agitado con mltiples impulsores y cinco estrategias de escalamiento; l encontr que mantener la misma tasa de disipacin turbulenta o la potencia de agitacin por unidad de volumen se obtienen los mismos valores de los parmetros operacionales a escalas mayores. 2. Metodologa El procedimiento de cambio de escala, tanto terico como experimental, se realizar sin guardar similitud geomtrica, pues en este caso se cuenta con el biorreactor escala-piloto. En la prctica es difcil mantener la geometra similar para realizar un escalamiento basado en mtodos de anlisis dimensional, adems, estudios han demostrado la ventaja de escalar sin obedecer a la similitud geomtrica (Quintero, 1990). Adems, cuando se tienen equipos dados y se pretende trasladar las condiciones de operacin de uno a otro (revoluciones por minuto, flujo de aire por minuto, potencia de agitacin por unidad de volumen), lo importante es establecer relaciones entre las variables que aseguren la similitud en el medio ambiente del microorganismo al cambiar de escala (Ju y Chase, 1992). 2.1 Metodologa Experimental Experimentalmente se realizar el cambio de escala para pasar de un biorreactor de tanque agitado escala-laboratorio con un volumen de cultivo de 4.0 L (BIOREACTOR 7L JACKETED applikon) a uno escala-piloto de 20.0 L (BIOREACTOR 30L PILOT SYSTEM applikon), es decir, escalar el volumen de medio de cultivo cinco veces. En la figura 1 se muestran los biorreactores que se utilizarn para el cambio de escala.

Aunque en el Laboratorio de Biotecnologa y Bioingeniera a cargo del Dr. Escamilla-Silva se ha investigado la produccin de GA3 por al menos 10 aos, en este proyecto se va a trabajar con las condiciones encontradas experimentalmente por Negrete-Rodrguez (2007) y FloresCano (2008) para producir la mayor cantidad de GA3. Negrete-Rodrguez (2007) obtuvo una produccin de 400 ppm con aire y Flores-Cano (2008) una produccin de 800 ppm con una relacin porcentual oxgeno/aire de 15/85 utilizando como fuente de carbono aceites

vegetales, una relacin inculo-medio de cultivo del 5%, flujo de aire de 1.0 vvm y un arreglo de 3 turbinas Rushton a 600 rpm.

Figura 1. Biorreactores de tanque agitado applikon escala-laboratorio (izquiera) y escalapiloto (derecha). Dado que generalmente en las biorreacciones aerobias desarrolladas a gran escala el mayor problema es el suministro suficiente de oxgeno, transferido desde la fase gaseosa en forma de burbujas, a los microorganismos; la mayora de las veces la magnitud que se mantiene constante en el escalamiento es el KLa (Asenjo, 1995). Puesto que el hongo G. fujikuroi es un microorganismo estrictamente aerobio y por la importancia que tiene la aireacin en el crecimiento del microorganismo y la produccin del metabolito secundario, el criterio de escalamiento principal ser el KLa.
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Para implementar sta estrategia de escalamiento, es necesario encontrar una correlacin entre el KLa y las variables de operacin, propiedades del fluido y variables geomtricas. Seleccionar una correlacin particular para el KLa significa asumir que la correlacin aplicar para cualquier condicin del proceso desarrollado y se debe tener en cuenta que el transporte de masa debe ser gobernado por el mismo mecanismo en todas las escalas (Hubbard et al., 1994). Aunque el criterio de escalamiento principal ser el KLa, se realizarn los clculos para otros criterios de escalamiento comnmente utilizados en biorreactores con el fin de comparar los resultados con los obtenidos para el KLa, entre estos criterios se encuentra la potencia de agitacin por volumen, velocidad tangencial, energa de disipacin. 2.2 Metodologa Terica En la parte terica del proyecto lo que se pretende es reproducir numricamente los resultados experimentales; se continuar utilizando la herramienta de CFD, especficamente Fluent (basado en el mtodo de volumen finito), para desarrollar la modelacin hidrodinmica de la produccin de GA3, tanto para la simulacin del biorreactor escala-laboratorio como para el de escala-piloto. La modelacin hidrodinmica, sta basada en los siguientes modelos tericos y/o correlaciones (Honorato, 2008): modelo Euleriano-Euleriano para el flujo lquido-gas, modelo MRF para la rotacin de los impulsores, modelo - para la turbulencia, modelo de balance de poblacin para la distribucin del dimetro de burbujas, transferencia de oxgeno gas-lquido (KLa terico y correlacionado), modelo de ley de la potencia para la reologa y las cinticas principales (Crecimiento del microorganismo, consumo de sustratos y produccin del metabolito) durante la produccin de GA3 por el hongo Gibberella fujikuroi. Como resultado de stas simulaciones sern obtenidos: los campos de velocidad lquido-gas, los perfiles de concentracin de oxgeno disuelto, de producto y de biomasa, el cambio en la
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reologa, la distribucin y dimetro de las burbujas, as como parmetros de operacin, tales como el consumo potencia y la capacidad de bombeo de los impulsores y el tiempo de mezclado. Tomando en cuenta los resultados obtenidos a escala-laboratorio, tanto experimentales como tericos, y el anlisis hecho por Krishna-Bodla (2007) para diferentes estrategias de escalamiento de biorreactores utilizando CFD y los algoritmos propuestos por Lu (2004), vese la figura 2, para el escalamiento de tanques agitados con mltiples impulsores; se harn las simulaciones con CFD del biorreactor escala-piloto y se usarn los resultados predichos por la simulacin, para trabajar y verificar experimentalmente en la escala-piloto y as de esta maner, desarrollar y establecer la metodologa para el el anlisis, optimizacin y escalamiento a un nivel mayor de produccin en biorreactores de tanque agitado.
Estrategia: <kLa> constante. Inicio Datos de entrada: Qs1, D/T, ns y <kLa> Suponer N Estimar la tasa de gas dispersado para el impulsor superior (Qsn/Qs1) Estimar la tasa de recirculacin del gas alrededor de cada impulsor (Qr/Qs)
Qsn, Qrn

Calcular la tasa de gasificacin total alrededor de cada impulsor (Qtn)

N, Qtn

Estimar el coeficiente de transferencia de masa alrededor de cada impulsor (<kLa>D)

(<kLa>D)

Calcular el <kLa>D total del sistema

<kLa>D,total = 1/n<kLa>D
NO

<kLa>D,total
SI Adaptado de Lu (2004)

Fin

Figura 2. Algoritmos para el escalamiento de tanques agitados con mltiples impulsores.

3. Objetivos
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El objetivo global del estudio terico-experimental del proyecto es lograr el cambio de escala, de laboratorio a piloto, de la produccin de GA3 en biorreactores de tanque agitado; al mantener como criterio de escalamiento el KLa constante. Como objetivos especficos a alcanzar con esta investigacin se cuentran: Generar un modelo y/o correlacin que represente la reologa del medio de cultivo durante el transcurso del bioproceso tomando en cuenta el crecimiento del microorganismo. Probar diferentes tcnicas anliticas para la determinacin experimental del KLa, as cmo tambin representar con un modelo y/o correlacin el comportamiento del KLa. Proponer los modelos cinticos que representen los consumos de sustratos de la fuente de carbono y nitrgeno. Controlar el porcentaje de oxgeno disuelto en el medio de cultivo. Profundizar en el conocimiento de CFD y sus aplicaciones en el rea de biotecnologa. 5. Referencias Asenjo, J.A. (1995). Bioreactor System Design, Volume 21, Biotechnology and Bioprocessing Series, CRC Press. Bakker, A. (1992). Hydrodynamic of Stirred Gas-Liquid Dispersions. Tesis doctoral, Delft University of Technology, The Netherlands. Cooper, C.M.; Fernstrom, G.A. y Miller, S.A. (1944). Performance of Agitated Gas-Liquid Contactors. Industrial & Engineering Chemistry, 36(6), pp. 504509. Cruz, A. J. G.; Silva, A. S.; Araujo, M. L.; Giordano, R. C. y Hokka, C. O. (1999). Estimation of the volumetric oxygen tranfer coefficient (KLa) from the gas balance and using a neural network technique. Brazilian Journal of Chemical Engineering, 16, pp. 179183. Deen, N. (2001). An Experimental and Computational Study of Fluid Dynamics in GasLiquid Chemical Reactors. Tesis doctoral, Aalborg University Esbjerg, Esbjerg, Denmark.
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