STANDARDBASE tcnicas: cromatografa lquida de alta resolucin Drenthe College, Pases Bajos High Performance Liquid Chromatography 1.

Introduccin HPLC. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) es un modo de cromatografa, una de las ms utilizados tcnicas analticas. El proceso cromatogrfico se puede definir como la separacin tcnica que implica la transferencia de masa entre la fase estacionaria y mvil. HPLC utiliza un lquido fase mvil, para separar los componentes de una mezcla. La fase estacionaria puede ser un lquido o una fase slida. Estos componentes se disuelven primero en un disolvente, y luego forzado a fluir a travs de una columna cromatogrfica a una presin elevada. En la columna, la mezcla se separa en sus componentes. La cantidad de resolucin es importante, y es dependiente del grado de interaccin entre los componentes de soluto y la fase estacionaria. La fase estacionaria es define como el material de embalaje inmvil en la columna. La interaccin del soluto con el mvil y fases estacionarias puede ser manipulada a travs de diferentes opciones de ambos disolventes y Las fases estacionarias. Como resultado, HPLC adquiere un alto grado de versatilidad que no se encuentran en otros sistemas cromatogrficos y tiene la capacidad de separar fcilmente una amplia variedad de productos qumicos mezclas. (Fig.1)

La figura. 1 2. Teora HPLC es un dinmico proceso de adsorcin. Molculas de analito, mientras que se mueve a travs de la porosa perlas de embalaje, tienden a interactuar con los sitios de adsorcin superficial. Dependiendo del modo de HPLC, los diferentes tipos de fuerzas de la adsorcin pueden ser incluidos en el proceso de retencin: Interacciones Hidrofbicas (no especficos) son las principales separaciones en fase reversa (RP). Dipolo-dipolo (polar) las interacciones son dominantes en modo fase normal (NP). Las Interacciones inicas son las responsables de la retencin en cromatografa de intercambio inico. Todas estas interacciones son competitivas. Molculas de analito compiten con las molculas de eluyente para los sitios de adsorcin. As, las molculas de analito ms fuertes interactuar con la superficie. Cuanto ms dbil la interaccin eluyente, ms largo ser el analito ser retenido en la superficie. SEC (cromatografa de exclusin molecular) es otro caso. Es la separacin de la mezcla por el tamao molecular de sus componentes. El principio bsico de la separacin SEC es que cuanto ms grande es la molcula, menor es la posibilidad para hacerlo penetrar en el espacio poroso adsorbente. As, cuanto ms grande es la molcula de la menor ser retenida. 3. Tipos de HPLC Hay muchas formas de clasificar cromatografa de columna de lquido. Si esta clasificacin se basa en la naturaleza de la fase estacionaria y el proceso de separacin, puede ser especificado de tres modos. a. Cromatografa de adsorcin: la fase estacionaria es un gel de slice adsorbente (como o cualquier otro a base de slice de embalaje) y la separacin se basa en repetidos pasos de adsorcin-desorcin. b. Cromatografa de intercambio inico: el lecho estacionario tiene una superficie cargada inicamente de carga opuesta a los iones de la muestra. Esta tcnica se utiliza casi exclusivamente con inica o muestras ionizable. Cuanto ms fuerte es la carga en la muestra, ms fuerte ser atrado a la inica superficie y, por tanto, ms tiempo se tardar en eluir. La fase mvil es un tampn acuoso, donde tanto el pH y la fuerza inica se usan para controlar el tiempo de elucin.

c. Cromatografa de exclusin de tamao: la columna se llena con material habiendo controlado con precisin los tamaos de poro, y la muestra es simplemente seleccionado o filtrado de acuerdo a su tamao molecular solvatada. Las molculas ms grandes se lavan rpidamente a travs de la columna; molculas ms pequeas penetran en el interior de la porosa de las partculas de embalaje y eluyen ms tarde. Esta tcnica tambin se denomina filtracin en gel o cromatografa de permeacin en gel. En cuanto al primer tipo, dos modos se definen en funcin de la polaridad relativa de los dos fases: normal y cromatografa de fase reversa. En la cromatografa de fase normal, el lecho estacionario es fuertemente polar en la naturaleza (por ejemplo, gel de slice), y la fase mvil es no polar (tal como n-hexano). Muestras polares son por lo tanto retenidas sobre la superficie polar del relleno de la columna para ms tiempo que los materiales menos polares. La cromatografa en fase inversa es la inversa de esta. El lecho estacionario es (no polares) en la naturaleza, mientras que la fase mvil es un lquido polar, tal como mezclas de agua y metanol o acetonitrilo. Aqu el material no-polar, se mantendr ms tiempo. La cromatografa de fase inversa se utiliza para casi 90% de todas las aplicaciones cromatogrficas. La polaridad eluyente desempea el papel principal en todos los tipos de HPLC. Hay dos tipos de elucin: isocrticas y gradiente. En el primer tipo, la composicin de eluyente constante se bombea a travs de la columna durante la anlisis conjunto. En el segundo tipo, la composicin de eluyente (y fuerza) es cada vez cambiado durante la ejecucin. HPLC en comparacin con la tcnica clsica de LC se caracteriza por: alta resolucin de pequeo dimetro (4,6 mm), de acero columnas de acero, de vidrio o de titanio; relleno de la columna con partculas muy pequeas (3, 5 micras y 10); relativamente altas presiones de entrada y el flujo controlado de la fase mvil; Los detectores de flujo continuo capaz de manejar las tasas de flujo y la deteccin de pequeas muy pequea cantidades; anlisis rpido; Inicialmente, la presin fue seleccionado como el criterio principal de cromatografa lquida moderna y por lo tanto el nombre era "alta presin cromatografa lquida" o HPLC. Esta era, sin embargo, un lamentable plazo, ya que parece indicar que el mejor rendimiento se debe principalmente a la alta presin. Esto es, sin embargo, no es cierto. De hecho, el alto rendimiento es el resultado de muchos factores: muy pequeas partculas de gama estrecha distribucin de tamaos de poro y distribucin uniforme, de alta presin columna tcnicas lechada de empaque y precisos inyectores bajo volumen de muestra, el volumen baja sensible detectores y, por supuesto, buenos sistemas de bombeo. Naturalmente, la presin se necesita para permitir un dado velocidad de flujo de la fase mvil.

4. Fases Estacionarias (adsorbentes) Las separaciones por HPLC se basan en las interacciones de superficie, y dependen de los tipos de la adsorcin sitios. Modernos adsorbentes HPLC son las pequeas partculas rgidas porosas con alta superficie rea. Principales parmetros adsorbentes son: Tamao de partcula: 3 a 10 micras Granulometra: tan estrecho como sea posible, generalmente dentro de 10% de la media; El ltimo parmetro en la lista establece una qumica de superficie absorbente. Dependiendo del tipo del ligando unido a la superficie, el adsorbente podra estar en fase normal (-OH,-NH2), O de fase inversa (C5, C 8 , C 18 CN, NH 2 ), E incluso anin (CH2NR3+ Ohio - ), O catin (R-SO3 - H + ) Intercambiadores. 5. Instrumentacin HPLC sistema La instrumentacin HPLC incluye una bomba, un inyector, del detector y del sistema de datos. El corazn del sistema es la columna donde se produce la separacin. Dado que la fase estacionaria se compone de partculas micromtricas tamao de los poros, una bomba de alta presin se requiere para mover la fase mvil a travs de la columna. El proceso cromatogrfico comienza mediante la inyeccin del soluto en la parte superior de la columna. La separacin de los componentes se produce como los analitos y la fase mvil se bombea a travs de la columna. Eventualmente, cada componente eluye de la columna como una banda estrecha (o pico) en la grabadora. La deteccin de los componentes de elucin es importante, y esto puede ser ya sea selectiva o universal, dependiendo del detector utilizado. La respuesta del detector a cada componente se muestra en una pantalla de ordenador o registrador de grficos y se conoce como un cromatograma. Para recolectar, almacenar y analizar los datos cromatogrficos, se utilizan con frecuencia el ordenador, los integradores y otros equipos de procesamiento de datos.

6 Esquema de un instrumento de HPLC. (Fig.3)

fig.3

7. Las fases mviles En HPLC, el tipo y la composicin del eluyente es una de las variables que influyen en la separacin. A pesar de la gran variedad de disolventes usados en HPLC, hay varias propiedades comunes: Pureza Baja viscosidad Detector de compatibilidad Inercia qumica La solubilidad de la muestra Para el modo de fase normal, los disolventes son principalmente no polar; para fase inversa, los eluyentes son generalmente una mezcla de agua con un poco de disolvente orgnico polar tal como acetonitrilo o metanol. El tamao HPLC de exclusin tiene requisitos especiales. Los eluyentes SEC tienen que disolver polmeros, pero la ms importante es que tiene SEC eluyente para suprimir las posibles interacciones de la molcula de la muestra con la superficie del material de embalaje. 8. Descripcin del funcionamiento del instrumento Depsito de fase mvil, filtrado Bombear Inyector Columna

Detector Los datos del sistema

8,1 reservorio (depsito) de fase mvil, filtrando El tipo ms comn de depsito de disolvente es una botella de vidrio. La mayora de los fabricantes suministran estas botellas con tapas especiales, tubos de tefln y filtros para conectarse a la entrada de la bomba y al gas de purga (helio) que se utiliza para eliminar el aire disuelto. Helio de purga y almacenamiento del disolvente a helio no es suficiente para la desgasificacin de disolventes acuosos. Es til para aplicar un vaco durante 5-10 min. y luego mantener el disolvente en una atmsfera de helio. 8,2 La bomba (fig. 4) En bombas de alta presin se necesitan disolventes para forzar a travs de lechos empacados en fase estacionaria. Las partculas ms pequeas de cama requieren presiones ms altas. Hay muchas ventajas al usar partculas ms pequeas, pero que puede no ser esencial para todas las separaciones. Las ventajas ms importantes son: mayor resolucin, ms rpidos anlisis, y la carga de la muestra mayor capacidad. Sin embargo, slo las separaciones ms exigentes requieren de estos avances significativos en cantidades. Muchos de los problemas de separacin se pueden resolver con envases de partcula ms grandes que requieren menos presin. La estabilidad de caudal de la bomba es otra caracterstica importante que distingue a las bombas. Los caudales muy estables generalmente no son esenciales para la cromatografa analtica. Sin embargo, si el usuario planea usar un sistema en el modo de exclusin de tamao, entonces debe haber una bomba que proporciona una velocidad de flujo extremadamente estable. Una caracterstica adicional encontrada en las bombas ms elaboradas es el control electrnico externo. Aunque aumenta el coste de la bomba, el control electrnico externo es una caracterstica muy deseable cuando gradientes de automatizacin o controlada electrnicamente se van a ejecutar. Alternativamente, esto se convierte en una caracterstica no deseable (ya que es un gasto innecesario) cuando se utilizan mtodos isocrticas. El grado de control de flujo tambin vara con el gasto de la bomba. Las bombas ms caras incluyen el estado, estado-de-la-ms-alta-tecnologa de retroalimentacin electrnica y configuraciones de mltiples cabezas. Las bombas modernas tienen los siguientes parmetros:

Rango de caudal: 0,01 a 5 mL / min Flujo de la estabilidad del tipo: no ms del 1% Para el flujo de SEC estabilidad de la tasa debe ser inferior a 0,2% Presin mxima: hasta 300 hPa. Es deseable disponer de un sistema de desgasificacin integrado, ya sea de helio de purga, o membrana de filtrado.

8,3 inyector Una Introduccin de la muestra se puede lograr de varias maneras. El mtodo ms simple es utilizar una Vlvula de inyeccin. En sistemas ms sofisticados LC, los dispositivos automticos de toma de muestras se incorporan donde la muestra se introduce con la ayuda de inyectores automticos y microprocesadores. En la cromatografa lquida, las muestras lquidas se pueden inyectar directamente muestras slidas y slo necesita ser disuelto en un disolvente apropiado. La necesidad disolvente no ser la fase mvil, pero con frecuencia es juiciosamente elegido para evitar la interferencia detector, columna / interferencia componente, la prdida en eficiencia o todos estos. Siempre es mejor para eliminar las partculas de la muestra por filtracin a travs de un filtro de 5 micras o centrifugacin, ya que las inyecciones continuas de material en partculas eventualmente causan obstrucciones en inyeccin dispositivos o columnas. Los tamaos de muestra pueden variar ampliamente. La disponibilidad de detectores de alta sensibilidad con frecuencia permite utilizar de las muestras pequeas que producen el mayor rendimiento de la columna. Masa de la muestra tpica con 4,6 columnas mm ID variar desde el nivel nanogramo hasta aproximadamente 2 mg diluidos en 20 ml de disolvente. En en general, se observ que la preparacin de la muestra mucho menos se requiere en LC que en GC desde los compuestos no deseados o interferir, o ambos, a menudo puede ser extrado, o eliminado, por deteccin selectiva. Ejemplos de inyectores vase la figura 5 y 6.

8.4 Columna Las columnas de HPLC tpicos son 5, 10, 15 y 25 cm de longitud y estn llenos de pequeo dimetro (3, 5 o 10 mM) partculas. El dimetro interno de las columnas es habitualmente 4,6 mm, lo que se considera la mejor compromiso para la capacidad de la muestra, el consumo de fase mvil, la velocidad y resolucin. Sin embargo, si las sustancias puras se recogieron (a escala preparativa), entonces grandes columnas de dimetro puede ser

necesario. Embalaje del tubo de columna con partculas de pequeo dimetro requiere gran habilidad y especializada equipo. Por esta razn, generalmente se recomienda que todos, pero el ms experimentado cromatgrafos comprar columnas preenvasados, ya que es difcil para que coincida con el alto rendimiento de columnas de LC embalan profesionalmente sin una gran inversin en tiempo y equipo. En general, las columnas de LC son bastante durable y se puede esperar una larga vida til a menos que sean utilizado de alguna manera que es intrnsecamente destructivo, como por ejemplo, con muy cida o bsica eluyentes, o con inyecciones continuas de "sucios" muestras biolgicas o crudo. Es aconsejable inyectar un poco de mezcla de ensayo (en condiciones fijas) en una columna cuando es nuevo, y para retener el cromatograma. Si se obtienen resultados cuestionables ms tarde, la mezcla de ensayo se puede inyectar de nuevo bajo condiciones especificadas. Los dos cromatogramas pueden ser comparados para determinar si o no la columna es siendo til. 8.5 Detector Hoy en da, los detectores pticos se utilizan ms frecuentemente en los sistemas de cromatografa de lquidos. Estos detectores de pasar un haz de luz a travs de la columna efluente que fluye a medida que pasa a travs de una baja volumen (10 l) de la clula de flujo. Las variaciones en la intensidad de la luz causada por la absorcin UV, fluorescencia emisin o cambio en el ndice de refraccin, de los componentes de la muestra pasan a travs de la clula, son monitoreada como cambios en la tensin de salida. Estos cambios de tensin se registran en una cinta de grabadora y con frecuencia se introducen en un ordenador para proporcionar el tiempo de retencin y los datos del rea del pico. El detector ms comnmente usado en LC es el detector de absorcin ultravioleta (fig. 8). Una variable detector de longitud de onda de este tipo, capaz de seguimiento 190 a 400 nm, se ha encontrado adecuado para la deteccin de las muestras de la mayora. Otros detectores en uso comn incluyen: fotodiodo array detector UV (PAD), el ndice de refraccin (RI), fluorescencia (FLU), electroqumicos (EC). El detector RI es universal, pero tambin menos la una sensible. Detectores de la gripe y la CE son muy sensibles (hasta el 10-15 pmol), pero tambin bastante selectivo.

8.6 Datos del sistema Puesto que la seal del detector es electrnica, utilizando modernas tcnicas de recoleccin de datos pueden ayudar a la seal anlisis. Adems, algunos sistemas pueden almacenar los datos en una forma recuperable para altamente sofisticado ordenador de anlisis en un momento posterior. El objetivo principal en el uso de sistemas electrnicos de datos es para aumentar la exactitud y precisin de anlisis, mientras que la reduccin de la atencin del operador. Hay varios tipos de sistemas de datos, cada uno diferente en trminos de funciones disponibles. En el anlisis de rutina, donde no hay automatizacin (en trminos de gestin de datos o proceso de control) es necesario, un integrador de computacin pre-programado puede ser suficiente. Si la mayor los niveles de control se desea, un dispositivo ms inteligente es necesario, tal como una estacin de datos o miniordenador. Las ventajas de los procesadores inteligentes en cromatgrafos se encuentran en varios reas. En primer lugar, las opciones adicionales de automatizacin ms fcil de implementar. En segundo lugar, los datos complejos anlisis se vuelve ms factible. Estas opciones de anlisis incluyen caractersticas tales como parmetro de ejecucin optimizacin y de convolucin (es decir, resolucin) de la superposicin de los picos. Por ltimo, las salvaguardias de software puede ser diseado para reducir el mal uso accidental del sistema