9.

Linfocitos T
Hay tres poblaciones principales de linfocitos T maduros, a saber: citotxicos (Tc), colaboradores (Th, de helper) y reguladores o supresores (LTs, Treg). Todos expresan el marcador CD3. Los citotxicos expresan adems CD8, los colaboradores CD4. Existen varias clases de Th (por ej., Th1, Th2 y Th17). Los Treg pueden ser positivos para CD4 CD8 y deben caracterizarse con marcadores adicionales. Los linfocitos T no reconocen los antgenos en su estado nativo (intacto) sino epitopos procesados y presentados por clulas en molculas del MHC. El receptor de los linfocitos T (TCR) reconoce estos complejos. El TCR es un heterodmero con cadenas (superfamilia de las inmunoglobulinas) unido no covalentemente a cinco subunidades de CD3 llamadas , , , y h (Fig. 9-1). Las cadenas y se unen al antgeno. El CD3 permite la insercin del TCR en la membrana y media los efectos intracelulares de la ocupacin del receptor. El TCR de los Tc se asocia con CD8 (cadenas ) y reconoce antgenos presentados por MHC de clase I. El TCR de los Th reconoce antgenos acoplados a MHC de clase II. Los genes de las cadenas y se hallan en el cromosoma 14 y los de las cadenas y en el cromosoma 7. Poseen porciones constantes y variables, que se combinan aleatoriamente y se seleccionan en el timo. La cadena tiene segmentos variables (V), de unin (J, de joining) y constante (C). En la cadena hay segmentos V, J, C y D (de diversidad). La reordenacin de los genes es posible por dos protena kinasas dependientes de ADN, productos de genes activadores de la recombinasa (RAG1 y RAG2). Los TCR corresponden a las diversas recombinaciones de estos segmentos. En cada linfocito T slo un locus para la cadena y otro para la se reordenan y se expresan, pero el alelo restante no lo hace (fenmeno de exclusin allica). Este proceso puede generar 1016 TCR diferentes.

MADURACIN DE LOS LINFOCITOS T EN EL TIMO

Los progenitores de linfocitos T llegan al timo, donde sufren procesos de migracin, proliferacin, diferenciacin y seleccin antes de retornar a la sangre como clulas T maduras (Fig. 9-2). La selectina P en el endotelio del timo recluta progenitores que llevan su ligando (PSGL-1). La diferenciacin es dirigida por seales del estroma y del epitelio del timo. Los progenitores ms inmaduros de linfocitos T son doble negativos (DN1) por no expresar CD4 ni CD8. Son CD44+ pero CD25-. Estos linfocitos ingresan a la corteza tmica cerca de la unin crticomedular. Luego migran hacia la regin subcapsular y pasan por otras etapas doble negativas, cuando se activan RAG1 y RAG2, que dirigen la recombinacin al azar de la cadena del TCR en una secuencia fija (D a J y luego V a DJ). RAG1 y RAG2 se silencian luego de producir una disposicin VDJ funcional, que lleva al ensamble de un TCR precursor (preTCR), que permite la proliferacin y la diferenciacin en clulas T doble positivas (expresan CD4+ y CD8+), la mayora de los linfocitos subcapsulares. En la etapa CD4+ CD8+, RAG1 y RAG2 se reactivan para generar una cadena madura por recombinacin de V y J. La expresin de TCR otorga especificidad para un antgeno. An en la corteza, algunas clulas se diferencian en linfocitos NK por influencia de CD1, o en linfocitos con TCR mediada por receptores para -linfotoxina. La mayor parte, sin embargo, expresa un TCR maduro, que contacta clulas epiteliales tmicas corticales. Estas clulas seleccionan los linfocitos presentndoles pptidos propios en molculas del MHC. Los linfocitos cuyo TCR reconoce el MHC propio con baja afinidad reciben seales de supervivencia (seleccin positiva). Aqullos cuyo TCR no reconoce esas molculas mueren por

Linfocitos T

deprivacin. Si la afinidad por MHC es excesiva, los linfocitos reactivan RAG y pueden corregir su TCR para tornarlo menos autorreactivo (edicin del TCR). Si esto fracasa, sufren apoptosis. Los linfocitos seleccionados expresan el receptor para quimioquina CCR7 que los orienta hacia la mdula del timo. En el timo, los linfocitos T que adems de CD3 expresan CD4 CD8 (de modo mutuamente excluyente) estn slo en la mdula, que forma un microambiente apto para la eliminacin de aqullos con TCR autorreactivos (seleccin negativa). El microambiente est formado por timocitos, macrfagos, CCDD y clulas epiteliales tmicas medulares. Estas ltimas expresan el factor de transcripcin AIRE (regulador autoinmune) y presentan a los linfocitos T una serie de antgenos propios caractersticos no slo de las clulas locales, sino tambin de tejidos perifricos. Esto se conoce como expresin gnica promiscua. Su falla causa un grave trastorno autoinmune. As, los linfocitos T son revisados en su reactividad a antgenos propios locales y perifricos antes de que abandonen el timo, y aquellos con TCR autorreactivos son eliminados por induccin de apoptosis (seleccin negativa). Cerca de 97 % de los linfocitos T generados se eliminan por la seleccin positiva y negativa, pero esto no elimina todos los linfocitos T autorreactivos, y se requieren controles perifricos para evitar reacciones autoinmunes. Los corpsculos de Hassal forman un subcompartimiento en la mdula del timo, donde las clulas epiteliales y dendrticas promueven el desarrollo de Treg. Estas contribuyen a mantener la tolerancia hacia lo propio por la supresin activa de la respuesta inmune. La salida de los linfocitos T maduros desde el timo hacia la sangre tambin es un proceso regulado por un gradiente del receptor tipo esfingosina-1-fosfato (S1P1), la subregulacin de un receptor tipo lectina llamado CD69 y la expresin de la integrina 51, entre otras seales. Los linfocitos egresados del timo son vrgenes o ingenuos (nave) hasta encuentran antgenos en la periferia. Los linfocitos T maduros son 75 % de los linfocitos de la sangre perifrica, 90 % de los de la linfa, y 30 % de los del bazo y los ganglios.

ACTIVACIN E INHIBICIN DE LOS LINFOCITOS T POR LAS CLULAS DENDRTICAS

Para activarse, los linfocitos T vrgenes requieren instrucciones especficas proporcionadas principalmente por las CCDD, lo que hace de stas un eslabn clave entre la inmunidad innata y adquirida. Cuando las CCDD entran en contacto con un patgeno, procesan sus antgenos y viajan por los vasos linfticos hacia un ganglio, en donde puede encontrar un linfocito T que reconozca el epitopo presentado en la hendidura del MHC, de clase I para linfocitos CD8 o de clase II para linfocitos CD4. Las CCDD se localizan en la piel, las mucosas y los rganos linfoides secundarios. Son cruciales para iniciar respuestas especficas a patgenos o clulas anormales (accin inmunognica), y tambin para prevenir la reaccin contra lo propio y contra antgenos exgenos inofensivos (accin tolerognica). Desde los tejidos migran por la linfa a los rganos linfoides secundarios. La maduracin de las CCDD puede ser inducida por productos de microorganismos, por linfocitos y neutrfilos, diversas citokinas, ligandos endgenos por ej., HSP70 (protena de golpe de calor 70) y por complejos inmunes antgenoanticuerpo. La va final comn de la maduracin involucra al NF-B y lleva a la secrecin de citokinas, que atraen fagocitos y linfocitos, y la expresin de molculas de membrana co-estimuladoras, necesarias para actuar sobre los linfocitos.

Linfocitos T

Las CCDD envan a los linfocitos T varias seales en forma secuencial. La primera seal es la presentacin de molculas de MHC con epitopos antignicos, cuya interaccin con los TCR inicia la formacin de un contacto duradero (horas) y especializado entre la clula dendrtica y el linfocito T, llamado sinapsis inmunolgica. La segunda seal corresponde a molculas de sealamiento que pueden ser co-estimulantes o co-inhibitorias, segn estimulen al linfocito a activarse o impidan su activacin frente al antgeno presentado. La tercera seal establece, para los linfocitos T CD4, si el linfocito se diferenciar como Th1, Th2, Th17 o Treg (polarizacin funcional). La cuarta seal estimula a los linfocitos a expresar receptores de localizacin (homing receptors) que les permten dirigirse a los tejidos donde se hall el antgeno y a tejidos similares. Las CCDD son una poblacin heterognea. Se clasifican en mieloides, linfoides y plasmacitoides, que pueden distinguirse por marcadores de membrana. Las CCDD mieloides tienden a localizarse en la zona marginal de la pulpa blanca del bazo. Estimulan linfocitos T CD8 (citolticos) y en condiciones inflamatorias favorecen la diferenciacin de linfocitos T CD4 en LTh2, activando factores de transcripcin caractersticos como STAT-6, GATA-3 y c-maf. Las CCDD linfoides activan linfocitos T CD8, pero promueven la diferenciacin de los CD4 en LTh1 por activacin de los factores STAT-4 y T-bet. Finalmente, las CCDD plasmacitoides participan en el mantenimiento de tolerancia perifrica induciendo Treg, aunque en ciertas condiciones favorecen la diferenciacin de Th17 por activacin del factor de transcripcin RORt. Las CCDD plasmacitoides se caracterizan por responder especialmente a cidos nucleicos microbianos y producir gran cantidad de IFN tipo I (como IFN y ), adems de IL-6 y TNF. Las citokinas predominantes producidas por las CCDD guan la diferenciacin de los linfocitos T: IL-12 para Th1, IL-4 para Th2, y TGF- para Th17 y Treg. En presencia de TGF-, la diferenciacin hacia Th17 es favorecida por la IL-6, mientras que su ausencia lleva a Treg (Fig. 9-3).

SEALIZACIN INTRACELULAR DEL TCR ACTIVADO

El TCR propiamente dicho carece de capacidad de sealizacin intrnseca. Los efectos de su activacin son mediados por protenas adaptadoras transmembrana o citoplsmicas, que no tienen actividad enzimtica pero reclutan molculas efectoras. CD3 y las protenas adaptadoras poseen dominios de activacin de inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM), cuya fosforilacin permite que las molculas adaptadoras funcionen como andamios donde se reclutan las molculas efectoras. Por esta razn, diversas kinasas y fosfatasas tienen un papel crucial en la funcin del TCR. Se presenta un modelo simplificado (Fig. 9-4). Como se dijo, cuando los TCR entran en contacto con un antgeno presen-tado en MHC, forman una sinapsis inmuno-lgica. Esta es una estructura muy organizada pero dinmica, que en su forma madura forma un complejo supra-molecular de activacin (SMAC) de 2 a 3 m de dimetro, en cuyo centro (cSMAC) se agrupan TCR unidos a MHC y molculas co-estimuladoras. En su periferia (pSMAC) hay un anillo de molculas de adhesin (ICAM-1, LFA-1) que estabilizan la sinapsis, y por fuera quedan molculas activamente excluidas del centro, como las fosfatasas de tirosina CD45 y CD148. La formacin de la sinapsis exige una reorganizacin del citoesqueleto del linfocito. La sinapsis es necesaria para la sealizacin prolongada (> 4 h), la produccin de IL-2 y la proliferacin de los linfocitos T activados. La kinasa de la familia src llamada Lck es la principal responsable de la fosforilacin de los ITAM de CD3. Lck se encuentra ligada al correceptor CD4 CD8 (segn el tipo de linfocito T) y contribuye a estabilizar el complejo formado por TCR y CD4 u 8 que se une al MHC clase II o I, respectivamente. Cuando el TCR no est ocupado, Lck es tnicamente inhibida tanto por fosforilacin de su extremo Cterminal por la kinasa Csk como por defosforilacin de una tirosina en su asa de activacin por la fosfatasa PEP. Csk y PEP se localizan en balsas lipdicas mediante su unin a una protena llamada Cbp PAG. Cuando los TCR son ocupados, Csk y PEP son alejadas del TCR, a la vez que la fosfatasa transmembrana

Linfocitos T

CD45 defosforila el sitio inhibidor de Lck. Luego CD45 es trasladada a la periferia, pues su persistencia en cSMAC llevara a la inhibicin de los TCR. La Lck activada fosforila los ITAM de CD3, lo que permite la incorporacin de la kinasa ZAP70 (o su anloga Syk), la cual fosforila una protena adaptadora para activacin de linfocitos T (LAT) ligada a la membrana. A su vez, LAT desinhibe a Lck (asa de retroalimentacin positiva). Adems LAT recluta otras molculas adaptadoras (Gads, Grb2, y SLP76) y enzimas como la kinasa Itk, fosfatidilinositol 3 kinasa (PI3K), el factor de intercambio de nucletidos vav-1 y la fosfolipasa C1 (PLC1).

El factor vav-1 forma parte de varios complejos de sealizacin. Activa una Rho-GTPasa llamada Cdc42-GTP y es necesario para la funcin de la sinapsis. Permite la reorganizacin del citoesqueleto, la expresin de integrinas como LFA-1 que refuerzan la sinal-sis, y contribuye a vas de sealiza-cin como ingre-so de Ca2+, reclu-tamiento de la protena kinasa C (PKC) y activacin del factor de transcripcin N-FAT. Adems de vav-1, la activacin de N-FAT exige su defosforilacin por la fosfatasa regulada por Ca2+- calmodulina llamada calcineurina. La calcineurina expone la secuencia de direccionamiento al ncleo de N-FAT. La PLC1 produce diacilglicerol e inositol trifosfato a partir de difosfato de fosfatidilinositol de la membrana. El inositol trifosfato produce liberacin de Ca2+ del retculo endoplsmico. La concentracin citoslica de Ca2+ ([Ca2+]i) aumenta 100 veces en pocos segundos y se mantiene elevada aunque con oscilaciones por ingreso de Ca2+ extracelular que es incorporado al retculo endoplsmico. El diacilglicerol activa la PKC, que fosforila residuos de serina o treonina. En la clula en reposo, el NF-B est ligado a un inhibidor (IB) que debe ser fosforilado para que se disocie de NF-kB y ste pueda migrar al ncleo. La PKC activa la kinasa del IB, IKK, pero para que IKK migre a la sinapsis y se active se requiere la formacin de otro complejo de protenas adaptadoras llamado CBM (CARMA-1, Bcl10 y MALT-1) junto con la protena adaptadora de adhesin y desgranulacin (ADAP). La formacin del complejo es iniciada por la fosforilacin de CARMA-1 por la PKC. Molculas co-estimuladoras. La activacin de linfocitos T requiere seales adicionales a la interaccin entre pptido antignico-MHC y TCR-correceptor CD4 CD8. Esta interaccin aumenta la expresin de la molcula ligando de CD40 (CD40L) en el linfocito, que se liga al CD40 de la CCDD. La unin CD40L-CD40 hace que la CCDD exprese un grupo de ligandos llamado B7, como CD80 (B7.1) y

Linfocitos T

CD86 (B7.2). Estos se unen en el cSMAC a CD28 del linfocito. CD28 no tiene actividad enzimtica, pero posee ITAM, que son fosforilados por kinasas src con tres consecuencias. Primero, el CD28 fosforilado recluta fosfatidilinositol-3-kinasa (PI3K) que activa Akt (protena kinasa B). Akt estimula la transcripcin de NF-kB y favorece la produccin de IL-2. Segundo, CD28 amplifica la seal originada en el TCR porque favorece la fosforilacin de vav-1 y PLC1. Tercero, CD28 promueve la supervivencia y la divisin celular por aumentar la protena antiapopttica Bcl-XL y la degradacin de inhibidores del ciclo celular. Los efectos sinrgicos de TCR y CD28 contrarrestan seales inhibitorias que normalmente restringen la activacin inadecuada del linfocito (por ejemplo, las originadas por Cbl-b; ver TOLERANCIA INMUNOLGICA). Recientemente se ha demostrado que otros pares de molculas participan en la coestimulacin, como PD1/PD1L, ICOS/ICOSL, OX40/OX40L y 4-IBB/4-IBBL, pero no sern tratadas aqu.

CLASES DE LINFOCITOS CD4+ Y SUS FUNCIONES

Th1. Otorgan proteccin contra bacterias intracelulares y ciertos virus por activacin de macrfagos y de la actividad citoltica de linfocitos NK y CD8. Las principales citokinas que producen son IL-2, IFN y linfotoxina . Th2. Participan contra infecciones por helmintos. Sus citokinas caractersticas son IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. Estas activan los eosinfilos y favorecen la expulsin de los helmintos. Adems los Th2 participan de manera fundamental en la regulacin de los linfocitos B y, por tanto, en las respuestas inmunes especficas mediadas por anticuerpos. Th17. Protegen contra bacterias extracelulares y algunos hongos. Producen citokinas IL-17 e IL22 que son proinflamatorias y otras que reclutan granulocitos, como GM-CSF. La IL-23 estimula la actividad de LTh17 ya diferenciados por la accin de TGF- e IL-6. Treg. Mantienen la tolerancia hacia lo propio en la periferia y limitar las respuestas excesivas (posiblemente nocivas) contra antgenos extraos. Sus citokinas caractersticas son IL-10 y TGF-. Hay varias clases: 1) Th3, inducida por la administracin oral de antgenos; produce TGF-. 2) Tr1 es inducida por IL-10 y produce la misma citokina. 3) Los linfocitos CD4 CD25 FoxP3 se producen en los corpsculos de Hassal del timo pero tambin en la periferia, y en este caso se llaman Treg adaptativos (aTreg). Th3 y Tr1 no expresan FoxP3. Su accin supresora reduce las respuestas de Th1 y Th2 mediante TGF- e IL-10 solubles, de manera no especfica para un antgeno ni por clase de MHC. Por el contrario, los Treg CD4 CD25 FoxP3 suprimen la proliferacin de linfocitos T efectores de manera especfica para un antgeno.

LINFOCITOS T CITOTXICOS
Los Tc monitorean constantemente los tejidos para destruir toda clula que amenace la integridad del organismo, como las infectadas por virus y las neoplsicas. Los Tc se activan a travs por expresin de epitopos montados en MHC clase I en las clulas anormales o en CCDD, mediante una va alternativa de presentacin cruzada. Los siguientes pasos crticos son la activacin, la expansin clonal y la diferenciacin de los linfocitos T CD8. El co-receptor CD8 es a la vez una molcula de reconocimiento y un iniciador de transduccin intracelular. Las clulas T CD8 vrgenes requieren molculas co-estimuladoras como CD28. La activacin del TCR y la co-estimulacin de CD28 induce receptores para IL-2, citokina necesaria para la respuesta. Las clulas CD8 experimentadas (con memoria) poseen la capacidad de activarse por ocupacin del TCR, con menores exigencias de co-estimulacin. Los linfocitos T CD8 vrgenes circulan slo entre la sangre y los tejidos linfticos, mientras que las experimentadas por contacto previo con un antgeno pueden ingresar en otros tejidos. Estas ltimas sufren diferenciacin en clulas T CD8 de memoria, que no tienen actividad citoltica pero pueden proliferar y producir citokinas frente al antgeno, y clulas T CD8 efectoras que son potentes citolticas pero producen escasas citokinas. Existen tipos intermedios (efectoras y de memoria) que producen citokinas y conservan actividad citoltica. Los diversos tipos de linfocitos T CD8 pueden distinguirse por diversos marcadores. Los Tc pueden matar las clulas blancos por tres diferentes mecanismos. Uno es mediado por citokinas solubles como TNF (que activa caspasas e induce apoptosis) e IFN- (que activa en la clula blanco la transcripcin de MHC clase I y un receptor de la muerte, Fas). Los otros dos exigen contacto estrecho entre la clula ejecutora y su vctima. Una va es a travs del ligando de Fas expresado en el Tc, que inicia la apoptosis de la clula blanco mediante la cascada de caspasas.

Linfocitos T

En el tercer mecanismo citoltico, el Tc libera sobre la membrana de la clula blanco grnulos lisosomales con perforina y granzimas en un espacio restringido de su superficie llamado dominio secretorio, exactamente en una hendidura central de la zona de contacto (Fig. 9-5). Esto produce alta concentracin de citotxicos sobre la membrana blanco, a la vez que minimiza la probabilidad de difusin de citotxicos a clulas vecinas. En presencia de Ca2+ la perforina se polimeriza y forma un poro en la membrana de superficie, o en vesculas que la clula blanco endocita, lo que permite el ingreso de granzimas, las cuales causan apoptosis. Por razones poco claras, los Tc no son afectados por sus propios txicos, y luego de matar una clula anormal se desprenden de ella y buscan otros blancos.

MANTENIMIENTO
LAS POBLACIONES LINFOCITOS T

DE DE

El conjunto de linfocitos T perifricos debe mantener un equilibrio entre las clulas con memoria que permitan una rpida reaccin ante infecciones repetidas y clulas vrgenes que puedan responder a nuevos patgenos. Los linfocitos T vrgenes requieren ocupacin de su receptor e IL-7 para sobrevivir. La exposicin a un nuevo antgeno expande la subpoblacin relevante de linfocitos T vrgenes y promueve su diferenciacin hacia un fenotipo efector. Una vez eliminada la infeccin, la mayora de las clulas activadas sufre apoptosis, y las sobrevivientes pasan a formar parte del conjunto de linfocitos T con memoria. Los linfocitos T con memoria no requieren la ocupacin del TCR para su supervivencia, pero s citokinas, en particular IL15 para los CD8 e IL-7 para los CD4. Adems, en los CD4+ la sealizacin Fig. 9-5: Citotoxicidad mediada por perforina y granzimas. mediante TCR aunque no Segn Bolitho y col., Curr Opin Immunol 19: 339-347, 2007. indispensable acta sinrgicamente con IL-7 para mantener ptima capacidad de respuesta. Se distinguen dos subpoblaciones de linfocitos T CD4 con memoria, llamadas centrales (TCM) y efectoras (TEM), con diferentes marcadores y propiedades funcionales. Los linfocitos TCM circulan por el sistema linftico y sanguneo pero se alojan preferentemente en los ganglios linfticos por expresar CCR7 y CD62L. Carecen de capacidad efectora inmediata, pero al ser estimulados producen IL-2. Su vida es prolongada, en parte por alta expresin de molculas anti-apoptticas. Por otra parte, los linfocitos TEM tienden a alojarse en los tejidos, y expresan diversas molculas efectoras (como IFN) y pro-apoptticas. Por razones obvias, en las primeras etapas de la vida predominan los linfocitos T vrgenes. En el adulto joven las poblaciones de linfocitos T vrgenes y con memoria estn equilibradas. En el anciano predominan los linfocitos T con memoria. La declinacin de la poblacin de vrgenes se debe a su menor produccin, en parte por envejecimiento de la mdula sea, pero principalmente por involucin del timo.