VALIDACIN DE MTODOS DE MEDICIN

Ponente: Ing. Rocio E. Corts Coln

Objetivo: Dar a conocer a los participantes los lineamientos generales para realizar una validacin de mtodos de medicin, que incluye los tipos de validacin y parmetros de validacin por tcnica analtica.

 CONTENIDO
Definicin de Validacin de mtodos. Objetivos de la validacin de mtodos. Alcance de la validacin de mtodos. Parmetros de validacin de mtodos para las tcnicas analticas de: Espectrofotometra Ultravioleta-visible Espectrofotometra de Absorcin Atmica e ICP Cromatografa de gases y cromatografa de lquidos Mtodos volumtricos Mtodos de gravimetra de masa Medicin de pH Medicin de conductividad.

 Definicin: La validacin es la confirmacin por examen y la provisin de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para un uso especfico propuesto.
NMXEC17025IMNC2006, Requisito 5.4.5.1

Alcance de la validacin de mtodos.

METODOS NORMALIZADOS
(ASTM, EPA, SM, AOAC, NMX, NOM, FDA, etc.)

VALIDACION PARCIAL

METODOS NO NORMALIZADOS
(Mtodos desarrollados por

el laboratorio, modificados, de revistas cientficas, etc.)

VALIDACION TOTAL

VALIDACION PARCIAL Tambin se conoce como: PRUEBA INICIAL DE DESEMPEO CONFIRMACION DEL METODO

Parmetros recomendados para la validacin:

Recuperacin Sensibilidad Selectividad Robustez Lmite de deteccin. Lmite cuantificacin Intervalo lineal y de trabajo Reproducibilidad Repetibilidad Sesgo (evaluado a partir de la recuperacin) Incertidumbre.
Guas Tcnicas sobre trazabilidad e incertidumbre en las mediciones analticas.

Espectrofotometra y Cromatografa
PARAMETRO
RECUPERACION SENSIBILIDAD SELECTIVIDAD ROBUSTEZ LIMITE DE DETECCION LIMITE DE CUANTIFICACION Y LIMITE PRACTICO DE CUANTIFICACION INTERVALO LINEAL Y DE TRABAJO REPRODUCIBILIDAD REPETIBILIDAD SESGO (En algunos casos se evala a partir de la Recuperacin) INCERTIDUMBRE

VALIDACION VALIDACION COMPLETA PARCIAL

Volumetra y gravimetra
PARAMETRO
RECUPERACION SENSIBILIDAD SELECTIVIDAD ROBUSTEZ LIMITE DE DETECCION LIMITE DE CUANTIFICACION CANTIDAD MINIMA CUANTIFICABLE INTERVALO DE TRABAJO REPRODUCIBILIDAD REPETIBILIDAD SESGO (En algunos casos se evala a partir de la Recuperacin) INCERTIDUMBRE

VALIDACION VALIDACION COMPLETA PARCIAL

pH y conductividad
PARAMETRO
RECUPERACION SENSIBILIDAD SELECTIVIDAD ROBUSTEZ LIMITE DE DETECCION LIMITE DE CUANTIFICACION INTERVALO LINEAL Y DE TRABAJO REPRODUCIBILIDAD REPETIBILIDAD SESGO (En algunos casos se evala a partir de la Recuperacin) INCERTIDUMBRE

VALIDACION COMPLETA

VALIDACION PARCIAL

CONDUCTIVIDAD Intervalo lineal pH Intervalo de trabajo

Evaluacin de los parmetros de validacin de mtodos

Recuperacin (recobro)
Proporcin de la cantidad de analito, presente en la porcin de la muestra adicionado a sta, que es cuantificada por el mtodo de ensayo.
(Harmonised Guidelines for the use of recovery information in Analytical measurement 1999)

Normalmente se utiliza para evaluar la recuperacin en porcentaje (% de recuperacin) del analito presente o agregado a una muestra de control de calidad, evala la eficiencia de extraccin, proceso de preparacin o interferencias que pueden existir al aplicar el mtodo de ensayo.

Recuperacin (recobro)

La fraccin de analito adicionada a una muestra de prueba (fortificada o con spike) previa al anlisis, el porcentaje de recuperacin (% R) se calcula de la siguiente manera:
%R = ((CFCU)/CA) * 100

donde: CF = Concentracin del analito medida en la muestra fortificada CU = Concentracin de analito medida en la muestra sin fortificar CA = Concentracin de analito adicionada.
(AOACPVMC)

Recuperacin (recobro)
Qu hacer? Cuntas veces? Calcular/ Determinar Comentarios

Blancos de matriz o muestras fortificadas con el analito de inters en un intervalo de concentraciones. con MR

10

Determinar la recuperacin del analito a varios niveles de concentracin. %R

El criterio de aceptacin est en funcin de lo establecido en el mtodo en la tcnica analtica.

Sensibilidad
El cambio en la respuesta de un instrumento dividido por el correspondiente cambio del estmulo (seal de entrada).
(IUPAC Orange Book)

El estmulo puede ser por ejemplo: la cantidad del mensurando presente. La sensibilidad puede depender del valor de estmulo. Aunque esta definicin se aplica claramente al instrumento de medicin, tambin puede aplicarse al mtodo analtico en conjunto, tomando en cuenta otros factores como el efecto de los pasos para una concentracin.

Sensibilidad
Es la pendiente de la curva de calibracin.
(Cuando es mayor la pendiente, el mtodo es ms sensible)
CURVA DE CALIBRACION
0.50 ABSORBANCIA 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 -0.10 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.60 ABSORBANCIA 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0.0 0.1 0.2 0.3 CONCENTRACION 0.4 0.5 0.6

y = 0.8x - 0.0167 R = 0.9882

2

= 720 nm
CURVA DE CALIBRACION y = 1.0326x + 0.0152
R2 = 0.9961

CONCENTRACION

= 460 nm

Selectividad o especificidad)
La capacidad de un mtodo para determinar exactamente y especficamente el analito de inters en la presencia de otros componentes en la matriz bajo condiciones de prueba establecidas.
(NATA Tech Note # 13)

La seal producida en la etapa de medicin o cualquier propiedad medida, es debida nicamente al analito y no a la presencia de algo qumico o fsicamente similar al resultado de una coincidencia. Esta es la confirmacin de la identidad. Las interferencias presentes pueden arrojar falsos positivos falsos negativos.

Selectividad o especificidad)

La selectividad de un mtodo se puede investigar estudiando su capacidad al medir el analito comparando con otros mtodos tcnicas independientes. Se debe considerar cuando el analito puede existir en la muestra en ms de una forma, tal como: ligado desligado, inorgnico organometlico, o en diferentes estados de oxidacin.

Selectividad o especificidad)
Qu hace? Cuntas veces? Calcular/ Determinar Comentarios

Anlisis de muestra y MRC, mediante mtodos candidatos y otros mtodos independientes. Anlisis de muestras conteniendo varias interferencias sospechadas en la presencia del analito de inters

Use los resultados de la tcnicas confirmatorias para asegurar la habilidad del mtodo para confirmar la identidad del analito y su habilidad para medirlo solo de otras interferencias. Examine el efecto de las interferencias. La presencia de la interferencia incrementa inhibe la deteccin o cuantificacin del mensurando?

Decidir que tanta evidencia de apoyo es razonable para dar suficiente confiabilidad. Si la deteccin cuantificacin se inhiben por las interferencias, se requiere desarrollar ms el mtodo.

Robustez
La robustez de un procedimiento analtico, es una medida de su capacidad de permanecer inalterado por pequeas, pero deliberadas, variaciones en los parmetros del mtodo y proporciona una indicacin de su confiabilidad durante su uso normal.
(ICH Q2A, CPMP/ICH/381/95)

Robustez
Qu se analiza?
Identificar la variables las cuales pueden tener un efecto significativo en el desempeo del mtodo. Establecer experimentos (analizando materiales de referencia, muestras de composicin conocida o MRC) para monitorear el efecto en la exactitud y en la precisin del cambio sistemtico de las variables.
Rplicas

Qu calcular de los datos?

Comentarios

Analizar una vez cada grupo de condiciones experimentales

Determinar el efecto de cada cambio de las condiciones sobre la media.

Designar el control de calidad para controlar las variables crticas.

Ordene las variables en orden del mayor Concentrarse en al menor efecto en el estas variables para desempeo del mejorar el mtodo. mtodo.

Robustez
Diseo factorial de dos niveles con tres factores (2 x 2 x 2 ). EXPERIMENTO 1 p (cambio de solventes) t (tiempo de agitacin) h (conc. de reactivos) pt ph th pth + + + + + + + + + + + + A B C

Robustez
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 p t h pt ph th pth
Tolueno mg/L

Valor de referencia

Lmite de deteccin
La menor concentracin del analito en una muestra, que puede detectarse, pero no necesariamente cuantificarse bajo las condiciones establecidas de la prueba.
(NATA Tech Note # 13, Eurachem The fitness for purpose of Analytical Methods 1998)

Cuando las mediciones se realizan para niveles bajos del analito o sus propiedades, por ejemplo en anlisis de trazas, es importante conocer cual es la concentracin ms pequea del analito o el valor de propiedad que puede ser confiablemente detectada por el mtodo.

Lmite de deteccin
El mnimo contenido que puede medirse con una incertidumbre estadstica razonable
AOACPVMC

XL = Xbl + kSbl

Xbl = media de las mediciones del blanco k = Factor numrico de acuerdo al nivel de confianza
deseado, puede ser 3 segn Gua de Eurachem 4,5 segn pruebas de hiptesis. Sbl = desviacin estndar de las mediciones del blanco

Lmite de deteccin
Qu se analiza?
a) 10 muestras de blancos independientes, medidos cada uno a la vez.

Qu calcular de los resultados?

Desviacin estndar de la muestra (s), de: a) blancos b) valores del blanco fortificado. Exprese el Lmite de deteccin correspondiente:

b) 10 blancos independientes fortificados a la menor concentracin aceptable, medidos cada uno a la vez.

El inciso a) solo es til cuando el blanco da una desviacin estndar diferente de cero.

a) La media del valor del blanco + 3s, b) b) 0 + 3s

Lmite de cuantificacin
Es la concentracin ms baja del analito que puede determinarse con un nivel de incertidumbre aceptable.
(Eurachem Guide to quality in Analytical Chemestry)

(El contenido) igual o mayor que el menor punto de concentracin en la curva de calibracin.
AOAC PVMC

La menor concentracin de un analito que

puede ser determinada con una precisin aceptable (repetibilidad) y exactitud bajo las condiciones establecidas de la prueba.
NATA Tech Note #13

Lmite de cuantificacin
Lmite de Cuantificacin
25 20 C U EN TA S 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 14

Lmite de cuantificacin
xL = xbl + ksbl
Donde:
xbl = La media de las mediciones del blanco sbl = La desviacin estndar de las mediciones del blanco k = Es un factor numrico elegido de acuerdo al nivel de confianza deseado, siendo k= 5, 6 10

Lmite de cuantificacin
Qu se analiza?
a) 10 muestras de blancos independientes, medidos cada uno a la vez.

Qu calcular de los resultados?

Desviacin estndar de la muestra (s), blancos Exprese el Lmite de cuantificacin mediante: La media del valor del blanco + 5s, 6s 10s. ============================== Desviacin estndar de la muestra (s), de los valores del analito a cada concentracin. Graficar s contra la concentracin y asignar un valor al lmite de cuantificacin mediante inspeccin. Lmite de cuantificacin se expresa como la concentracin mnima del analito que puede ser cuantificada con un nivel aceptable de incertidumbre

============================== b) 10 blancos independientes fortificados a varias concentraciones del analito cercanas al lmite de deteccin del mtodo. Medir una vez, 10 rplicas independientes a cada nivel de concentracin.

Intervalo lineal y de trabajo

En anlisis cuantitativo el intervalo de trabajo es obtenido a travs de la medicin de muestras con diferente concentracin del analito, y seleccionando el intervalo de concentracin que proporciona un nivel de incertidumbre aceptable.
(CITAC/ EURACHEM Guide to Quality in Analytical Chemestry; Eurachem The fitness for purpose of Analytical Methods 1998)

Dentro del intervalo de trabajo puede existir un intervalo de respuesta lineal. Dentro de ste intervalo lineal de respuesta habr una relacin lineal con la concentracin del analito. El intervalo de trabajo es generalmente ms amplio que el intervalo lineal y puede establecerse durante la evaluacin del intervalo de trabajo. El intervalo de trabajo se refiere al intervalo de valores de concentracin en las disoluciones que se miden realmente y no a la concentracin en la muestra original.

Intervalo lineal y de trabajo

CURVA DE CALIBRACION 0.45 0.4 ABSORBANCIA 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 -0.05 0 0.5 1 1.5 2 2.5 CONCENTRACION (m g/L) y = 0.2159x - 0.0223 R2 = 0.9774

Intervalo lineal y de trabajo

Q u s e a n a liz a ?
1 .-B lanc o m s e l m ate rial d e refe re nc ia los b lanc os de m ue s tra fo rtif ic ad os a varias c o nc e ntrac io nes . A l m e nos 6 c o nc e ntrac io nes m s e l b lanc o .
R p lica s

Q u c a lc u la r d e lo s d a to s ?
G raf iq ue la res p ues ta d e m ed ic i n, (e je y) c o ntra la c o nc e ntrac i n m e d id a (e je x). V is ualm e nte e xam ine p ara id e ntif ic ar e l inte rvalo line al y lo s l m ites infe rio r y s upe rio r de l inte rvalo d e trab ajo . C o ntinuar 2. G raf iq ue la res p ues ta d e m ed ic i n, (e je y) c o ntra la c o nc e ntrac i n m e d id a (e je x). V is ualm e nte e xam ine lo s p unto s e xtre m o s los c uale s p ue de n no re f le jars e e n la re g re s i n. C alc ule e l coefic ie nte de c o rre lac i n. C alc ule y g rafiq ue valo re s re s id uale s (d ife re nc ia e ntre e l valo r ac tual d e y y e l valo r p re d ic ho po r la line a re c ta, p ara c ad a valo r d e x ). L a d is trib uc i n ale ato ria d e la l ne a re c ta co nfirm a la line alid ad . T e nde nc ias s is te m tic as ind ic an la no line alid ad . C o ntinu ar 3 .

C o m e n ta r io s
I de alm e nte las d ife re ntes c o nc e ntrac io nes deb e n s e r p re p arad as ind e pe nd ie nte m e nte y no d e alc uo tas d e la m is m a so luc i n m ad re . E s to d ar una c o nfirm ac i n vis ual s i e l inte rvalo d e trab ajo e s line al no .

2 .- M R C b lanco s d e m ue s tra fo rtif ic ad os al m e nos de 6 d ife re nte s c o nc e ntrac io nes d e ntro de l inte rvalo line al.

E n e s ta e tap a es ne ce s ario p ro b ar un inte rvalo d e trab ajo q ue s e p ie ns a q ue es line al y d o nde se p re te nde us ar un s o lo p unto d e c alib rac i n.

Intervalo lineal y de trabajo

Qu se analiza?
Rplicas

Qu calcular de los datos?

Comentarios

3.- Repetir el procedimiento para el lmite de cuantificacin

10

Trabaje con Repita el procedimiento concentraciones para el lmite de bajas sucesivamente cuantificacin. hasta que la El lmite de cuantificacin exactitud y la efectivamente debe ser el precisin sean punto ms bajo del aceptables. intervalo de trabajo.

Reproducibilidad
Proximidad de la concordancia entre los resultados de las mediciones del mismo mensurando, con las mediciones realizadas haciendo variar las condiciones de medicin.
(VIM 3.7.NMXZ055IMNC1996)

Para que una expresin de la reproducibilidad sea vlida, es necesario especificar las condiciones que se hacen variar. Las condiciones que se pueden hacer variar son: El principio de medicin, El mtodo de medicin, El observador, El instrumento de medicin, El patrn de referencia, El lugar, Las condiciones de uso, El tiempo (varios das).

Reproducibilidad
Qu se analiza?
a) Diferentes analistas, equipos, mismo laboratorio, con un periodo largo de tiempo.
Rplicas

Qu calcular de los datos?

Determinar la desviacin estndar (s) a cada concentracin.

Comentarios
Determinar la desviacin estndar de la reproducibilidad interlaboratorio a cada concentracin.

10

b) Diferentes analistas, equipos, laboratorios y periodos largos de tiempo.

10

Determinar la desviacin estndar (s) a cada concentracin.

Determinar la desviacin estndar de la reproducibilidad intralaboratorio a cada concentracin. Requiere de un estudio de colaboracin.

La reproducibilidad (Lmite de) se da por:

R = t x RAIZ(2) x R t= normalmente es 1,96

Repetibilidad
Proximidad de la concordancia entre los resultados de las mediciones sucesivas del mismo mensurando, con las mediciones realizadas con la aplicacin de la totalidad de las siguientes condiciones:
El mismo procedimiento de medicin, El mismo observador, El mismo instrumento de medicin utilizado en las mismas condiciones, El mismo lugar, La repeticin dentro de un periodo corto de tiempo.
(VIM 3.7.NMXZ055IMNC1996)

Repetibilidad
Q u s e a n a liz a ?
R efe re nc ias , M ate riale s d e re fe re nc ia o m ues tras d e b lanc o f o rtif ic ad as a va rias c o nc e ntrac io nes e n e l inte rvalo d e trab ajo . a) E l m is m o analis ta, e q uipo , lab o rato rio y un p e rio do co rto de tie m po . L a re pe tib ilid ad (L m ite de ) se d a po r:
R p lica s

Q u c a lc u la r d e lo s d a to s ?

C o m e n ta r io s

10

D e te rm inar la d es viac i n es tnd ar (s ) a c ad a c o nce ntrac i n.

D e te rm inar la d es viac i n es tnd ar d e la re pe tib ilid ad (s ) a c ad a c o nc e ntrac i n.

t = no rm alm ent e e s 1 ,9 6

r = t x R A IZ ( 2) x

Sesgo
La diferencia entre los resultados de prueba esperados y el valor de referencia aceptado.
(ISO 35341)

El sesgo es el error sistemtico total en contraste con el error aleatorio. Puede existir uno o ms componentes del error sistemtico que contribuyen al sesgo. Una diferencia sistemtica mayor con respecto al valor de referencia aceptado se refleja por un valor de sesgo ms grande.

Sesgo
Caracteriza el error sistemtico en un procedimiento analtico dado y es la desviacin (positiva negativa) de la media de los resultados analticos del valor verdadero (conocido o asumido).
(IUPAC Compendium of Chemical Technology, 1985)

Sesgo
Diferencia entre la media de poblaciones de la distribucin que caracteriza la cantidad medida y el valor verdadero
IUPAC Orange Book

= = Media limitante = valor verdadero Sesgo = 167,4 - 170,5 = - 3,1 mg/L

Sesgo
Qu se a n a liz a ?
a) E l B lanc o re ac tivo y e l M ate rial d e re fe re nc ia us and o e l m to do c and id ato . b ) E l b lanc o re ac tivo y e l M ate rial d e re fe re nc ia/ m ate rial d e p rue b a us and o un m to do c and id ato y un m todo ind e pe nd ie nte , (p ref e re nte m e nte un m to do p rim ario ).
R p lica s

Q u c a lc u la r d e lo s d a to s ?
E l valo r p ro m e d io de l analito p ro ve nie nte d e l m ate rial d e re fe re nc ia y re s tarle e l valo r p ro m ed io d e l b lanco . C om p arar c o n e l valo r ve rd ade ro o acep tad o d e l m ate rial d e ref e re nc ia, d a una m e d ic i n de l ses go de l m todo . E l valo r p ro m e d io p ro ve nie nte d e l M ate rial d e re fe re nc ia/ m ate rial d e p rue b a res tarle e l valo r p ro m ed io d e l b lanco . C om p arar c o n m e d ic io nes s im ilare s o b te nid as c o n un m todo ind ep e nd ie nte , co n un m to do p rim ario . D a una m e d ic i n de l se sgo d e l m todo re lativo al m todo ind e pe nd ie nte /p rim ario .

C o m e n ta r io s
S uje to a la inc e rtid um b re de l b lanc o q ue e n re alid ad se a un b lanc o ve rd ad e ro , c arac te rizac i n d e l m ate rial d e re fe re nc ia. E l m to do ind e pe nd ie nte p uede te ne r se sg o p o r e l m is m o y po r c o ns ec ue nc ia no se p ue de te ne r una m ed ic i n ab so luta d e la e xac titud . E l m to do p rim ario id e alm e nte no tie ne s esg o p o r lo q ue es una m e jo r f o rm a de m ed ir la e xac titud .

10

10

Incertidumbre
Parmetro asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuido al mensurando.
(VIM 1993)

Curva de Calibracin

Precisin n muestras Sn(m) Blanco CB

C Cu = C ( x B ) * fd

Respuesta del Instrument o

Diluciones MRC Calibrante

Repetibilidad

Pureza

Volumen Pipeta Calibracin tolerancia de la Pipeta Dilucin Calibracin tolerancia del Matraz Diferencia de temperatura Volumen de Matraz

Diferencia de temperatura Repetibilidad de la pipeta

Concentracin Cu mg/L

Repetibilidad del Matraz

Factor de Dilucin fd (muestra)

GRACIAS POR SU ATENCIN