Acta peditr. costarric v.13 n.2 San Jos abr.

1999

Mtodos moleculares para el desarrollo de vacunas

Fernando Garca La utilizacin de vacunas para el control de las enfermedades infecciosas ha tenido un gran xito para modificar los patrones de incidencia y mortalidad de la viruela, polio, sarampin, rubeola, tuberculosis, tos ferina, difteria, entre otras, y han tenido un mayor impacto en salud pblica que el tratamiento curativo con antimicrobianos de las enfermedades infecciosas. En este contexto, es esencial para el profesional en ciencias mdicas el conocer los principios que han llevado al desarrollo de las diferentes vacunas de uso actual en nuestra regin, as como las modernas estrategias que se siguen en la creacin de nuevas vacunas. El objetivo de esta presentacin es brindar una revisin general y concisa sobre las tcnicas clsicas y moleculares para el desarrollo de vacunas, considerando particularmente las vacunas activas (inmunizacin con antgenos), incluyendo vacunas vivas, vacunas no-vivas y vacunas de ADN. Por limitaciones de espacio, no se consideran los anticuerpos anti-idiotipos, la terapia gentica ni la inmunoterapia para la prevencin de enfermedades infecciosas. Vacunas vivas Una vacuna viva consiste de un microorganismo que se puede replicar por s mismo en el individuo o que puede infectar clulas y acta como un inmungeno sin causar la enfermedad natural. Las vacunas vivas usualmente producen tanto inmunidad humoral como celular. Algunas vacunas vivas se acercan al concepto de una vacuna ideal, por cuanto pueden producir una proteccin duradera con pocos efectos secundarios usando una o dos dosis. La vacuna viva es atenuada, lo cual significa que su capacidad de causar enfermedad ha sido virtualmente eliminada en aquellos individuos inmunocompentes para quienes la vacuna ha sido diseada. Un aspecto importante a considerar es que los microoganismos atenuados pueden ser transmitidos a otros individuos no vacunados e incluso a individuos con algn tipo de compromiso inmunolgico, en quienes eventualmente pueden causar enfermedad. Aunque estas propiedades de las vacunas vivas hacen parecer deseable que todas las vacunas sean de este tipo, esto no es tcnicamente posible para la mayora de las vacunas que se desarrollan actualmente. Particularmente, existen dos problemas fundamentales en la atenuacin de microorganismos. La primera dificultad radica en el mecanismo de atenuacin del microorganismo, es decir, como hacerle perder su patogenicidad, sin que pierda las capacidades de multiplicarse en el hospedero y de producir una respuesta inmune apropiada. La segunda dificultad consiste en cmo lograr la estabilidad de la atenuacin, debido a que los microorganismos mantienen su capacidad de multiplicacin y pueden eventualmente revertir a la forma virulenta. Tcnicas clsicas de atenuacin Las tcnicas clsicas de atenuacin son aquellas que no utilizan la metodologa del ADN recombinante. Existen cuatro tcnicas de atenuacin de agentes virales. La primera tcnica consiste en la atenuacin mediante pasajes seriados en cultivos de clulas para seleccionar las variantes menos virulentas. Aunque no se conocen con exactitud los mecanismos por los cuales se introducen las mutaciones durante la replicacin viral, empricamente se ha logrado obtener una serie de vacunas virales atenuadas con demostrada eficacia, incluyendo las vacunas para polio, paperas, sarampin, rubela y varicela (2, 10, 31, 38, 42). Una segunda tcnica consiste en utilizar virus homlogos causantes de enfermedades veterinarias similares a las observadas en seres humanos. Se asume que el virus animal estar naturalmente atenuado para el ser humano pero estar inmunolgicamente relacionado, de manera suficiente, con el virus humano

de forma que producir una respuesta inmunolgica apropiada. Tal es el caso del virus vaccinia, de origen bovino, el cual fue utilizado exitosamente para la erradicacin de la viruela (18). Otros virus que estn siendo actualmente analizados en estudios clnicos mediante esta estrategia son los rotavirus (3). La tercera tcnica consiste en generar virus con un genoma reordenado derivado de una coinfeccin de dos virus diferentes en un cultivo celular. El virus resultante contiene en su genoma segmentos de los dos virus paternales. Esta tcnica se ha utilizado en rotavirus de origen animal, los cuales mantienen la mayor parte de su genoma as como un gen de rotavirus humano que codifica para una protena de superficie, la cual genera anticuerpos neutralizantes serotipo-especficos para el rotavirus humano (4, 36). Esta estrategia tambin se ha utilizado para generar variantes de virus influenza atenuados conteniendo genes de virus influenza virulento (26). Ambos casos estn actualmente bajo evaluacin en estudios clnicos. La cuarta tcnica consiste en obtener mutantes virales que son incapaces de crecer a temperaturas superiores a 37C (temperature-sensitive, ts) o que pueden crecer a temperaturas ms bajas [p. ej. 25C] (cold-adapted, ca). Se asume que los virus ts o ca son menos vigorosos en su crecimiento y, por lo tanto, atenuados. Por ejemplo, una vacuna influenza ts ha sido utilizada ampliamente en Rusia (13) mientras que una vacuna del virus respiratorio sincicial conteniendo dos diferentes mutaciones ts ha sido probada en estudios clnicos (27). Existen dos ejemplos clsicos de vacunas bacterianas atenuadas. La primera de ellas es la cepa de Mycobacterium bovis atenuada, conocida como bacilo de Calmette-Gurin (BCG), la cual fue atenuada mediante 231 pasajes sucesivos por subcultivo durante un perodo de 13 aos (17). Actualmente existen muchas cepas de BCG disponibles mundialmente, todas ellas derivadas de la cepa original. Las diversas vacunas BCG varan en trminos de tolerabilidad, inmunogenicidad y la eficacia de proteccin (0 a 80% de proteccin). La otra es la cepa Salmonella typhi Ty2la, la cual fue atenuada mediante mutagnesis qumica y posterior seleccin por su baja virulencia. Esta vacuna ha sido utilizada para la prevencin de la fiebre tifoidea con una eficacia de proteccin de 60-70% con un regmen de tres o cuatro dosis (12). Tcnicas recombinantes de atenuacin Las tcnicas de ADN recombinante pueden ser aplicadas en diferentes procesos durante el desarrollo de vacunas: La primera aplicacin de estas tcnicas consiste en manipular el material gentico de los microorganismos para introducir mutaciones y aumentar as la estabilidad de la atenuacin, de manera que la probabilidad de una reversin sea nula o muy baja. Estas mutaciones en bacterias son generalmente inserciones de transposones (Tn) o deleciones ( ) que inactivan o remueven porciones de genes, respectivamente, involucrados en procesos metablicos o que codifican para factores de virulencia. Por ejemplo, las mutaciones aroA, asd o cya::Tn10, individualmente o en combinacin, disminuyen la virulencia de algunos grupos de Enterobacteriaceae, como Salmonella o Shigella, sin afectar la produccin de inmungenos7 La segunda tcnica consiste en construir microorganismos recombinantes utilizados como vectores para la expresin de inmungenos (protenas o pptidos heterlogos) derivados de otros microorganismos. El virus vaccinia ha sido utilizado como vector para expresar protenas provenientes de otros virus, incluyendo, por ejemplo, la glicoprotena principal (gp120) del virus de inmunodeficiencia humana 1 (HIV-1) (30) Este tipo de vacuna, basada en el virus vaccinia o en otros virus como adenovirus, polio y varicella-zoster, se encuentra actualmente en evaluacin preclnica o clnica. Asmismo, cepas atenuadas de Salmonella typhi, Shigella flexneri, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes e incluso BCG son utilizadas como vectores recombinantes para expresar polipptidos de origen bacteriano o viral (1, 15, 29, 40). Vacunas no-vivas Las vacunas no-vivas se caracterizan por su incapacidad de multiplicarse en el individuo o en clulas y, por lo tanto, no pueden revertir -en el caso de microorganismos- su patogenicidad, tienen menos efectos adversos en el individuo, no se transmiten de persona a persona y, por lo

general, son tcnicamente ms factibles. Las vacunas no-vivas pueden consistir de microorganismos enteros (bacterias o virus) que han sido inactivados para hacerlos no-viables, o de componentes celulares purificados o producidos mediante tcnicas de ADN recombinante. En ciertos casos, estos componentes son asociados a otros para aumentar su inmunogenicidad. Microorganismos inactivados La utilizacin de microorganismos completos inactivados qumicamente o por calor pretende generar una respuesta inmune humoral contra muchos componentes, de manera que algunos anticuerpos logren neutralizar el patgeno. As, las bacterias son cultivadas en grandes cantidades, recolectadas y posteriormente inactivadas por calor o mediante el uso de sustancias qumicas como fenol o timerosal. Debido a que este tipo de vacunas son preparaciones muy crudas, se pueden observar muchos efectos adversos cuando se aplican parenteralmente, aunque algunas son bien toleradas por ruta oral. Algunas vacunas preparadas de esta manera incluyen el componente pertussis de la DPT y vacunas de Vibrio cholerae y de cepas enterotoxignicas de Escherichia coli (5, 9, 41). Los virus cultivados en clulas son recolectados de los sobrenadantes y purificados mediante tcnicas sencillas de precipitacin y cromatografa. Tal procedimiento se sigue para los virus polio, influenza y rabia, por ejemplo (6, 28, 32). En el caso del virus de la hepatitis A, las clulas son lisadas y las partculas virales son posteriormente purificadas (33). Las partculas virales son luego qumicamente inactivadas, usualmente con fenol, y se les aade una sal de aluminio como adyuvante. Componentes purificados: protenas, pptidos y polisacridos El desarrollo de una vacuna basada en componentes purificados, particularmente protenas y pptidos, es la estrategia de escogencia para muchos patgenos microbianos. Esta estrategia consiste en identificar epitopos protectores y sus correspondientes protenas, las cuales son entonces purificadas, en muchos casos inactivadas y posteriormente utilizadas como inmungenos. Alternativamente, con base a la disponibilidad de secuencias de genomas microbianos, es posible deducir la secuencia de aminocidos de protenas e identificar aquellas que estn localizadas en la superficie del microorganismo o que tengan algn posible efecto txico en clulas o en individuos. Los correspondientes genes pueden ser expresados en microorganismos (tpicamente Escherichia coli) y las protenas purificadas y analizadas por sus propiedades inmunognicas. Igualmente se pueden identificar pptidos inmunognicos, los cuales pueden ser sintetizados in vitro y posteriormente utilizados en vacunas. La primera vacuna contra el virus de la hepatitis B (HBV) utilizaba el antgeno de superficie (HBsAg) purificado a partir de plasma obtenido de pacientes portadores crnicos del virus. Una vez purificado, la preparacin era inactivada qumicamente para matar el HBV o cualquier otro virus humano presente (19). Las protenas bacterianas, principalmente toxinas como pertussis, tetnica y diftrica, pueden ser purificadas a partir de cultivos e inactivadas mediante tratamiento con sustancias qumicas como formalina o glutaraldehdo para producir los toxoides PT, TT y DT, respectivamente (20, 34) PT, combinada con otros antgenos pertussis naturales constituyen las vacunas pertussis acelulares (Pac) (8). Alternativamente a la inactivacin qumica, las protenas pueden ser inactivadas genticamente mediante la introduccin de mutaciones en sitios especficos en sus correspondientes genes, de manera que se bloquea irreversiblemente la actividad enzimtica de las toxinas sin alterar significativamente su estructura tridimensional, manteniendo as sus propiedades inmunognicas. Por ejemplo, se ha generado un toxoide diftrico que contiene una sustitucin de un solo aminocido en su cadena polipeptdica, la cual provoca la prdida de la actividad de ADP-ribosiltransferasa (14). Este toxoide gentico, denominado CRM197, tambin se utiliza para conjugar el polisacrido de Haemophilus influenzae tipo b.

Muchas bacterias estn recubiertas por una cpsula de polisacridos. En la mayora de los casos, anticuerpos dirigidos contra estos polisacridos capsulares son protectores contra la infeccin bacteriana. Los polisacridos capsulares estn formados hasta por cientos de unidades repetitivas que difieren segn la especie bacteriana y los grupos antignicos (serotipos). Las unidades repetitivas estn constituidas por monosacridos, grupos fosfatos y otras molculas orgnicas. Estos polisacridos han sido utilizados como inmungenos en los casos de Haemophilus influenzae tipo b (Hib), Neisseria meningitidis (4 serotipos) y Streptococcus pneumoniae (23 serotipos) (16, 21, 37). La principal desventaja de estas vacunas es que los polisacridos, siendo antgenos T-independientes, son poco inmunognicos en nios menores de 2 aos debido a su sistema inmunolgico inmaduro, adems que no producen una respuesta de memoria en nios mayores y en adultos. Por tal motivo, los polisacridos capsulares han sido qumicamente conjugados con protenas acarreadoras para convertirlos en antgenos Tdependientes, los cuales pueden producir una respuesta humoral protectora y clulas de memoria. As, se han desarrollado cuatro vacunas Hib conjugadas, cada una con diferentes protenas acarreadoras (TT, DT, CRM197 y una protena de membrana externa de N. meningitidis tipo b)(24). En el caso de S. pneumoniae, se han diseado vacunas de uso peditrico que incluyen mezclas de hasta once polisacridos conjugados, las cuales estn actualmente en evaluacin clnica (23). Vacunas de ADN Una nueva estrategia ha sido el utilizar molculas de ADN, que codifican para un antgeno microbiano, las cuales son utilizadas en vacunacin. El objetivo es transformar las clulas con este ADN, el cual es incorporado en la clula que sintetiza entonces el antgeno. El antgeno puede ser secretario o puede ser localizado en la superficie de la clula, de manera que pueda producir una respuesta inmune, sea humoral, celular o de los dos tipos. Las molculas de ADN deben contener, adems de los genes de inters, todas aquellas secuencias necesarias para que pueda ocurrir la transcripcin. Adicionalmente, los dinucletidos CpG presentes en la secuencia de ADN inducen proliferacin de clulas B y la secrecin de inmunoglobulinas (25). Existen tres estrategias para lograr la internalizacin del ADN. Una estrategia consiste en inyectar intramuscularmente una solucin del ADN desnudo (43). Las clulas lo incorporan, transcriben la informacin y sintetizan el antgeno, de manera similar a como ocurre durante una infeccin viral. La segunda estrategia es el ADN facilitado, el cual consiste en recubrir el ADN con lpidos catinicos para neutralizar la carga y facilitar la internalizacin del AND (35). La ltima estrategia consiste en incluir el ADN en un microorganismo vector que infecte la clula y, una vez dentro. libere el ADN. Los microorganismos que son utilizados como vectores deben tener la capacidad de introducirse en la clula y liberar el ADN pero sin multiplicarse intracelularmente. Algunos virus han sido utilizados para tal propsito, incluyendo fowlpox virus o canarypox virus, en los cuales los genes de inters se incorporan en su genoma (11, 22). Por otra parte, cepas de Shigella flexneri asd, las cuales requieren de cido diaminopimlico (ADP) para su multiplicacin, se utilizan como vectores para plsmidos conteniendo los genes que codifican para los antgenos. Una vez que la bacteria ha llegado al citoplasma de la clula, deja de multiplicarse (debido a la ausencia de ADP en el citoplasma) y sufre lisis, liberando el plsmido en el citoplasma