Por: LIZETH BIANEY MORA SOTO

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Tcnicas moleculares usadas como herramientas biotecnolgicas. Extraccin de ADN Hay diferentes tcnicas que permiten obtener cidos nucleicos con alto grado de pureza. Las ms utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugacin en gradientes de CsCl o una cromatografa de intercambio inico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas tcnicas (laboriosas y/o caras) en los protocolos de purificacin. Las etapas del procedimiento que se realizan son las siguientes: Desintegracin del tejido y solubilizacin y homogenizacin de los componentes celulares Precipitacin de los cidos nucleicos y disolucin en un buffer adecuado Homogenizacin de la muestra El mtodo para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las caractersticas de ste. Para grandes volmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domsticas. Para volmenes menores, en general es suficiente un homogeneizador, el cual consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistn (de vidrio o de tefln). La rotacin del pistn dentro del tubo (propulsin manual o por un motor), disgrega la muestra. Tejidos ms resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos mecnicos especiales. Aquellos tejidos con clulas cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren tambin condiciones drsticas. Uno de los mtodos ms utilizados consiste en congelar la muestra en nitrgeno lquido y, mantenindola congelada, pulverizarla con un mortero. As, adems de desintegrar la muestra, se logra que sta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la accin de nucleasas endgenas que pudieran degradar el material de inters. Como puede deducirse de los prrafos anteriores, se han descrito diversos mtodos particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de clulas bacterianas, se emplea tpicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradacin de la pared celular. Para facilitar a la solubilizacin de los componentes celulares, y a la ruptura de membranas y complejos proteicos, la solucin de lisis contendr un detergente inico (dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las membranas y desnaturaliza las protenas. La solucin de lisis contiene adems el agente quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la accin de las ADNasas (dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas Es importante comprender que durante la homogenizacin de la muestra, as como en otros pasos siguientes de la purificacin de cidos nucleicos, las molculas de gran tamao (como por ejemplo las molculas de ADN genmico presentes en los cromosomas, cuyo tamao es del orden de millones de pares de bases) es fragmentado mecnicamente en forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamao mucho menor (tpicamente entre 20 y 200 kb). El grado de fragmentacin depender, obviamente, de los mtodos

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utilizados para la homogeneizacin y purificacin. Los mtodos ms vigorosos por lo general permiten mayores rendimientos, al maximizar el nmero de clulas lisadas, pero por la misma razn llevan a una mayor fragmentacin del ADN. Extraccin de protenas y lpidos Los cidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carcter hidroflico de sus grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro orgnico no polar, los cidos nucleicos tendern a permanecer en la fase acuosa, en tanto que los lpidos y gran parte de las protenas desnaturalizadas se encontrarn en la fase orgnica. En la preparacin de cidos nucleicos, los solventes que se usan ms frecuentemente para la extraccin de protenas y lpidos son el fenol y el cloroformo. Precipitacin de cidos nucleicos La precipitacin de los cidos nucleicos permite su purificacin y concentracin. Se basa en la simultnea neutralizacin de las cargas negativas (mediante el aadido de sales), y deshidratacin de la molcula (mediada por el agregado de alcoholes, tpicamente etanol o isopropanol), lo cual lleva a su precipitacin. La precipitacin es un fenmeno reversible (mediante la disolucin en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalizacin (potencialmente reversible) ni con la degradacin (irreversible) de los mismos. Extraccin de ARN En una tcnica sencilla de extraccin de ARN, las clulas son homogenizadas en tiocianato de guanidina y posteriormente purificado por fenol-cloroformo a pH reducido. El rendimiento del ARN total extrado depende del tipo de muestra y generalmente esta en un intervalo de 4-7 g/mL iniciando de 5-10 mg de tejido o 106 clulas. Extraccin de ADN plasmdico por lisis alcalina Cuando se desea introducir un gen para expresin en bacterias, es necesario que este gen se encuentre en el vector adecuado para que se obtengan los niveles de expresin deseados. El vector que se va a utilizar es generalmente amplificado en un cepa de E. coli a partr de la cual se purifica. La extraccin por lisis alcalina consiste en la lisis de las clulas utilizando una solucin con NaOH y SDS. Posteriormente la separacin entre los restos celulares y elADN se logra por precipitacin mediante la adicin de una solucin de acetato de potasio. Para purificaciones ms exhaustivas se utiliza una solucin de fenol:cloroformo. Los cidos nucleicos se separan en la fase acuosa y las protenas en la fase orgnica Insercin de material gentico en un plsmido bacteriano. La ligacin de fragmentes de inters en plsmidos ha sido una metodologa presente en casi todos los estudios que tienen que ver con tcnicas de Biologa Molecular. Se han utilizado diferente sistemas que utilizan diferente vectores, entre

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los que se encuentran el pUC 19, pBR322, pBlueScript KS II, pTOPO, etc. Para la insercin de un gen o de un fragmento del gen en un vector, generalmente se lineariza el vector con enzimas de restriccin y al mismo tiempo se digiere el gen con las misma enzimas de restriccin. Despus de la linearizacin del vector y de la restriccin del gen, ambos fragmentos se incuban con una ligasa en presencia de ATP para que la enzima catalize la reaccin de ligacin.. Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR). La Reaccin en Cadena de la polimerasa (PCR) permite obtener ms de 10 millones de copias de una cadena de ADN de inters a partir de pocas molculas de sta. La sensibilidad de sta tcnica requiere de cuidados para que la muestra no est contaminada previamente con otras cadenas de ADN que pudieran generar amplificados. Existen numerosas tcnicas que emplean la PCR (RAPD, RFLP, RTPCR) con diferentes aplicaciones en campos de diagnstico, criminologa, e investigacin. Mtodo para preparar clulas competentes Uno de las metodologas rutinarias en los laboratorios de Biologa Molecular es la preparacin de clulas competentes. Las clulas competentes pueden ser almacenadas y usarse para la propagacin de vectores de inters. Hay varios mtodos para preparar clulas competentes pero quiz el ms utilizado sea el que se realiza con cloruro de calcio ya que es eficiente, barato y generalemente se obtienen clulas con altos niveles de transformacin. Transformacin de clulas competentes La ligacin de fragmentos de ADN inters en plsmidos ha sido una metodologa fundamental en casi todos los estudios de transformacin de organismos. Se han utilizado este tipo de plsmidos como el pUC 19 linearizado con enzimas de restriccin especficas, una vez hecho esto se realiza una reaccin de ligacin plsmido-inserto con la enzima ligasa. El vector obtenido puede entonces ser introducido en una cepa bacteriana para ser propagado. Los metodos ms utilizados para la INTRODUCCIN de DNA en clulas competentes es la electroporacin y la que involucra choque trmico. Las clulas preparadas con cloruro de calcio son faciles de preparar y son las que se utilizan mayormente. El proceso consiste en preparar la clulas (Prctica 9) y despus incubarlas con el vector a introducir, seguido de un choque trmico. Este mtodo es eficiente y generalmente da rendimientos aceptables para la insercin de vectores despus de una reaccin de ligacin.

Southern blot

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Southern blot, hibridacin Southern o, simplemente, Southern es un mtodo de biologa molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este cido nucleico. Para ello, emplea la tcnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, despus, una transferencia a una membrana en la cual se efecta la hibridacin de la sonda. Su nombre procede del apellido de su inventor, un bilogo ingls llamado Edwin Southern. Pasos: 1. Extraccin del ADN Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una vctima muerta, clulas del folculo capilar y saliva. El ADN extrado de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biolgicos) se compara con el extrado de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas,habitualmente de la sangre. 2. Digestin del ADN con una endonucleasa de restriccin El ADN extrado de la muestra se trata con una endonucleasa de restriccin,que es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia caracterstica. La enzima que se usa ms frecuentemente para el anlisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'. 3. Electroforesis en gel de agarosa Tras la digestin del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan segn su tamao mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las molculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las molculas de ADN, su velocidad de migracin se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las molculas menores se mueven ms deprisa a travs de los poros del gel que las de mayor tamao. Como resultado, se produce una separacin continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamao, de modo que los fragmentos ms pequeos avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicain de la muestra. 4. Preparacin de un ensayo de Southern ("Southern blot") Tras la electroforesis, las molculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando ste con una disolucin alcalina. Tras la neutralizacin de sta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon,realizando as una copia o "calco" (la traduccin ms literal del ingls blot,conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalizacin y transferencia se conoce como mtodo de Southern en recuerdo de quien lo invent, Edward Southern. Al igual que la aplicacin de un secante a un papel con la tinta hmeda transfiere una rplica de la imagen del papel al secante,el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribucin espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis.

Por: LIZETH BIANEY MORA SOTO 5. Hibridacin con sonda radioactiva

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Una sonda de locus nico es una molcula pequea de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restriccin concreto en el ensayo de Southern. La formacin de la molcula dicatenaria (dplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el"calco". Las sondas de locus nico se marcan habitualmente con un istopo radiactivo para facilitar su deteccin, y se eligen para que detecten un locus gentico polimrfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolucin que contiene una sonda radiactiva de locus nico, bajo condiciones de temperatura y concentracin desales que favorezcan la hibridacin. Tras producirse sta, se lava el exceso de sonda no unido, de modo que la nica radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana. 6. Deteccin de los RFLPs mediante autorradiografa Las posiciones de hibridacin de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografa. En esta tcnica,la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una pelcula derayos X dentro de una caja que las asle de la luz. La pelcula registra las posiciones donde hay desintegracin radiactiva. Tras su exposicin y el revelado fotogrfico, el registro resultante de la hibridacin de Southern se conoce como autorradiografa 7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales En un anlisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografa para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolucin a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten as las etapas 57,detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografas de una misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN" Inmunodeteccin en estado slido El western blot es una tcnica inmuno enzimtica utilizada en biologa molecular para ladeteccin de protenas en muestras crudas o extractos celulares. Esta tcnica tiene mltiples aplicaciones, tanto en el rea de investigacin como en la de diagnstico clnico, en donde es utilizada ya sea independiente o conjuntamente con ELISA. La tcnica consiste en realizar la separacin de las protenas de la muestra por electroforesis en gel de poli acrilamida (PAGE) y posteriormente transferirlas a una membrana (e.i nitrocelulosa), ya sea por gravedad, difusin o un campo elctrico. Una vez en la membrana, la protena es identificada mediante un inmunoensayo, en donde se liga a la protena de inters un anticuerpo especfico contra ella ligado a una enzima, la cual permite la deteccin.