UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO TECNOLOGA DE ALIMENTOS III PRCTICA N 4: MTODO COLORIMTRICO PARA LA DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES

Y ALBMINA.
I. INTRODUCCIN Las protenas son compuestos orgnicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en la naturaleza y esenciales para la vida. Actan como elementos estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de enzimas, hormonas, anticuerpos, factores de coagulacin, etc. Una manera de evaluar la eficiencia de los mtodos de extraccin de protenas es determinando el contenido de protena solubles que se obtienen despus de la etapa de extraccin. II. OBJETIVOS. -Determinar el contenido de protenas totales. -Determinar el contenido de albmina. III.MARCO TERICO. FUNDAMENTO DEL MTODO: Determinacin de Protenas totales: Los enlaces peptdicos de las protenas reaccionan con el in cprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con mximo de absorcin a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentracin de protenas totales en la muestra.

Determinacin de Albmina: La albmina reacciona especficamente sin separacin previa- con la forma aninica de la 3,3,5,5- tetrabromo cresolsulfon ftalena (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de albmina presente en la muestra.

IV. MATERIALES Y MTODOS.

REACTIVOS PROVISTOS:

-Reactivos EDTA/Cu: Complejo EDTA /Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril polister (AAP). -Reactivo BCF: solucin de 3,3,5,5- tetrabromo cresolsulfon ftalena (en polioxietiln lauril ter) -Suero patrn: Solucin de albmina y globulinas en estado nativo con ttulo conocido de protenas (Biuret o Kjeldhal) y albmina. MATERIAL REQUERIDO -Espectrofotmetro o fotocolormetro. -Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados. -Tubos de Fotocolorimetro o cubetas espectrofotomtricas. -Bao de agua a 37C -Reloj o timer. Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: Si la muestra no procesa inmediatamente la muestra puede conservarse hasta 3 das en refrigerador (2 -10C) o una semana en congelador.

1.- DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES. CONDICIONES DE REACCIN -longitud de onda: 540 nm de espectrofotmetro o fotocolormetro con filtro verde (520 -560 nm). -Temperatura de reaccin: 37C -Tiempo de reaccin: 15 minutos. -Volumen de muestra: 50 ul -Volumen de reactivo EDTA/Cu: 3.5 ml -Volumen final de reaccin:3.55 ml PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolormetro marcados B(Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar: Agua destilada B 50 ul S D -

Suero patrn Muestra Reactivo EDTA/Cu

3.5 ml

50 ul 3.5 ml

50 ul 3.5 ml

Mezclar con varilla. Incubar 15 minutos a 37C. Leer en espectrofotmetro a 540 nm o en fotocolormetro con filtro verde (520-560 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo.

Estabilidad de la mezcla de reaccin final. El color de la reaccin es estable durante 12 horas por lo que la absorbancia debe ser leda dentro de ese lapso.

DETERMINACIN DE ALBUMINA: Condiciones de reaccin: -Longitud de onda: 625 nm en espectrofotmetro o en fotocolormetro con filtro rojo (620-650 nm). -Temperatura de reaccin: 15-28C. -Tiempo de reaccin: 10 min. -Volumen de muestra: 10 ul. -Volumen de reactivo BCF: 3,5 ml. -Volumen final de reaccin: 3,51 ml.

PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolormetro marcados B(Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar: B Suero patrn Muestra Reactivo BCF 3,5 ml S 10 ul 3,5 ml D 10 ul 3,5 ml

Mezclar con una varilla. Mantener los tubos entre 15 y 28 C durante 10 minutos. Leer en espectrofotmetro a 625 nm o en fotocolormetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo. Estabilidad de la mezcla de reaccin final. El color es estable 20 minutos por lo que la absorbancia debe ser leda dentro de ese lapso.

CALCULO DE LOS RESULTADOS

Protenas totales (g/dl) = D x f

Donde: f = P.T (g/dl) / S

Albmina (g/dl) = D x f Donde: Alb. (g/dl)/S

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES. VI.CONCLUSIONES. VII. REFERENCIAS BIBLIOGFICAS.

ANEXOS DETERMINACION DE PROTEINAS SOLUBLES POR METODO DE BIURET PREPARACIN DEL REACTIVO DE BIURET Para 0.5 L de reactivo de Biuret y 0.5 L de Blanco de Biuret:
1. NaOH 6 mol/L: Disolver 24 g de NaOH en agua recin destilada (para

minimizar CO2), enfriar y diluir a 0.1 L. Guardar en botella de polietileno muy bien cerrada a temperatura ambiente.
2. Reactivo de Biuret (CuSO4 12 mmol/L, Tartrato de sodio y potasio 32

mmol/L, KI 30 mmol/L, NaOH 0.60 mol/L): Disolver 1.5 g de sulfato de cobre (CuSO4.H2O) en 250 ml de agua recin destilada. Aadir 4.5 g de tartrato de sodio y potasio y 2.5 g de ioduro de potasio. Despus que se hayan disuelto los slidos, aadir 50 ml de 6.0 mol/L NaOH y diluir a 0.5L con agua destilada. 3. Blanco de Biuret: Preparar igual que el reactivo de Biuret pero omitir el sulfato de cobre. 4. Estndar de protena (albmina, 60 70 g/L): Use una solucin de albmina bovina pura que haya sido analizada por otros medios. El estndar puede ser preparado mediante la adicin de 12 ml de una solucin de azida de sodio 1.5 mmol/L (0.1 g/L) a 1 g de albmina de suero bovino en polvo en un beaker pequeo y agitando para disolver. Si se cuenta con un espectrofotmetro ultravioleta con un ancho de banda de 2 nm o menos, aadir 100 ul de la solucin a 10 ml de agua y leer la absorbancia a 280 nm en una cubeta de 1 cm. Dividir la absorbancia por 0.661 y multiplicarla por 101 (factor de dilucin) para obtener la concentracin de albmina bovina (g/L). PROCEDIMIENTO 1. Pipeterar 5 ml del reactivo de Biuret en una serie prueba de tubos y 5 ml del blanco de Biuret en una serie blanco.

2. Pipetear 100 ul de espcimen (suero o protena estndar) en cada tubo de la serie. Mezclar bien con vortex o por inversin repetida despus de cubrir los tubos con parafilm. Preparar un blanco de muestra, mediante la adicin de 100 ul de agua a 5 ml del reactivo de Biuret. 3. Incubar los tubos a temperatura ambiente por 30 minutos o a 37C por 10 minutos. 4. Fijar la absorbancia en cero a 540 nm con el blanco del reactivo de Biuret. Leer las absorbancias de la serie blanco, luego leer las absorbancias del blanco de muestra y la serie prueba. 5. Calcular de la siguiente manera: a. Sustraer tanto los blancos de reactivo y el blanco de muestra de las absorbancias (A) obtenidas para la serie prueba. Aneta = Aprueba Ablanco reactivo Ablanco muestra El blanco de muestra con el reactivo de Biuret deber leer 0.095 0.105 para un tubo de 1 cm de paso de luz para el reactivo descrito. Los blancos para especmenes usualmente leen menos de 0.010 si el suero es claro. b. Calcular: (Aneta muestra / Aneta estndar) * [estndar] = [muestra] Donde: A = absorbancia [estndar] = concentracin del estndar (g/L) [muestra] = concentracin de la muestra (g/L)

Si el resultado excede los 120 g/L repetir el ensayo diluyendo el espcimen con un volumen igual de 0.15 mol/L de NaCl y multiplicar el resultado por 2. 6. Preparar una curva estndar para verificar que la reaccin es lineal desde 10 a 120 g/L con el reactivo usado. Si la concentracin de la muestra no cae dentro del rango de linealidad, el valor calculado no es correcto. Use 100 ul de las diluciones apropiadas en NaCl 0.15 mol/L del estndar (60 70 g/L) para producir valores en el rango de 10 60 g/L y cantidades incrementadas de estndar no diluido (150 y 200 ul) para dar valores de 60 a 120 g/L. Las cantidades incrementadas subirn el volumen total ligeramente; corregir las absorbancias netas observadas multiplicndolas por (volumen total / 5.1) antes de plotear.