UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA ESCUELA DE QUIMICA FACULTAD DE CIENCIAS INSTRUMENTAL ANALITICO

GUIA DE METODOS DE ANALISIS POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

Caracas 2008 Profa. Rosa Amaro Prof. Luis Gmez Prfa. Yosmery Vita

TABLA DE CONTENIDO

Contenido
Determinacin de cido ascrbico en una pastilla de vitamina C. ............................................................... 3 Justificacin .............................................................................................................................................. 3 Objetivos. ................................................................................................................................................. 3 Parte Experimentales ................................................................................................................................ 3 Referencia ................................................................................................................................................. 5 Determinacin de cafena en refresco (PEPSI) ............................................................................................ 6 Justificacin .............................................................................................................................................. 6 Objetivos .................................................................................................................................................. 6 Parte Experimentales ................................................................................................................................ 7 Determinacin cualitativa y cuantitativa de HAP en particulado atmosfrico ............................................. 9 Justificacin .............................................................................................................................................. 9 Objetivos .................................................................................................................................................. 9 Parte Experimental ................................................................................................................................. 10 Determinacin del cido hiprico, y los ismeros orto, meta y para del cido metil hiprico en muestra biolgica ..................................................................................................................................................... 13 Justificacin ............................................................................................................................................ 13 Objetivos ................................................................................................................................................ 14 Parte Experimental ................................................................................................................................. 14 Bibliografia ............................................................................................................................................. 16 Determinacin de cafena, acetaminofn y/ acido acetilsaliclico en analgsicos. ................................... 18 Justificacin ............................................................................................................................................ 18 Objetivos. ............................................................................................................................................... 19 Parte Experimental ................................................................................................................................. 19 Estudio Cualitativo ................................................................................................................................. 21 Estudio Cuantitativo ............................................................................................................................... 22 Referencias ............................................................................................................................................. 23

Determinacin de cido ascrbico en una pastilla de vitamina C.

Justificacin Objetivos.
General: Determinar el contenido de cido ascrbico en una pastilla de vitamina C usando la tcnica de cromatografa de lquidos de alta eficiencia (HPLC), a fin de familiarizar al alumno en el uso de dicha tcnica. Especficos: Adiestrar al alumno de forma general en el manejo de equipos de cromatografa lquida de alta eficiencia. Aprender el tratamiento adecuado de los solventes y muestra: filtracin y desgasificacin de los mismos. Ajustar los parmetros instrumentales, que permitan obtener una buena separacin de los picos en la muestra de vitamina C. Preparar patrones de cido ascrbico. Analizar cuantitativamente la pastilla de vitamina mediante el uso de una curva de calibracin.

Parte Experimentales
Instrumentacin Cromatgrafo de lquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire. Detector: UV/Vis 2075 plus ( Fotomultiplicador) Jeringa: Tipo Hamilton, apreciacin: 2 L Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Dimetro interno: 4.6 mm y Tamao de partcula: 5 (m) Preparacin del Sistema HPLC 1. 2. 3. Emplear eluentes grado HPLC. Filtrar los eluentes a utilizar en la prctica. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He..

4.

Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separacin cromatogrfica para poder realizar la purga con estos.

5.

Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la vlvula de la bomba (solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botn designado como 2/flow en un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como preestablecido luego de esto presionar el botn pump para encender la bomba y dejar la purga por 5 min. aproximadamente.

6.

Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo contrario si se va emplear mezcla de eluente colocar programacin de los mismos.

7.

Colocar el flujo en 0,2 mL/min. y luego cerrar la vlvula y de esta manera se hace pasar el eluente(s) por la columna y las dems conexiones contiguas a la bomba. Al estabilizarse la presin se puede ir aumentando el flujo de 0,1 en 0,1 mL/min hasta llegar a 1 mL/min.

8.

Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la muestra a analizar y los patrones para la cuantificacin.

Condiciones Experimentales Volumen de inyeccin 10L Deteccin a 254 nm Flujo: 1mL/min Fase mvil: 50 mM de KH2PO4 Preparacin de la curva de calibracin.
Se prepara una madre de 200 ppm de acido ascrbico.

Se preparara cuatro patrones de 5/10/15/ 20 ppm a partir de esta madre

Se inyectan al HPLC y se realiza una curva de calibracin graficando los valores de rea de pico en funcin de la concentracin

Preparacin de la muestra Se pesa la pastilla inicialmente (Dato que debe ser colocado en el informe) Se pulveriza la pastilla: se pesan tres muestras de 0.30000 g Se disuelven en agua y se enrazan en 100mL. Se realiza una dilucin de 0.40mL en 25 mL de cada una despus de filtrar la muestra en un filtro de celulosa

Se inyectan al cromatgrafo por triplicado

Referencia
Principios de Anlisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001 Editorial Mc Graw Hill. Rubinson K, Rubinson J, Anlisis Instrumental. Prentice Hall, Espaa, Pg. 636-677. Ao 2001. Cavazos R, N. A.; Rivera Z, L.; Torres de Navarro, E. Determinacin de fsforo y cafena en bebidas de cola. Educacin qumica. V.12, pg. 116-120, ao.2001. http://www.fad.es/sustancias/psicofrmacosestimulantes., Revisado 12/11/07.

Determinacin de cafena en refresco (PEPSI)

Justificacin
Un grupo importante de consumidores de refrescos es la poblacin universitaria. Se piensa que los refrescos de cola son bebidas relativamente inofensivas y que un excesivo consumo de estos productos no causa ms dao que caries dental y un aumento de peso debido al alto contenido de azcar. Un refresco contiene cido fosfrico, cafena y nuez de cola entre sus componentes principales, estos elementos pueden llegar a causar diferentes trastornos al organismo. El fsforo est relacionado con el calcio tanto en la nutricin humana como en la absorcin de este mineral... La cafena, por su parte, es la droga psicotrpica de mayor consumo en el mundo, es un compuesto alcaloide (del grupo de las xantinas) que acta como estimulante en los humanos. La cafena produce vasoconstriccin; presenta efectos a nivel de los sistemas cardiovasculares, respiratorios y gastrointestinales. Adicionalmente, acta a nivel de los msculos esquelticos, del flujo sanguneo renal, la glucogenlisis y de la liplisis. El consumo en cantidades muy grandes puede provocar una intoxicacin. Sus sntomas son insomnio, nerviosismo, excitacin, cara rojiza, aumento de la diuresis y problemas gastrointestinales. En algunas personas los sntomas aparecen consumiendo cantidades muy pequeas, como 250 mg por da. Ms all de un gramo al da puede producir contracciones musculares involuntarias, desvaros, arritmia cardiaca, y agitaciones psicomotrices. Los sntomas de la intoxicacin con cafena son similares a los del pnico y de ansiedad generalizada. La *LD50 estimada de la cafena es de 10 g, cuyo equivalente es de un promedio de 51 tazas de caf.

Objetivos
General: Determinar el contenido de cafena en una lata de refresco (PEPSI) por HPLC.

Especficos: Ajustar las condiciones experimentales para la determinacin de la cafena en el refresco. Determinar el contenido de cafena en la muestra problema aplicando el mtodo de calibracin absoluta. Determinar la exactitud y la precisin de los resultados analticos obtenidos a travs del mtodo aplicado.

Parte Experimentales
Instrumentacin Cromatgrafo de lquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire. Detector: UV/Vis 2075 plus ( Fotomultiplicador) Jeringa: Tipo Hamilton, apreciacin: 2 L Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Dimetro interno: 4.6 mm y Tamao de partcula: 5 (m) Preparacin del Sistema HPLC 1. 2. 3. Emplear eluentes grado HPLC. Filtrar los eluentes a utilizar en la prctica. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He.. 4. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separacin cromatogrfica para poder realizar la purga con estos. 5. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la vlvula de la bomba (solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botn designado como 2/flow en un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como preestablecido luego de esto presionar el botn pump para encender la bomba y dejar la purga por 5 min. aproximadamente. 6. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo contrario si se va emplear mezcla de eluente colocar programacin de los mismos. 7. Colocar el flujo en 0,2 mL/min. y luego cerrar la vlvula y de esta manera se hace pasar el eluente(s) por la columna y las dems conexiones contiguas a la bomba. Al estabilizarse la presin se puede ir aumentando el flujo de 0,1 en 0,1 mL/min hasta llegar a 1 mL/min. 8. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la muestra a analizar y los patrones para la cuantificacin. Condiciones Experimentales Volumen de inyeccin 10L Deteccin a 254nm

 Flujo: 1mL/min Fase mvil: 60% agua, 40% metanol Preparacin de la curva de calibracin.

Se prepara una madre de 2000 ppm de cafena.

Patrn de 100 ppm

Se prepararon cinco patrones de 10/20/30/ 40/50 ppm

Se inyecta los patrones y se realiza una curva de calibracin graficando los valores de rea de pico en funcin de la concentracin

Preparacin de la muestra
La muestra es desgasificada en un ultrasonido por 15 min o una corriente de He por 3 min.

La muestra es diluida en un factor de ~1/4, se filtra en un filtro de celulosa y esta se inyecto directamente al cromatgrafo

Determinacin cualitativa y cuantitativa de HAP en particulado atmosfrico

Justificacin
El particulado atmosfrico contiene muchos metales pesados, xidos acdicos, sustancias orgnicas y virus bacteriales, los cuales afectan el ambiente atmosfrico y causan daos a la salud humana. Por lo tanto, el estudio del particulado atmosfrico es un campo vital de la ciencia ambiental. Hidrocarburos aromticos policclicos (PAHs) estn ampliamente distribuidos en el ambiente, y algunos tipos de PAHs tienen caractersticas orgnicas carcingenas y/o mutagnicas. Los hidrocarburos aromticos policclicos son compuestos constituidos por anillos bencnicos condensados. Son compuestos cancergenos cuyos efectos se activan por medio de una enzima, el citocromo P450, presente en el hgado. Esta enzima metaboliza el tolueno y otras sustancias xenobiticas (molculas extraas al organismo). La enzima incorpora oxgeno a la estructura del PAH, originando aductos tipo epxidos, que reaccionan fcilmente con las bases heterocclicas del ADN, alterando los genes. Los PAHs se forman como subproductos de la combustin del carbn. Aunque se encuentran presentes a bajas concentraciones en los gases de escape de los automviles, su presencia aumenta en las partculas de holln emitidas por los motores Diesel o en el humo desprendido en la quema de carbn o incendios forestales. En los ltimos aos, se ha focalizado la investigacin de los PAHs en particulado atmosfrico, en particular, se ha evaluado el tipo de particulado, distribucin del tamao de partcula, la concentracin y fuentes de PAHs, especficamente, por tcnicas cromatogrficas acoplados a masas. Basados en todas la investigaciones previas, el objetivo de este trabajo es, determinar y cuantificar los PAHs presentes en muestras determinadas de particulado, atmosfrico y de suelos, por medio de cromatografa de gases y cromatografa lquida de alta eficiencia a fin de comparar los resultados obtenidos por ambas tcnicas y establecer las ventajas y desventajas de cada tcnica

Objetivos
General Anlisis cualitativa de hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) en una muestra de particulado atmosfrico lquida de (naftaleno, antraceno, fenantreno, fluoreno y criceno) Determinacin cuantitativa de los HAP en una muestra de Particulado atmosfrico. Especficos Familiarizar al estudiante con el uso de equipos de cromatografa de lquidos (HPLC).

 Adiestrar al estudiante en el procedimiento de inyeccin de la muestra y en la manipulacin y mantenimiento de la jeringa y la columna. Estudiar los diferentes parmetros operativos que pueden afectar la separacin (fase mvil, flujo) y encontrar las condiciones ptimas de anlisis. Realizar el anlisis cualitativo por (HPLC) para la identificacin de los componentes de la muestra mediante el uso de estndares. Anlisis cuantitativo de HAP en particulado atmosfrico.

Parte Experimental
Instrumentacin Cromatgrafo de lquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire. Detector: UV/Vis 2075 plus ( Fotomultiplicador) Jeringa: Tipo Hamilton, apreciacin: 2 L Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Dimetro interno: 4.6 mm y Tamao de partcula: 5 (m) Preparacin del Sistema HPLC 1. Emplear eluentes grado HPLC. 2. Filtrar los eluentes a utilizar en la prctica. 3. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He.. 4. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separacin cromatogrfica para poder realizar la purga con estos. 5. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la vlvula de la bomba (solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botn designado como 2/flow en un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como preestablecido luego de esto presionar el botn pump para encender la bomba y dejar la purga por 5 min. aproximadamente. 6. Colocar el flujo en 0,2 mL/min. y luego cerrar la vlvula y de esta manera se hace pasar el eluente(s) por la columna y las dems conexiones contiguas a

la bomba. Al estabilizarse aumentar el flujo de 0,2 a 2 mL/min y esperar unos 10 min. 7. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la muestra a analizar y los patrones para la identificacin y cuantificacin. Condiciones Experimentales Volumen de inyeccin 10L Deteccin a 254 nm Flujo: 2 mL/min Fase mvil: 65% acetonitrilo-35% agua desionizada Preparacin de muestra Para la muestra pese 0,5000 g y extraiga con 5 mL de acetronitrilo por una hora en un ultrasonido, filtre en forma cuantitativa la solucin y recoja el filtrado en un baln de 25 mL y luego enrace. La muestra antes de inyectar debe ser filtrada con un filtro para jeringa para solvente orgnico de 0,45 um Preparacin de Patrones Prepara los siguientes patrones disolvindolos en Metanol: Tabla 1. Concentracin de los hidrocarburos aromticos policiclicos. Compuesto Peso (g) Naftaleno Antraceno Fenantreno Fluoreno Pireno Pureza (%) Volumen (mL) aforo Concentracin (ppm) 200 100 100 100 100

Una vez obtenidas una dilucin (solo una por componente) de cada patrn segn los rangos de trabajo mostrado en la tabla 2, inyecte los mismos para determinar los tiempos de retencin de cada PAH. Inyecte la muestra e identifique que componentes estn presentes en la misma Una vez identificado los componentes de la muestra realice las curvas de calibracin directa de cada componentes preparando 4 patrones que se encuentren dentro de los rangos recomendados en la tabla 2

Tabla 2. Rango de concentracin recomendados para prepara los patrones para la curva de calibracin. Compuesto Rango de concentracin para la curva de calibracin Naftaleno 40-100 ppm Antraceno 1-4 ppm Fenantreno 5-40 ppm Fluoreno 10-60 ppm Criseno 10-60 ppm

Determinacin del cido hiprico, y los ismeros orto, meta y para del cido metil hiprico en muestra biolgica
Justificacin
Los solventes orgnicos se utilizan ampliamente en la industria qumica en general; constituyen los componentes bsicos de productos comerciales como los adelgazadores, pinturas, tintas y adhesivos, entre otros. El abuso de estos productos puede causar dependencia hacia la sustancia inhalada, desarrollo de tolerancia a algunos de sus efectos y la presentacin de un sndrome de abstinencia al suspender su consumo caracterizado por estados de ansiedad, depresin, irritabilidad, fatiga y falta de apetito (1). Los disolventes tambin estn presentes en ciertos ambientes de trabajo. La exposicin industrial afecta principalmente a los empleados que desempean su trabajo en la fabricacin de pinturas, gomas, productos de limpieza, motores, pegamentos, tintas o cualquier otro servicio que involucre disolventes industriales. Entre los solventes orgnicos estudiados con particular nfasis dado su elevado grado de toxicidad estn los hidrocarburos aromticos, los cuales son compuestos derivados del petrleo, mediante una serie de procesos petroqumicos, en particular la destilacin cataltica, la destilacin del petrleo crudo y la alquilacin de hidrocarburos aromticos de las series ms bajas (2). Las investigaciones que se han hecho sobre la toxicidad de los hidrocarburos aromticos, estn principalmente enfocadas sobre tres compuestos en particular: benceno, tolueno, y xileno, dado los efectos perjudiciales que ejercen sobre la salud: actan directamente como depresores del sistema nervioso central, la intoxicacin aguda por estos compuestos produce cefalea, nuseas, mareo, desorientacin, confusin e inquietud. La exposicin aguda a dosis altas puede incluso provocar prdida de consciencia y depresin respiratoria. Uno de los efectos agudos ms conocidos es la irritacin respiratoria (tos y dolor de garganta). Tambin se han observado sntomas cardiovasculares, como palpitaciones y mareos. Los sntomas neurolgicos de la exposicin crnica pueden ser cambios de conducta, depresin, alteraciones del estado de nimo y cambios de la personalidad y de la funcin intelectual. Por lo que existen lmites mximos de exposicin, reportados en concentraciones de ppm, permitidos en personas expuestas. Estos hidrocarburos aromticos se absorben fcilmente en el organismo humano por diversas vas: mediante inhalacin, ingestin y en poca cantidad por va cutnea, se metabolizan mediante la biooxidacin del anillo; si existen cadenas laterales, preferiblemente de grupos metilo, stas se oxidan y el anillo permanece sin modificar. En gran parte se convierten en compuestos hidrosolubles y posteriormente se conjugan con glicina, cido glucurnico o cido sulfrico y se eliminan en la orina. Se presentan entonces ciertos metabolitos que pueden monitorearse biolgicamente; los cuales sern indicativos de los niveles absorbidos por un individuo expuesto a estos compuestos. Para el tolueno el metabolito correspondiente es el denominado cido hiprico (AH) y los ismeros orto, meta y para, del acido metilhiprico, los son de la exposicin al xileno (3). El cido Hiprico es un metabolito inespecfico del Tolueno, ya que se puede producir tambin en la metabolizacin del Etil-benceno, cido Benzoico, Benzoato de Sodio, ciruelas y arndanos 11(4). Adems, la excrecin urinaria del Acido Hiprico se inhibe con el Etanol (5). Asimismo, hay supresin mutua del Tolueno con el Benceno (6). No obstante sigue utilizndose como un indicador clsico de los niveles de tolueno en orina, aunque ltimamente se ha propuesto la medida de cresol, como indicador del mismo (3). Se

recomienda tomar la muestra urinaria del Tolueno al final de la jornada de trabajo, o incluso, durante la jornada de trabajo, ya que la vida media biolgica de ste asciende a 1.5 hrs. Con respecto a los cidos Metilhipricos Urinarios (orto, meta y para) si son metabolitos especficos de los Xilenos (o-m-p). En razn de la vida media biolgica del xileno que es de 3.6 hrs. se recomienda que las tomas de muestras urinarias se realicen al final de la jornada de trabajo (4). Una parte insignificante se deposita en el tejido adiposo con una vida media biolgica de 30 hrs. pero no tiene ningn efecto significativo en la excrecin urinaria de los cidos Metilhipricos 18(5). Dado que la determinacin de estos metabolitos se realiza en muestras de orina, debe sealarse que el cido hiprico es un componente habitual de la orina, que presenta valores de referencia (0,00 - 0,37) g de AH/ g creatinina, en personas no expuestas, mientras que el valor lmite de exposicin reportado es (1,6 g de AH/ g creatinina), para el cido metilhiprico dicho valor lmite es de (1,5g/gr creatinina), establecidos por la American Conference of Governmental Industrial Hygienists( ACGIH)(3), que determinan la cantidad mnima de ste cido que debe contener un individuo para no encontrarse contaminado. Es importante sealar que estos valores de los metabolitos se reportan con respecto a la creatinina; porque esta se usa para normalizar las orinas diluidas o concentradas; dado que esta es un catabolito que se excreta, en trminos generales, de manera uniforme y regular, salvo que haya alguna patologa, sobre todo renal, que pueda trastocarla; por lo que la creatinina se debe medir en cada muestra(6).

Objetivos
General Determinar el cido hiprico y los ismeros (orto, meta y para) de cido metilhiprico en muestras de orina, utilizando un mtodo de fase reversa con detector de ultravioleta/Cromatografa lquida de alta resolucin. Especficos Familiarizar al estudiante con el uso de equipos de cromatografa de lquidos (HPLC). Adiestrar al estudiante en el procedimiento de inyeccin de la muestra y en la manipulacin y mantenimiento de la jeringa y la columna. Evidenciar cualitativamente la presencia de cido hiprico y los ismeros del cido metilhiprico en orina de individuos expuestos y no-expuestos a solventes orgnicos. Establecer las condiciones experimentales adecuadas para la aplicacin del mtodo al anlisis cuantitativo.

Parte Experimental
Instrumentacin Cromatgrafo de lquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire. Detector: UV/Vis 2075 plus ( Fotomultiplicador)

Jeringa: Tipo Hamilton, apreciacin: 2 L Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Dimetro interno: 4.6 mm y Tamao de partcula: 5 (m) Preparacin del Sistema HPLC 1. Emplear eluentes grado HPLC. 2. Filtrar los eluentes a utilizar en la prctica. 3. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He.. 4. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separacin cromatogrfica para poder realizar la purga con estos. 5. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la vlvula de la bomba (solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botn designado como 2/flow en un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como preestablecido luego de esto presionar el botn pump para encender la bomba y dejar la purga por 5 min. aproximadamente. 6. Colocar el flujo en 0,2 mL/min. y luego cerrar la vlvula y de esta manera se hace pasar el eluente(s) por la columna y las dems conexiones contiguas a la bomba. Al estabilizarse aumentar el flujo de 0,1 a 2 mL/min y esperar unos 10 min. 7. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la muestra a analizar y los patrones para la identificacin y cuantificacin. Condiciones Experimentales Velocidad de flujo: 1,4 mL/ min Volumen de inyeccin: 10 L Detector: UV/Vis a 254 nm Fase mvil: 1% ac. actico, 40% metanol, resto de agua desionizada (59%) Presin del sistema: Preparacin de muestra Se acidifican una alcuota de 20 mL a pH=2 con cido clorhdrico concentrado se lleva a un baln de 25 mL y se filtra con filtros de 0,45 m, adaptables a jeringa de celulosa y posteriormente se inyecta directamente al puerto de inyeccin para su anlisis por HPLC

Preparacin de Patrones Prepara los siguientes patrones disolvindolos en la fase mvil: Tabla 1. Concentracin de las madres.
Compuesto ac. Hipurico 2-metil ac. hipurico 3-metil ac. hipurico 4-metil ac. hipurico Pureza % 99 98 98 98 Peso (g) Vol aforo (mL) 50 50 50 50 Concentracin (ppm) 1000 1000 1000 1000

Con estas soluciones madres se hallara el factor de dilucin de manera de no saturar el sistema, para ello inicie con una solucin de 100ppm Una vez obtenidas las diluciones de los patrones, inyecte los mismos para determinar los tiempos de retencin de cada cido. Inyecte la muestra e identifique que componentes estn presentes en la misma Una vez identificado los componentes de la muestra realice las curvas de calibracin directa de cada componentes preparando 4 patrones que se encuentren dentro de los rangos recomendados en la tabla 2 Tabla 2. Rango de concentracin recomendados para prepara los patrones para la curva de calibracin. Compuesto Rango de concentracin para la curva de calibracin 0.05 2.0 ac. Hipurico 0.05 2.0 2-metil ac. hipurico 0.05 2.0 3-metil ac. hipurico 0.05 2.0 4-metil ac. hipurico

Bibliografia
1. Garca Lian, C. Qu son las drogas?. Inhalables. Editorial Arbol S.A. de C.V. Mxico, 1990. 2. Enciclopedia de la Salud y el Trabajo , pp.104-282. 3. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el trabajo. Ministerio de Trabajo y Asuntos Sociales, Vizcaya, Espaa. Norma MTA/MB-022/A95. Determinacin De los cidos fenilglioxlico, mndelico, hiprico y orto y para-metilhiprico en orina. Mtodo de Fase reversa con detector ultravioleta/Cromatografa lquida de Alta Resolucin. www.mtas.es.

4. American Conference of Governmental Industrial Hygienists Inc. Documentation of the Threshold Limit Values and Biological Exposure Indices, 1991, Sixth Edition, Volume 1, BEI-171. 5. SATO Akio et. al. Chapter 28. Effects of Ethanol on Uptake, Distribution, and Elimination of Inhaled Vapor of Organic Solvents, Biological Monitoring of Exposure to Industrial Chemicals, Editors: Vera Fiserova-Bergerova, Masana Ogata, ACGIH Inc.1990; pp. 155-158. 6. IKEDA Masayuki, Chapter 27, Suppression of Metabolism in Workers Exposed to Mixtures of Benzene and Toluene and to Thrichloroethylene and Tetrachloroethylene, Biological Monitoring of Exposure to Industrial Chemicals, Editors: Vera Fiserova-Bergerova, Masana Ogata, ACGIH Inc. 1990; pp. 151-154. 7. Rubinson K, Rubinson J, Anlisis Instrumental. Prentice Hall, Espaa, Pg. 636677. Ao 2001. 8. Daniel C Harris Anlisis Qumico Cuantitativo 3era Edicin Editorial Reverte, Pag. 548-577 y 607-639. 2007 (Nota esta edicin es la que tiene la informacin requerida) 9. Principios de Anlisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001 Editorial Mc Graw Hill.

Determinacin de cafena, acetaminofn y/ acido acetilsaliclico en analgsicos.

Justificacin
Los analgsicos son medicinas que reducen o alivian los dolores de cabeza, musculares, artrticos y muchos otros achaques y dolores. Existen muchos tipos diferentes de analgsicos y cada uno tiene sus ventajas y riesgos. Algunos tipos de dolor responden mejor a determinadas medicinas que a otras. Adems, cada persona puede tener una respuesta ligeramente distinta a un analgsico. La cafena es una sustancia bastante conocida por todos pero de la que en realidad, se ignoran muchos aspectos que pueden influir en la actividad fsica. La cafena ha sido consumida por el hombre desde hace siglos. Constituye la sustancia psicoactiva ms empleada en el mundo y se encuentra naturalmente en las hojas de t, los granos de caf y en el cacao. La cafena es un estimulante directo y moderado del sistema nervioso central y tambin estimula el corazn y el sistema cardiovascular. La combinacin del acetaminofn y la cafena tienen como finalidad obtener un sinergismo en cuanto al efecto analgsico. La cafena se ha usado durante muchos aos como adyuvante analgsico. Sin embargo, los efectos analgsicos adyuvantes de la cafena no han sido seriamente investigados desde un pool de anlisis que se realizaron en 1984 y que demostraron que la cafena reduce la cantidad de acetaminofn que se necesita para conseguir el mismo efecto en aproximadamente un 40%. Investigaciones in-vitro e in-vivo han proporcionado alguna evidencia de que la cafena puede tener acciones antinociceptivas por medio del bloqueo de los receptores de la adenosina, inhibicin de la sntesis de la ciclo-oxigenasa-2, o por cambios en estados de emocin. Pero esta accin slo se tiene en cuenta en algunos casos. Esto sugiere que las actuales dosis usadas de analgsico y cafena pueden influir en los efectos analgsicos adyuvantes de la cafena. Ensayos clnicos sugieren que la cafena en dosis mayores de 65mg puede ser provechosa para el aumento de la analgesia, sin embargo, excepto para el dolor de cabeza, los beneficios son ambiguos. En este experimento se determinar el contenido de la cafena, acetaminofn y/o acetilsaliclico presente en analgsicos disponibles comercialmente, usando la tcnica de curva de calibracin externa. Para ello se estudiarn los efectos que tiene el cambio de la composicin de la fase mvil sobre la separacin de los componentes de una mezcla patrn de estos compuestos y se realizar un estudio cualitativo para determinar que componentes estn presentes en la muestra para su posterior estudio cuantitativo.

Objetivos.
General: Determinar el contenido de cafena, acetaminofn y/ acido acetilsaliclico en una pastilla de un analgsico usando la tcnica de cromatografa de lquidos de alta eficiencia (HPLC), a fin de familiarizar al alumno en el uso de dicha tcnica. Especficos: Adiestrar al alumno de forma general en el manejo de equipos de cromatografa lquida de alta eficiencia. Aprender el tratamiento adecuado de los solventes y muestra: filtracin y desgasificacin de los mismos. Estudiar los efectos que tiene el cambio de la composicin de la fase mvil sobre la separacin de los componentes de una mezcla. Determinar los componentes de una muestra. Analizar cuantitativamente la pastilla de analgsico mediante el uso de una curva de calibracin.

Parte Experimental
Instrumentacin Cromatgrafo de lquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire. Detector: UV/Vis 2075 plus (Fotomultiplicador) Jeringa: Tipo Hamilton, apreciacin: 2 L Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Dimetro interno: 4.6 mm y Tamao de partcula: 5 (m)

Preparacin del Sistema HPLC 1. Emplear eluentes grado HPLC. 2. Filtrar los eluentes a utilizar en la prctica (soluciones A y B) al vaco y emplear un filtro de 0,45m, resistente al disolvente empleado (para la solucin 3. B emplear filtro de tefln o nylon).

4. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He. 5. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separacin cromatogrfica para poder realizar la purga con estos (ver tabla abajo). 6. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la vlvula de la bomba (solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botn designado como 2/flow en un valor de 1,5
mL

/min. presionar enter para dejar este valor como

preestablecido luego de esto presionar el botn pump para encender la bomba y dejar la purga por 5 min. aproximadamente. 7. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo contrario si se va emplear mezcla de eluentes colocar programacin de los mismos. 8. Colocar el flujo en 0,2
mL

/min. y luego cerrar la vlvula y de esta manera se

hace pasar el eluente(s) por la columna y las dems conexiones contiguas a la bomba. Al estabilizarse la presin se puede ir aumentando el flujo de 0,2 en 0,2 mL/min hasta llegar a 1,2 mL/min. 9. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la muestra a analizar y los patrones para la cuantificacin. Condiciones Experimentales Volumen de inyeccin Deteccin a 254 nm Flujo 1,2 mL/min preparar: Fase mvil 10 L

Una solucin A con la mezcla de 10,00 mL de cido actico y agua grado HPLC hasta llevarla a 1000,00 mL Una solucin B con la mezcla de 10,00 mL de cido actico y Metanol grado HPLC hasta llevarla a 1000,00 mL.

Estudio Cualitativo
Procedimiento: 1.- Prepare soluciones madres de 1000 mg/L de cada patrn. Para ello se disuelve cada solido en 40,0 mL de la solucin B y se enraza a un volumen 100,0 mL usando la solucin A. 2.- Prepare 50 mL de soluciones estndares individuales que contengan 10 mg/L de acetaminofn, 300 mg/L de acetilsaliclico y 60 mg/L de cafena. Use la fase mvil A para realizar el enrase de cada uno de ellos. Efecto de la Composicin de fase mvil 3.- Estudie el efecto sobre el tiempo de retencin de los tres componentes en estudio al usar los tres tipos de fase mvil indicadas a continuacin. Condicin % A (H2O/Hac) % B (CH3OH/Hac) 1 80 20 2 55 45 3 65 35 4.- Para ello inyecte cada uno de los patrones preparados anteriormente, una vez filtrados en un filtro de inyectadora de nylon de 0,45 um, en las condiciones de cada fase mvil propuesta en la tabla. 5. Proponga la fase mvil que debe utilizar para la separacin de una mezcla de los tres compuestos en estudio. 7.- Prepare 50 mL de una solucin estndar que contengan 10 mg/L de acetaminofn, 300 mg/L de acetilsaliclico y 60 mg/L de cafena. Use la fase mvil A para realizar el enrase.

8.- Realice la separacin de la mezcla de los componentes en estudio con la fase mvil propuesta (inyecte por triplicado para el calculo de parmetros cromatogrficos).

Anlisis Cualitativo 9.- Prepare una solucin de su muestra desconocida pesando 150 mg y disolvindolo en 20 mL de la mezcla B y luego enrace a un volumen de 50,0 mL usando la solucin A. 10.- Para determinar los componentes de la muestra de mayor concentracin diluya 1 mL de la solucin anterior en un baln aforado de 100 mL usando la solucin A, seguidamente para determinar los componentes de menor concentracin de la muestra tome una alcuota de 2 mL de la solucin anterior y llvela a 10 mL en un baln usando la solucin A, filtre las soluciones antes de inyectarlas al cromatgrafo. 10.- Obtenga los cromatogramas de las disoluciones de la muestra desconocida. 11.- Compare los tiempos de retencin obtenidos para los picos en los cromatogramas de su muestra de analgsicos e identifique los compuestos presentes en ella.

Estudio Cuantitativo
Preparacin de la curva de calibracin.

Se prepare madres de 1000 ppm de los compuestos identificados en la muestra disolviendo el solido en 40,0 mL de la solucin B y se enraza a un volumen 100,0 mL usando la solucin A.

Prepare cuatro patrones de 25, 50 o 100 mL (los rangos de trabajo se muestran abajo y los patrones son mezcla de los componentes en estudio si fuera necesario) Compuesto Rango de concentraciones Acetaminofen ( 5 - 20 ) ppm cido acetilsaliclico ( 100 - 400 ) ppm Cafena ( 20 - 80 ) ppm

Se inyectan por triplicado al HPLC y se realiza una curva de calibracin graficando los valores de rea de pico en funcin de la concentracin. Debe comprobar la linealidad de la curva

Preparacin de la muestra Se pesa la pastilla (Dato que debe ser colocado en el informe) Se pulveriza la pastilla(s)

Se pesan tres muestras de 0.1500 g

Se disuelven en 40,0 mL de la solucin B y se enrazan a un volumen 100,0 mL usando la solucin A

Se diluye la muestra 1 en 100 mL o 2 en 10 mL si lo que se desea determinar son componentes de alta o baja concentracin, respectivamente

Se filtran 5 mL de las muestras con un filtro de celulosa o nylon de 0.45 um

Se inyectan al cromatgrafo por triplicado

Se determina el contenido de cafena, acetaminofen o acido acetilsaliclico segn la muestra e indicaciones del profesor

Referencias
Principios de Anlisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001 Editorial Mc Graw Hill. Rubinson K, Rubinson J, Anlisis Instrumental. Prentice Hall, Espaa, Pg. 636-677. Ao 2001. http://www.osanet.euskadi.net/r85publ01/es/contenidos/informacion/sinopsis_ce vime/es_1225/sinopsis099.html#02 http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/painrelievers.html ttp://www.howtodothings.com/es/salud-y-vida-sana/c%C3%B3mo-utilizar-lacafe%C3%ADna-para-el-tratamiento-de-las-migra%C3%B1as.