Tema 5.

Enzimas

Bioqumica y Biologa Molecular

TEMA 5

ENZIMAS
1. Introduccin 2. Las enzimas como catalizadores 3. Nomenclatura y clasificacin de enzimas 4. Cofactores enzimticos 5. Modelos de actuacin de las enzimas 6. Cintica enzimtica 7. Inhibicin enzimtica 8. Reacciones multisustrato 9. Regulacin enzimtica

1. Introduccin La vida depende de la existencia de unos catalizadores muy potentes y altamente especficos denominados enzimas. De hecho, todos los pasos de todos los procesos metablicos estn catalizados por enzimas y la capacidad cataltica se considera, junto con la capacidad de autorreplicacin, una de las caractersticas fundamentales de la vida. Con la excepcin de un pequeo grupo de molculas de RNA cataltico (los ribozimas), todas las enzimas conocidas son protenas. El nombre de enzima ("en la levadura") no se emple hasta 1877, pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores biolgicos intervenan en muchos procesos. As en 1850, Louis Pasteur concluy que la fermentacin de azcar en alcohol por levaduras estaba catalizada por lo que llam fermentos, que l consideraba inseparable de las clulas de levadura vivas. En 1897, Bchner, consigui extraer las enzimas que catalizaban la fermentacin alcohlica de las clulas de levadura, terminando as con la teora vitalista. No obstante hubo que esperar hasta 1926, cuando Sumner consigui purificar y cristalizar por primera vez una enzima, la ureasa, para demostrar su naturaleza proteica. En la actualidad se conocen ms de 2000 enzimas diferentes, muchas de las cuales se han aislado en forma pura. Se utilizan potentes tcnicas de purificacin y secuenciacin, tcnicas de difraccin de rayos X, RMN, etc., para conocer su estructura, y tcnicas de

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mutagnesis dirigida para conocer ms sobre su funcionalidad y sus mecanismos de actuacin.

2. Las enzimas como catalizadores La funcin principal de las enzimas es actuar como catalizadores de las reacciones de los seres vivos; como tales catalizadores tienen ciertas caractersticas que vamos a estudiar a continuacin. Todas las reacciones qumicas tienen lugar porque cierta fraccin de la poblacin de molculas reactantes poseen la suficiente energa como para alcanzar un estado activado, llamado estado de transicin, en el que es muy elevada la probabilidad de que se rompan o se establezcan enlaces para formar los productos. Este estado de transicin reside en la cima de la barrera energtica que separa los reactantes de los productos, como muestra la Figura 1. En ella se observa el diagrama de energa para una reaccin qumica, no catalizada y catalizada, donde la energa libre de activacin es la cantidad de energa necesaria para llevar todas las molculas de un mol de sustancia, a una temperatura determinada, al estado de transicin.

Figura 1. Evolucin energtica de una reaccin qumica. Se observa la diferencia energtica entre los estados de transicin de las reacciones catalizada y no catalizada.

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Existen dos mtodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una reaccin qumica. Uno de ellos es la elevacin de la temperatura (ya que provoca un incremento en la velocidad de las molculas); el otro consiste en utilizar un catalizador. El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio activndolos, produciendo un estado de transicin de menor energa que en la reaccin no catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda libre, y puede ser de nuevo utilizado. La Tabla 1 muestra una comparacin de las energas de activacin para la descomposicin del perxido de hidrgeno, en ausencia o presencia de un catalizador. En ella se puede apreciar cmo el catalizador enzimtico baja an ms la barrera energtica que ha de superarse desde el nivel de reactivos para alcanzar el estado de transicin. Esta es una caracterstica comn de las enzimas. Su alto poder cataltico se debe en parte a su alta especificidad por los sustratos, la cul puede ser absoluta para un nico sustrato o relativa, cuando permite la reaccin de compuestos diferentes pero con una estructura similar.

Tabla 1 Descomposicin enzimtica del agua oxigenada. comparacin de las energas de activacin para la descomposicin del perxido de hidrgeno, en ausencia o presencia de un catalizador

Reaccin

Catalizador

Temperatura (C)

Energa (Kcal/mol)

Descomposicin de H2O2

Ninguno Fe2+ Catalasa

20 22 22

18 10 1,7

La especificidad de las enzimas es muy importante para los seres vivos. Cada clula contiene varios cientos de miles de compuestos diferentes, y existen muchas combinaciones posibles entre las reacciones qumicas que estos compuestos pueden experimentar. Las enzimas cuidan de que tengan lugar, de manera

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especfica, aquellas reacciones que son esenciales e indispensables para que la clula viva. Adems de la especificidad y la alta eficiencia, otras dos caractersticas que diferencian a las enzimas de los catalizadores qumicos, son que las enzimas pueden saturarse por sustrato y tienen capacidad para regular su actividad.

3. Nomenclatura y clasificacin de las enzimas Muchas enzimas han sido designadas aadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, la molcula sobre la cul ejerce su actividad cataltica. Por ejemplo la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea, y la arginasa cataliza la hidrlisis de la arginina (a urea y ornitina). Otras enzimas han recibido su nombre en funcin del tipo de reaccin que catalizan; as la Gliceraldehdo-3P-deshidrogenasa cataliza la oxidacin del la Gliceraldehdo-3P. Incluso algunas se conocen de hace mucho tiempo y mantienen su nombre, sin dar informacin alguna del sustrato o la reaccin que catalizan (tripsina). No obstante existe una clasificacin sistemtica de las enzimas que las divide en 6 grandes grupos, cada uno de los cuales se divide a su vez en subclases: 1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reduccin) 2: Transferasas (transfieren grupos funcionales) 3: Hidrolasas (reacciones de hidrlisis), 4: Liasas (reacciones de adicin a los dobles enlaces) 5: Isomerasas (reacciones de isomerizacin) 6: Ligasas (formacin de enlaces con consumo de ATP). A cada enzima se le asigna un nmero con cuatro componentes. Los tres primeros indican la clase, subclase y sub-subclase, respectivamente, y el ltimo es un nmero de orden. As, por ejemplo, la enzima alcohol deshidrogenasa, que cataliza la oxidacin de etanol a acetaldehdo, y por lo tanto pertenece al grupo 1, se designa como EC 1.1.1.1. La Tabla 2 muestra la clasificacin internacional de las enzimas en los seis grupos antes citados.

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Tabla 2 Clasificacin internacional de enzimas.

4. Cofactores enzimticos La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como protena, mientras que otras necesitan, adems, uno o ms componentes no proteicos, llamados cofactores. El cofactor puede ser un ion metlico o bien una molcula orgnica, llamada coenzima, aunque algunos enzimas necesitan de ambos. El cofactor puede estar fuertemente unido a la protena (suele ser el in metlico, aunque puede igualmente ser un coenzima) y recibe entonces el nombre de grupo prosttico, o dbilmente unido, por lo que en realidad acta como un sustrato especfico de la enzima (co-sustrato; suele ser una molcula orgnica, coenzima). La Tabla 3 muestra una relacin de iones metlicos que actan como cofactores de enzimas.
Tabla 3 Iones metlicos como cofactores.

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La Tabla 4 muestra algunos de los coenzimas ms habituales en la catlisis enzimtica.

Tabla 4 Algunos coenzimas mayoritarios en catlisis enzimtica.

El complejo enzima-cofactor catalticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la protena restante, que por s misma es inactiva catalticamente, se designa con el nombre de apoenzima.

HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR

Centro activo Apoenzima Holoenzima Cofactor

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En las enzimas el cofactor puede actuar como centro cataltico primario, grupo puente para reunir el sustrato y la enzima agente estabilizante de la actividad enzimtica (conformacin). Por su parte cada uno de los coenzimas catalogados suele contener en su estructura, alguna vitamina (sustancias orgnicas que, en cantidades mnimas, son vitales para el funcionamiento de todas las clulas, y deben figurar en la dieta de algunas especies) o molcula derivada de ella. Los coenzimas actan por lo general como transportadores intermedios de tomos especficos o de electrones.

5. Modelos de actuacin de las enzimas Para explicar la actividad cataltica de las enzimas, se ha propuesto un mecanismo general, en dos etapas:

S + E

ES

P + E

En la primera etapa, la enzima (E) se une a la molcula de sustrato (S), para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En una segunda etapa, el complejo se fragmenta dando lugar al producto (P) y a la enzima (E), que vuelve a estar disponible para reaccionar con otra molcula de sustrato. Por lo general, la molcula de enzima es mucho mayor que la del sustrato por lo que slo una pequea parte de la enzima est implicada en la formacin del complejo; esta regin que interacciona con el sustrato y en la que tiene lugar la reaccin, se denomina sitio activo de la enzima. El sitio activo es una regin tridimensional de la enzima con una distribucin de los grupos nica para posibilitar la unin a su sustrato especfico. Dichos grupos del enzima no tienen por qu ser necesariamente consecutivos en la secuencia de la protena y reciben el nombre de centros catalticos. El modelo ms conocido sobre el mecanismo de reaccin de las enzimas es el de Fischer, quien propuso que la molcula de sustrato se adapta al centro activo de la enzima del mismo modo que lo hara una llave al encajar en una cerradura, es decir, que tienen una relacin estructural complementaria (Figura 2). No obstante, esta hiptesis tiene ciertas limitaciones: si el centro activo posee una estructura prediseada para el sustrato, en caso de que sea reversible el proceso dicho
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debera estar perfectamente diseado para que tambin encaje el producto de la reaccin. De la misma forma, la teora de la llave-cerradura tampoco explica bien el fenmeno de la inhibicin enzimtica.

Figura 2. Modelos de accin enzimtica. Modelo llave-cerradura de Fischer.

Otra hiptesis ms aceptada actualmente es la del enzima flexible o de ajuste inducido (modelo de Koshland), que sugiere que el sitio activo no necesita ser una cavidad geomtricamente rgida y preexistente, sino que dicho sitio activo debe tener una disposicin espacial, precisa y especfica, de ciertos grupos de la enzima que en presencia del sustrato se adaptan a su estructura cuando interaccionan con l (Figura 3).

Figura 3. Modelos de accin enzimtica. Modelo de ajuste inducido de Koshland.

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Independientemente del modelo, una vez formado el complejo enzima sustrato, mediante un mecanismo de distorsin, se activan los enlaces que hay que romper y se aproximan los grupos que hay que enlazar, favoreciendo la formacin del producto resultante de la reaccin catalizada y quedando la enzima libre para comenzar de nuevo el proceso cataltico. La Figura 4 muestra el caso de una enzima (carboxipeptidasa) que nos sirve para ilustrar el modelo de Koshland, en ella se puede ver como en el sitio activo, en el que se encuentran los centros catalticos (Arg-145, Glu-270, tyr-248) y el cofactor (Zn), posee una conformacin inicial que se modifica al interaccionar con el sustrato y formal el complejo [ES].

Figura 4. Modelo de ajuste inducido de Koshland. Carboxipeptidasa.

6. Cintica enzimtica. Los principios generales de la cintica de las reacciones qumicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, estas muestran (adems del fenmeno de la especificidad, antes comentado) un rasgo caracterstico que no se observa en los catalizadores no enzimticos, se trata de la saturacin por el sustrato, entendida en trminos de ocupacin de los centros activos de todas las molculas de enzima. Estudiar el efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de una enzima no es sencillo si pensamos que lgicamente la concentracin del sustrato disminuye

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segn avanza la reaccin. Una simplificacin en los experimentos cinticos consiste en medir la velocidad inicial (Vo). Si el tiempo es suficientemente corto la disminucin de sustrato ser mnima y sta podr considerarse, por tanto, casi constante. La Figura 5 muestra el efecto de distintas concentraciones de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin catalizada por un enzima.

Figura 5. Cintica enzimtica. Modelo de Michaelis-Menten.

En la cintica enzimtica de la Figura 5 se distinguen tres fases:

Para una concentracin baja de sustrato, la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin del sustrato (relacin lineal), la cintica es de primer orden. Para una concentracin alta de sustrato, la velocidad de la reaccin se hace prcticamente constante e independiente de la concentracin de sustrato, la cintica se considera de orden cero.

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Para concentraciones de sustrato intermedias la velocidad del proceso deja de ser lineal, y a esta zona se la denomina de cintica mixta.

Este comportamiento es caracterstico de la mayora de las enzimas y fue estudiado por Michaelis y Menten en 1913. La velocidad de una reaccin catalizada nos indica la cantidad de sustrato consumido, o producto formado, por unidad de tiempo. En el Sistema Internacional se designa por U (unidad de actividad enzimtica) y corresponde a los moles de sustrato consumidos en 1 min, o bien a los moles de producto formado en 1 min.

1 U mol S/min mol P/min

La curva que expresa la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad inicial tiene la misma forma para la mayora de las enzimas; se trata de una hiprbola rectangular, cuya expresin algebraica viene dada por la Ec. MichaelisMenten.

Los trminos Vmax (velocidad mxima) y Km (constante de Michaelis) son dos parmetros cinticos caractersticos de cada enzima, que pueden determinarse experimentalmente. La velocidad mxima se obtiene cuando la velocidad de reaccin se hace independiente de la concentracin de sustrato. Este valor depende de la cantidad de enzima que tengamos. La Km nos indica la concentracin de sustrato a la cul la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima, este parmetro es independiente de la concentracin de enzima, y es caracterstico de cada enzima segn el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km tambin indica la afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo sta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto menor sea la Km menor ser la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad mxima, por lo que mayor ser la afinidad del enzima hacia ese sustrato.

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La ecuacin de Michaelis-Menten puede deducirse matemticamente haciendo la aproximacin del estado estacionario, segn esta aproximacin la concentracin del complejo ES es constante en el estado estacionario y por lo tanto las velocidades de formacin y destruccin del complejo ES son iguales. Adems, asumimos que el paso limitante de la reaccin es el segundo y por lo tanto la velocidad de la reaccin es: Vo=K2 [ES].

Velocidad formacin del complejo ES = Velocidad destruccin del complejo ES K1[E][S]= K-1 [ES] + K2[ES] K1[E][S]= (K-1 + K2 ) [ES] La concentracin de enzima libre ser igual a la concentracin total de enzima menos lo que est unido al sustrato. [E]=[ Et ]-[ES], as que: K1[ Et ][S]- K1[ ES ][S] = (K-1 + K2 ) [ES] K1[ Et ][S]= (K-1 + K2 + K1[S]) [ES] Despejando [ES] se obtiene un trmino constante formado por las tres constantes e igual a la constante de Michaelis (Km). El trmino K1[ Et ] ser precisamente la V (velocidad mxima) cuando todo el enzima est unido al sustrato formado un complejo ES, o sea, cuando la enzima est saturada por el sustrato, es decir: K1[ Et ]=Vmax. De modo que la forma final de la ecuacin de Michaelis-Menten es:

A partir de esta ecuacin podemos explicar matemticamente las tres fases de la curva de Michaelis.
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A baja [S] (es decir, si Km >>> [S]) el trmino Km+[S] podemos aproximarlo a la Km, quedando un expresin del tipo: V = k [S]

Esta es una cintica de primer orden, que se caracteriza por una variacin lineal de la V respecto al tiempo.

A altas [S] (es decir, Km<<<<[S]) despreciaramos Km frente a [S], con lo que V = Vmax (que sera constante); la cintica es de orden cero y se habra alcanzado la saturacin por sustrato. El tramo intermedio, en el que la [S] Km correspondiente a una cintica de orden mixto y se ajusta a la ecuacin de Michaelis.

En muchos casos es de vital importancia conocer estos parmetros cinticos. En principio, podran obtenerse de forma poco rigurosa a partir de la curva de Michaelis Menten, pero existen mtodos grficos ms fiables que facilitan el clculo preciso de la Km y la Vmax. Los clculos se hacen en base a transformaciones matemticas de la ecuacin de Michaelis; una de las expresiones ms utilizadas es la representacin de Lineweaver-Burk, tambin conocida como de dobles inversos (Figura 6). En esta forma de clculo se representa 1/V frente a 1/S, obtenindose una recta cuya interseccin con el eje X es 1/Km y con el eje Y es 1/Vmax, siendo la pendiente Km/Vmax.

Figura 6. Cintica enzimtica. Representacin de Lineweaver-Burk. 84

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7. Inhibicin enzimtica Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad cataltica, ralentizando o paralizando la reaccin enzimtica. A estas sustancias se las denomina inhibidores enzimticos. Teniendo en cuenta que las reacciones qumicas en la clula estn catalizadas por enzimas, es fcil intuir el papel de muchos inhibidores enzimticos que actan como frmacos, antibiticos o conservantes; otros pueden ser txicos, potentes venenos. Por ejemplo, la aspirina (acetilsalicilato) inhibe la enzima que cataliza el primer paso en la sntesis de prostaglandinas, implicadas en la produccin del dolor. Se conocen dos tipos principales de inhibicin: la reversible y a la irreversible. La primera implica una unin no covalente del inhibidor y, por lo tanto, siempre puede revertirse. En la inhibicin irreversible, el inhibidor se une al enzima de forma covalente y permanente.

Inhibicin reversible: los distintos modelos de inhibicin reversible implican todos la unin no covalente del inhibidor con la enzima, pero difieren en los mecanismos por medio de los cuales reducen la actividad enzimtica y en la forma en que afectan a la cintica de la reaccin. Entre ellos estn la inhibicin competitiva, la acompetitiva y la no competitiva.

El inhibidor competitivo, es una sustancia similar en estructura al sustrato, con quien compite por el sitio activo de la enzima.
K1 K-1 K2

E+S ES+I

ES EIS

E+P

Ki

Como consecuencia, aunque la velocidad mxima no se altera, para alcanzarla sera necesario poner ms cantidad de sustrato en el medio de reaccin, lo que se refleja en la correspondiente curva de Michaelis como un aparente aumento de la Km (la enzima en presencia del inhibidor perdera

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afinidad por el sustrato). La representacin de dobles inversos (Figura 7) permite observar la variacin de la Km.

Figura 7. Inhibicin competitiva. Clculo de parmetros cinticos mediante la representacin de dobles inversos.

La eficacia de un inhibidor competitivo depende de su concentracin respecto a la del sustrato. Si hay un exceso de inhibidor ste bloquear los centros activos de las molculas de enzima, resultando una inhibicin total. No obstante, el proceso es reversible si se procura exceso de sustrato, que desplazara totalmente al inhibidor.

El inhibidor acompetitivo reacciona con la enzima en un punto distinto al centro activo, pero slo en el caso de que sta est unida al sustrato formando el complejo ES; de esta forma impide que la enzima desarrolle su actividad cataltica.

E+S ES+I

K1

ES EIS

K2

E+P

K-1 Ki

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Tanto la Vmax como la Km se alteran en la misma proporcin, lo que se manifiesta en la representacin de dobles inversos como rectas paralelas y por lo tanto con la misma pendiente (Figura 8).

Figura 8. Inhibicin acompetitiva. Clculo de parmetros cinticos mediante la representacin de dobles inversos.

Se observa cmo se produce, aparentemente, una disminucin de la Vmax y un incremento de la Km.

El inhibidor no competitivo puede combinarse tanto con la enzima libre como con el complejo enzima-sustrato, sin afectar al sitio activo de la enzima.

E+S E+I ES+I

K1 K-1 Ki Ki2

ES EI EIS

K2

E+P

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Al no unirse el inhibidor al sitio activo, no se afecta la afinidad de la enzima por el sustrato y en este caso la Km no se altera y la Vmax disminuye, como puede observarse en la representacin de dobles inversos (Figura 9).

Inhibicin no competitiva

1/V

Con I Sin I

1/V max

Figura 9. Inhibicin no competitiva. Clculo de parmetros cinticos mediante la representacin de dobles inversos.
1/Vmax - 1/Km 0

1/[S]

En la inhibicin irreversible, el inhibidor se une covalentemente a la enzima y la inactiva de manera irreversible. Casi todos los inhibidores irreversibles son sustancias txicas naturales o sintticas. Se trata de sustancias que reaccionan con algn grupo funcional importante para la catlisis, bloquendolo e impidiendo que la enzima desarrolle su actividad. En muchos casos la interaccin se produce a travs del sitio activo, impidiendo de manera irreversible que el sustrato ocupe su lugar; tal es el caso del gas Sarn, que inhibe irreversiblemente enzimas implicadas en la transmisin del impulso nervioso y su inhalacin causa parlisis rpida de las funciones vitales.
K1 K-1 K2

E+S E+I

ES EI

E+P

En la inhibicin irreversible, cuando el inhibidor afecta al sitio activo se observara una situacin similar a la inhibicin competitiva, una disminucin de la Vmax y un aumento aparente de la Km, si bien el proceso sera completamente irreversible por sustrato, incapaz ste de desplazar al inhibidor del sitio activo. La inhibicin
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enzimtica por modificacin covalente constituye adems una importante forma de regulacin metablica, como veremos en prximos apartados.

8. Reacciones multisustrato En este captulo hemos estudiado reacciones del tipo S-P, un mecanismo relativamente simple con un solo sustrato que podra ajustarse a reacciones catalizadas por algunas enzimas (isomerasas, hidrolasas, algunas liasas) pero es importante tener en cuenta que la gran mayora de las reacciones son multisustrato y suelen dar varios productos. Cuando una enzima une dos o ms sustratos y libera mltiples productos, el orden de los pasos para a ser una caracterstica importante del mecanismo de reaccin. Hay distintos mecanismos que explican este tipo de reacciones, veamos varios casos en los que se utilicen dos sustratos S1 y S2 y se obtengan dos productos P1 y P2.

Unin ordenada de los sustratos: en este caso un sustrato debe unirse antes de que el segundo sustrato pueda unirse.

Unin aleatoria de los sustratos: en este caso cualquiera de los dos sustratos puede ser el primero en unirse a la enzima. Mecanismo ping-pong: en este caso primero se une un sustrato, se libera el primer producto, y a continuacin se une el segundo sustrato para as liberar el segundo producto.

9. Regulacin enzimtica Una caracterstica que diferencia las enzimas de los catalizadores qumicos convencionales es su capacidad para regular su propia actividad. Una enzima puede ser ms o menos activa gracias a la existencia de distintos niveles de regulacin:

Nivel de sntesis: que haya ms o menos molculas de la enzima (ya lo veremos).

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Nivel de actividad: que las molculas de enzima existentes estn ms o menos activas. Puede llevarse a cabo por factores extrnsecos a la enzima, pH, T, [S], [I], o por factores intrnsecos a la propia enzima; en este caso hablamos de enzimas reguladoras, enzimas que por su propia naturaleza tienen mecanismos especiales de regulacin. Estn especializadas en regularse respondiendo de forma muy sensible a seales externas.

En la clula las enzimas operan en grupo, en rutas constituidas por varios pasos enzimticos. En cada ruta hay al menos una enzima reguladora que determina la velocidad de toda la ruta. La modulacin de las enzimas reguladoras ocurre mediante diferentes mecanismos:

Enzimas alostricas. Funcionan mediante la unin reversible no covalente de compuestos regulatorios llamados moduladores. El modulador puede ser una activador (modulacin positiva) o un inhibidor (modulador negativo) y ser el propio sustrato de la reaccin (alosterismo homotrpico) o ser otra sustancia (alsoterismos heterotrpico). Normalmente se trata de enzimas multimricas y normalmente el sito activo y el regulatorio se encuentran en distintas subunidades. Enzimas interconvertibles Por modificacin covalente reversible, como por ejemplo por fosforilacin/defosforilacin o modificacin redox. Mediante protenas reguladoras que se unen a la enzima. Mediante la eliminacin proteoltica de pequeos segmentos peptdicos (esto es irreversible).

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