VII Congreso Nacional de Ciencia de los Alimentos y III Foro de Ciencia y Tecnologia de Alimentos

Guanajuato, Gto.
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Aislamiento y Deteccin de la Actividad Antimicrobiana de Bacterias cido
Lcticas (BAL) Aisladas de Quesos

Socorro Ramrez, Eva Ma. Santos, Armida Ziga, Alma Delia Romn, Marineth Ortiz,
Maribel Clavel, Aide Neria e Irais Snchez
Centro de Investigaciones Qumicas,Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo
Carr. Pachuca-Tulancingo, Km 4.5 Pachuca, Hgo. Tel. 01 771 7172000 ext. 6501 Fax:
ext. 6502. e-mail: iraiss@uaeh.edu.mx

Resumen
En el presente trabajo, se evalu la presencia de bacterias cido-lcticas (BAL) productoras
de bacteriocinas en 33 muestras de quesos elaborados artesanalmente en el Estado de
Hidalgo a travs del mtodo del botn, obteniendo as ms de 300 cepas. El espectro de
actividad de estas cepas fue evaluado tanto frente a bacterias Gram positivas como contra
Gram negativas. Las BAL fueron capaces de inhibir el crecimiento de varios de los
patgenos probados, siendo las cepas de Vibrio cholerae las ms sensibles, mientras que
Escherichia coli, Bacillus Citrobacter y Proteus fueron las ms resistentes, y destacando as
mismo la inhibicin contra Listeria monocytogenes. La actividad antimicrobiana de los
compuestos producidos por las bacterias cido lcticas (BAL) aisladas podran utilizarse
como un conservador potencial para inhibir el crecimiento de bacterias patgenas y
deterioradoras de alimentos, aunque para esto es necesario la realizacin de ms estudios
para caracterizarlas debidamente.

Abstract
A total of 300 lactic acid bacteria strains isolated from traditional made cheeses from
Hidalgo State were evaluated for the presence of bacteriocin-producing lactic acid bacteria
by de spot on the lawn assay. Some of them were able to inhibit the growth of various
pathogens. The inhibitory spectra of activity of these isolates were evaluated against Gram-
positive and Gram-negative bacteria. Vibrio cholerae strains was the most sensitive strains
tested, whereas Escherichia coli, Bacillus, Citrobacter y Proteus were the most resistant.
Listeria monocytogenes was also inhibited by some LAB strains. The antimicrobial activity of
the compounds produced by these LAB strains could be considered as a potential
preservator to inhibit the growth of foodborne pathogens and spoilage bacteria in foods,
although more studies are neccessary.



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Introduccin
Las bacterias lcticas (BAL), son un grupo de bacterias Gram-positivas que tienen en comn
caractersticas morfolgicas, metablicas y fisiolgicas (Axelsson, 1993).
La fermentacin de los alimentos por bacterias cido lcticas (BAL) es una de las formas
ms antiguas de conservacin usadas por el hombre. Incluidos en estos alimentos estn el
yogurt, muchas variedades de quesos, salsas, vegetales fermentados y productos de
panadera. Quiz lo ms significativo en estas fermentaciones es la conservacin de
alimentos perecederos resultante de la produccin de cido lctico y otros metabolitos tales
como cidos orgnicos, H
2
O
2
, diacetilo y bacteriocinas (Faras y col., 1994).
Las bacteriocinas son pptidos antimicrobianos son producidos por muchas especies
bacterianas que han generado un gran inters en su investigacin, debido principalmente a
las caractersticas de antagonismo que han presentado estos contra microorganismos
patgenos presentes en alimentos, a la demanda de los consumidores por la produccin de
alimentos menos procesados, y a la bioconservacin, es decir, el uso de bacterias lcticas,
sus productos metablicos o ambos, para mejorar la seguridad y calidad de los alimentos
que generalmente no son fermentados (Montville y Winkowski, 1997).
En el presente trabajo, se propuso la integracin de un banco de cepas de BAL con
actividad bacteriocinognica nativas de la regin, que puedan utilizarse como cultivos
iniciadores en la elaboracin de productos lcteos y que adicionalmente disminuyan los
riesgos de la presencia de patgenos o el deterioro en dichos productos.

Material y Mtodos
Aislamiento. A partir de 33 muestras de diferentes tipos de quesos elaborados
artesanalmente en diversos puntos del Estado de Hidalgo, se realiz el aislamiento de BAL.
Para ello, se tomaron 10 g de cada producto, se colocaron en diluyente de peptona agitando
manualmente hasta homogenizar la muestra y de esta se realizaron diluciones decimales,
las cuales se distribuyeron en placas de agar MRS y se incubaron durante 72 h a 25C. Tras
proceder al recuento de aquellas placas que presentaron entre 25 y 100 colonias, se
seleccionaron diez cepas en base a su morfologa, su reaccin frente a la oxidasa
(negativa), catalasa (negativa) y su comportamiento a la tincin de Gram (positiva).
Posteriormente, se confirm la pureza del cultivo por estra en agar MRS.
Espectro de actividad. El espectro antibacteriano de las bacteriocinas producidas por las
cepas aisladas se realiz en un medio slido utilizando el mtodo de botn (Lewus y col.
1991). Se obtuvo un cultivo puro de cada cepa en caldo MRS (de Man, Rogosa y Sharp) a
30C durante 18h. Un tubo con 10 mL del medio MRS (0.8% agar) sin glucosa, se coloc en
una caja de Petri, se dejo secar y se colocaron porciones (2 L) del cultivo de cada cepa


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pura. Las placas se incubaron a 30C durante 18h. Posteriormente se colocaron 8 mL del
mismo medio con 20 L del microorganismo indicador (10
6
-10
7
ufc/mL). Las cajas se
incubaron a la temperatura ptima de crecimiento de los indicadores durante 18h. El efecto
antibacteriano se detect por la presencia de halos de inhibicin alrededor de botones. Se
tomaron como positivas aquellas cepas en las que la zona de inhibicin alrededor de los
halos de inhibicin fueron mayores de 1 mm.

Resultados y Discusin
Se analiz un total de 33 muestras de diversos tipos de quesos y prosteriormente al
aislamiento, de cada una de ellas se tomaron 10 colonias. Se seleccionaron todas aquellas
colonias que presentaban las caractersticas de crecimiento en medio slido tpicas de las
BAL, adems de ser cocos o bacilos Gram positivos, catalasa y oxidasa negativas,
obteniendo as un total de 330 cepas (Tabla 1). De cada una de ellas, una vez purificadas se
procedi a evaluar el espectro de inhibicin por el mtodo antes descrito contra cepas de
bacterias patgenas tanto Gram positivas como Gram negativas (Tabla 2).
De las cepas de BAL, solo 96 (26.09%) mostraron actividad inhibitoria en agar MRS contra
al menos uno de los microorganismos probados.
Como era de esperar, se obtuvo una mayor cantidad de BAL de aquellos productos en los
cuales se utiliza un cultivo iniciador para su elaboracin tales como el queso Oaxaca y el
manchego, en contraste con aquellos productos en los que no se detectaron o se detectaron
pocas cepas como el cotija o el ranchero. Esto pudo deberse a que algunos de los quesos
no son adicionados de cultivos iniciadores, o bien a la concentracin de sal contenida en
estos productos (Tabla 3).
De acuerdo al los resultados, Vibrio cholerae fue el microorganismo ms sensible, ya que
el 26.06 % de las cepas de BAL analizadas lo inhibieron. Por el contrario, se observ
tambin la presencia de cepas resistentes como E. Coli, Citrobacter, Proteus y Bacillus,
en las cuales menos del 1 % de las BAL tuvieron un efecto inhibitorio (Tabla 4). Las
dems especies, mostraron tambin un bajo porcentaje de sensibilidad frente a las BAL
analizadas. Sin embargo, cabe sealar que, dentro de estas se encuentra Listeria
monocytogenes que, si bien fue inhibida solo por el 2.42 % de las cepas de BAL, el
grado de inhibicin mostrado frente a las cepas a las que result sensible es
considerable (halos entre 4 y 7 mm) y puesto que este patgeno ha sido de particular
inters en la salud pblica, debido a los diversos reportes de brotes de listeriosis por
alimentos y a la gravedad de los sntomas que esta enfermedad puede ocasionar, es
tambin de gran inters el realizar pruebas que nos lleven a la identificacin y
caracterizacin de la sustancia responsable de dicha inhibicin.


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Tabla 1. Origen de las cepas

No. Cepa Producto Origen
0101-0110 Queso Panela Mercado deTulancingo
0201-0210 Queso Oaxaca Mercado deTulancingo
0301-0302 Queso Canasto Mercado de Pachuca
0401-0412 Queso Doble Crema Mercado de Pachuca
0501-0510 Leche Mercado de Atotonilco
0601-0610 Queso Oaxaca Mercado de Actopan
0701-0710 Queso Panela San Miguel Regla
0801-0810 Queso Ranchero Pachuca
0901-0910 Queso Botanero Pachuca
1001-1010 Queso Manchego Pachuca
1101-1110 Queso Oaxaca Tulancingo
1201-1210 Queso Cotija Tehuacan Puebla
1301-1310 Queso Canasto Acatln
1401-1410 Queso Oaxaca Mercado deTulancingo
1501-1510 Queso Oaxaca Mercado de Actopan
1601-1610 Queso Oaxaca Los Tinos Mercado deTulancingo
1701-1710 Queso Oaxaca Ternera Acatln
1801-1810 Queso Oaxaca D Margonz Jaltepec
1901-1910 Queso Canasto Ciudad de Mxico
2001-.2010 Queso Molido Central de Abastos de Pachuca
2101-.2010 Queso Manchego D Margonz Jaltepec
2201-2210 Requesn Mercado deTulancingo
2301-2310 Queso Oaxaca Mercado deTulancingo
2401-2410 Queso Panela Huejutla
2501-2510 Queso Oaxaca Actopan
2601-2610 Queso Oaxaca Mercado de Actopan
2701-2710 Queso Panela Mercado de Actopan
2801-2810 Queso Oaxaca en Singuilucan
2901-2910 Queso Panela Mercado de Singuilucan
3001-3010 Queso Canasto Central de Abastos de Pachuca
3101-3110 Queso Oaxaca Mercado en Tezontepec de Aldama
3201-3210 Queso Oaxaca Tezontepec de Aldama
3301-3310 Queso Blanco Central de Abastos de Pachuca


Tabla 2. Cepas de prueba para la inhibicin por BAL

Gram negativas Gram positivas
Vibrio cholerae Staphylococcus aureus
Shigella Bacillus subtilis
Escherichia coli Listeria monocytogenes
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter aerogenes
Citrobacter freundii
Proteus
Salmonella




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Tabla 3. Cepas con actividad inhibitoria obtenidas de cada producto

Tipo de queso Numero de muestras Numero de cepas
Panela 5 15
Oaxaca 14 42
Canasta 4 3
Doble crema 1 4
Leche 1 6
Ranchero 1 1
Botanero 1 7
Manchego 2 10
Molido 1 1
Requesn 1 1
Blanco 1 6
Cotija 1 0


Tabla 4. Inhibicin de microorganismos por BAL
Microorganismo Cepas BAL que mostraron
actividad inhibitoria
Porcentaje
Vibrio cholerae 86 26.06
Shigella 7 2.12
Escherichia coli 1 0.30
Klebsiella pneumoniae 8 2.42
Enterobacter aerogenes 4 1.21
Citrobacter freundi 3 0.9
Proteus 3 0.9
Salmonella 6 1.81
Staphylococcus aureus 4 1.21
Bacillus subtilis 2 0.6
Listeria monocytogenes 8 2.42

Los resultados muestran que el 90 % de las muestras de queso analizadas contenan
BAL capaces de inhibir microorganismos patgenos, como Vibrio cholerae y Listeria
monocytogenes, logrndose as la recopilacin de un grupo de cepas, las cuales
posteriormente podrn ser debidamente caracterizadas, permitiendo a los productores de
alimentos fermentados del Estado de Hidalgo, la obtencin de cultivos iniciadores a bajo
costo, adems de que se podran utilizar dichas cepas en alimentos contra
microorganismos patgenos o deterioradores, disminuyendo el riesgo que implica la
presencia de estos tanto en la salud de los consumidores como en los costos de
produccin.


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Bibliografa
Axelsson, L.T. (1993). Lactic acid bacteria: classification and physiology. En: Lactic Acid
Bacteria. Salminen, S. y von Wright, A. (Eds). Marcel Dekker, Inc. Nueva York pp.1-
53.
Faras, M.E., de Ruiz Holgado, A.A.P. y Sesma, F. (1994). Bacteriocin production by
lactic acid bacteria isolated from regional cheeses: inhibition of foodborne
pathogens. J. Food Prot. 57: 1013-1015.
Lewus, C.B., Kaiser A. Y Montville, T.J. (1991). Inhibition of food-borne bacterial
pathogens by bacteriocins from lactic acid bacteria isolated from meat. Appl.
Environ. Microbiol. 57:1683-1688.
Montville, T.J. y Winkowski, K. (1997). Biologically based preservation systems and
probiotic bacteria. En: Food microbiology, fundamens and frontiers. Doyle, M.P.,
Beuchat, L.R. y Montville, T.J. (Eds). ASM Press, Washington, D.C. pp. 557-577.



Envio de memorIas: salcedo@dulcInea.ugto.mx y josebar@dulcInea.ugto.mx