CITOMETRA DE FLUJO SIMPLIFICADA

Francisco No Hernndez Jaime. Dinmica celular/UACM nada humano me es ajeno/ Agosto 2012 Cinco son los componentes principales de un clitmetro de flujo Fuente de luz, Cmara de flujo, Sistema ptico, Convertidores analgicos digital y fotomultiplicadores, Ordenador. Las partculas a analizar deben constituir una suspensin, las partculas son transportadas individualmente a travs de la cmara de flujo donde convergen con el haz de luz causando dos tipos de dispersin en el mismo las conocidas como Forward Scatter (luz dispersada alrededor del eje del haz de luz asociada al tamao de las partculas) y Side Scatter (luz dispersada de forma ortogonal al haz de luz que representa la luz reflejada por estructuras internas o de la superficie del interior de las partculas que se analizan y es interpretada como ndice de granularidad. La utilizacin de florocromos permite detectar y cuantificar un gran nmero de parmetros. La fluorescencia emitida por los florocromos al ser excitados por el haz de luz, genera informacin acerca de su presencia en clulas o partculas individuales. La determinacin de la fluorescencia permite una deteccin sensible de diferencias cuantitativas entre clulas o partculas. Al igual que la dispersin de luz, la fluorescencia se emite en todas las direcciones, pero es monitorizada por un detector ptico en posicin ortogonal con respecto al haz de iluminacin. Pueden ser cuantificadas emisiones de varios florocromos diferentes en la misma clula, usando espejos dicroicos, que son separadores del haz luminoso, y filtros que seleccionan longitudes de onda adecuadas. RESULTADOS: De cada una de las partculas que atraviesan el laser se registran una serie de parmetros que en el caso de una clula pueden ser los diferentes florocromos detectados, la complejidad de su citoplasma as como el tamao celular. Dependiendo del nmero de parmetros a comparar se pueden realizar diferentes tipos de representacin. HISTOGRAMA: Representa la presencia de un nico parmetro por ejemplo la longitud de onda de un florocromo en el eje horizontal muestra las diferentes intensidades mientras que en el eje vertical se muestran el numero de clulas que emitieron luz de esa intensidad y color. (Imagen 1) a partir de una intensidad concreta se considera resultado positivo para ese florocromo

DOT BLOT: Se evalan dos parmetros representando a las clulas como un punto segn el valor de esos parmetros, estas representaciones son tiles cuando dos linajes celulares presentan un mismo parmetro (A) pero solo uno de ellos presenta un segundo parmetro (B), si ambos parmetros son dicotmicos es decir positivos o negativos podemos dividir el grafico en 4 cuadrantes un primer cuadrante doble positivo (A+,B+), un segundo cuadrante doble negativo (A-,B-), un tercer y cuarto cuadrante positivo y negativo para los parmetros (A-,B+), (A+,B-) EJEMPLO: se tienen los siguientes datos para partculas marcadas con florocromos que reflejan una intensidad de florescencia verde y roja, las intensidades que se consideran positivas para cada florescencia se muestran en la tabla
intensidad fluorescencia verde

Resultado Negativo Positivo

intensidad fluorescencia roja

Resultado Negativo Positivo

[10 -10 ) (101-104]

[10 -10 ) (101-104]

EL Grafico muestra un cuadrante doble positivo con un 3% de los eventos, un cuadrante rojo Positivo-verde negativo con un 4% de los eventos, un cuadrante rojo negativo-verde positivo con un 4O% de los eventos y un cuadrante doble negativo con el resto del porcentaje.

DENSITY DOT-PLOT: Son una variacin de los graficos Dot-Blot en los que la proporcin de las clulas en cada regin se definen por una escala de color o por gradientes de curvas de contorno.