CONSUMO DE OXGENO POR POS FERMENTACIN DE LEVADURA EN VINO: FACTORES QUE
AFECTAN SU VELOCIDAD Y EXTENSIN EN CONDICIONES ENOLGICAS.
Volker Schneider, Jonas Mller, y Dominik Schmidt3 Resumen Las las de levadura de vino pos fermentado muestran propiedades antioxidantes basadas en su capacidad de consumir oxgeno disuelto. La capacidad de consumo de oxgeno de las las de levadura suspendidas obtenidas despus de las fermentaciones con seis cepas de levadura seca activas comerciales se investig en vinos modelo, blanco y rojo utilizando sensores de oxgeno basados en fluorescencia que operan de forma no destructiva. En la solucin modelo, se mostr que la tasa de consumo de oxgeno de las las de levadura dependa de su cantidad, cepa de levadura, dixido de azufre y temperatura. Es ligeramente ms bajo en vinos rojos que en blancos. Est fuertemente disminuido por los niveles actuales de dixido de azufre libre, excluyendo as el uso complementario de ambos como antioxidantes en el vino. Sin embargo, en 25 vinos blancos muestreados aleatoriamente producidos en condiciones comerciales, la tasa y el alcance del consumo de oxgeno durante los primeros seis meses de post fermentacin no tuvieron una correlacin significativa con ninguno de estos factores que interactan, por lo que es difcil predecir el efecto antioxidante real de las las de levadura. En estos vinos, las las de levadura consumieron del 0 al 47% del oxgeno disuelto. Aunque la capacidad total de consumo de oxgeno de las las de levadura no es un factor limitante en las condiciones vitivincolas comerciales, su consumo de oxgeno avanza a un ritmo limitado que reduce pero no puede evitar totalmente la oxidacin qumica concomitante del vino. Palabras clave: vino, las de levadura, oxgeno disuelto, oxidacin, dixido de azufre, consumo de oxgeno I. Introduccin Al final de la fermentacin alcohlica, las clulas de levadura comienzan a autorizarse. La autolisis de levaduras es un proceso lento caracterizado por la hidrlisis de los biopolmeros intracelulares por las enzimas de levadura activadas tras la muerte celular. Como resultado, los compuestos citoplsmicos y de la pared celular se liberan en el vino con diversas consecuencias enolgicas y sensoriales. Con el objetivo de hacer un uso deliberado de este proceso, envejecer en las las se ha convertido en un concepto enolgico para perseguir objetivos estilsticos especficos. Este concepto se basa en la suposicin de que, despus de la fermentacin primaria, los las consisten predominantemente de clulas de levadura. Se hace una distincin entre las ligeros que permanecen en suspensin y las pesadas que se depositan en el fondo del recipiente. Las mano protenas extradas de las las de levadura contribuyen al volumen del paladar y disminuyen la astringencia de los taninos, mejorando as la sensacin en la boca y la estructura. Tambin pueden contribuir a la estabilidad de las protenas y los bitartratos. Los steres, nucletidos, pptidos y aminocidos liberados de las las de levadura pos fermentacin proporcionan precursores del sabor y mejoran la complejidad del sabor (1,2). Algunos de estos compuestos amino, como el glutatin y la cistena, pueden ayudar a proteger contra la oxidacin (3). Las clulas de levadura absorben el fdcvoxgeno disuelto (DO), retirndolo de las reacciones de oxidacin (4) Sin embargo, cuando las las de levadura se dejan demasiado tiempo y se compactan en el fondo del recipiente de envejecimiento en condiciones anaerbicas, pueden comenzar a producir compuestos voltiles de azufre que afectan negativamente el sabor (5). La acumulacin de compuestos de levadura en el vino se interrumpe mediante la eliminacin de la levadura por filtracin, mientras que el mantenimiento de la levadura en suspensin al agitar las las acelera su liberacin. En su formato tradicional, el envejecimiento de las las se lleva a cabo en vinos blancos almacenados en barriles durante varios meses a ms de un ao. Durante este perodo, se evita que las las que se dejan despus de la fermentacin se sedimenten mediante agitacin peridica denominada btonnage, o enrollando los barriles. Btonnage, como se practica tradicionalmente, estimula la disminucin del dixido de azufre libre y la absorcin del oxgeno atmosfrico debido a la eliminacin del tapn y el proceso de agitacin, Sin embargo, el bantenaje no es intrnsecamente oxidativo ya que la oxidacin se amortigua mediante la absorcin de DO por levadura (4) y la liberacin de aminocidos reductores (3). El rgimen de agitacin, la cantidad de levadura y el control de SO 2 determinan si el envejecimiento en las heces es ms reductivo u oxidativo (6). La tasa de absorcin de DO de la levadura durante el envejecimiento en las de levadura se cuantific en 0,003 a 0,011 mg / (L h) por 109 de clulas de levadura del segundo al sexto mes de envejecimiento a 14 C (4). Las tasas iniciales de consumo de DO y su decaimiento gradual e irregular durante el envejecimiento del vino fueron fuertemente dependientes de las cepas de levadura, con 11 a 100% de la tasa inicial de consumo de DO restante despus de cuatro meses de envejecimiento (4). En trabajos posteriores, el consumo de oxgeno por las levaduras no viables se atribuy a una va mayoritariamente no respiratoria que utiliza el oxgeno para la oxidacin de los lpidos de membrana (7,8) y ergosterol (9) que conduce a la produccin de perxidos lipdicos y productos finales desconocidos, lo que confirma los hallazgos anteriores sobre la levadura de cerveza (10). Estas reacciones dependen del NADPH (11) y se suspenden despus de la pasteurizacin (4). Cuando se agrega oxgeno en exceso durante la fermentacin alcohlica, la reactividad de las las de levadura hacia la disminucin del oxgeno debido a la degradacin del esterol dependiente del oxgeno (12). Se demostr que la respiracin solo interviene en la absorcin de oxgeno por las las de levadura durante las primeras tres semanas despus de la fermentacin (4) ya que el 99% de las clulas de levadura mueren dentro de las dos semanas posteriores a la fermentacin (13). Contrariamente a estos estudios, trabajos anteriores han demostrado que durante la oxigenacin de cultivos sumergidos de postfermentacin Clulas de S. cerevisiae, el oxgeno tambin se usa para la formacin de acetaldehdo mediante la actividad del etanol deshidrogenasa unida a la levadura (14,17). Adems, se observ un aumento de la concentracin de acetaldehdo cuando los vinos de mesa blancos sin filtrar se sometieron a una absorcin involuntaria de oxgeno durante el trasiego y el almacenamiento, lo que requiri, en ltima instancia, mayores adiciones de SO2 para unirlo (18). Aunque la mayora de estas investigaciones se llevaron a cabo en el contexto del envejecimiento del barril, la capacidad de la fermentacin posterior a la lea para consumir DO sugiere que pueden actuar como un agente reductor de una manera ms general. Su consumo de DO se recuper durante el almacenamiento y las operaciones de la bodega protegeran los constituyentes del vino contra la oxidacin qumica. La evidencia histrica confirma que los las de levadura retrasan el tostado de los vinos blancos expuestos al oxgeno atmosfrico en ausencia de dixido de azufre libre. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es proporcionar datos extensos sobre la tasa y el grado en que el DO presente en el vino es consumido por cantidades variables de las de levadura suspendidas en comparacin con los vinos filtrados, el efecto de algunos parmetros tcnicos sobre la velocidad de esta reaccin, su importancia en condiciones prcticas de vinificacin, II. Materiales y mtodos Evaluacin de la biomasa de levadura y el nmero de clulas Las las de levadura suspendidas se cuantificaron mediante mediciones nefelomtricas de turbidez usando un turbidmetro Hach 2100Q (Loveland, CO, EE. UU.) Calibrado con estndares de formazina primaria y expresado en unidades de turbidez nefelomtrica (NTU). Las medidas nefelomtricas de turbidez de las diluciones en serie en la solucin modelo de suspensiones de levadura obtenidas despus de la fermentacin de un jugo de uva filtrado produjeron una curva de correlacin que mostr linealidad por debajo de 40 NTU con R = 0.9995. En consecuencia, todas las mediciones de muestra se llevaron a cabo despus de la dilucin con solucin modelo a menos de 40 NTU para medir en el rango lineal. La turbidez de la muestra original luego se calcul a partir del factor de dilucin. En un segundo paso, las suspensiones de levadura se usaron para contar clulas en un hemocitmetro Fuchs-Rosenthal (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) despus de una dilucin adecuada de 10 a 40 NTU. Se realiz el conteo celular de 40 cuadrados de unidades en cada una de las ocho gotas y se calcul el nmero medio de clulas por ml. Los nmeros de clulas de levadura de las diluciones seriadas se correlacionaron con las lecturas de NTU. La correlacin produjo 6.3 104 clulas por ml por 1 NTU. Brind la base para convertir las concentraciones de levadura reportadas en NTU en este trabajo. III. Vinos y levaduras El consumo de oxgeno por las clulas de levadura se estudi en solucin modelo y en los vinos de los que se originaron. Los vinos y las heces de levadura se obtuvieron de las bodegas locales. La vinificacin se realiz utilizando procedimientos estndar, con la excepcin de que el jugo se aclar a menos de 20 NTU de turbidez residual usando enzimas pectolticas, seguido de la adicin de 2 g / L de bentonita de tres a cinco horas ms tarde, sedimentacin, flotacin o filtracin. En estas condiciones de zumos de uva altamente clarificados, los slidos de los vinos resultantes consistan predominantemente (> 98%) de clulas de levadura. Despus de la clarificacin, se inocularon los diferentes jugos que contenan 200 a 220 g / L de azcar inicial con 20 g / hL de cepas de levadura seca activas disponibles comercialmente. Las fermentaciones y el posterior almacenamiento entre 8 y 15 C se llevaron a cabo en tanques de acero inoxidable. No se aadi oxgeno durante la fermentacin. Las cepas de levadura utilizadas para la inoculacin y ms investigacin fueron Lalvin CY 3079 (Lallemand, Montreal, Canad), Lalvin EC 1118 (Lallemand), Lalvin RC 212 (Lallemand), Fermicru VB 1 (Oenobrands, Montpellier, Francia), Coleccin Cpage Sauvignon (Oenobrands ) y SIHA Riesling Yeast (Eaton, Langenlonsheim, Alemania). Ensayos de consumo de oxgeno disuelto La solucin modelo contena 13% (en volumen) de alcohol en agua destilada. Despus de la adicin de 8 g / L de cido tartrico, el pH se ajust a 3.5 usando NaOH al 10%. Para controlar el consumo de levadura disuelta (DO) en solucin modelo, se extrajo levadura de vinos blancos jvenes despus de la fermentacin a sequedad (<2 g / L de azcar) y antes de la aparicin de la fermentacin malolctica (<0,2 g / L de cido lctico) Se muestrearon partes alcuotas de vino de 750 ml en botellas purgadas con nitrgeno y se centrifugaron (4 min, 3000 x g). La suspensin de levadura obtenida se lav y diluy en la solucin modelo a las concentraciones deseadas segn se determin midiendo la turbidez nefelomtrica de las suspensiones. Las mediciones de consumo de oxgeno comenzaron inmediatamente despus de la dilucin, ya que se ha demostrado que el almacenamiento de levaduras en soluciones acuosas da como resultado valores incrementados debido a los cambios fisiolgicos de las clulas (10). Para controlar el consumo de DO de levadura en vinos sin filtrar, se tomaron muestras de 750 ml de los tanques de almacenamiento en diferentes momentos y se dividieron en dos alcuotas. Se us una alcuota para la medicin del consumo de DO sin tratamiento adicional. La otra alcuota se aclar por centrifugacin y filtracin a travs de una membrana de 0,6 m (modelo 11305; Sartorius, Gttingen, Alemania) para servir como una referencia sin levadura en las mediciones de consumo de DO. Para la evaluacin del efecto de la matriz del vino en el consumo de DO por levadura, los vinos filtrados en forma estril se complementaron con lechada de levadura a las concentraciones deseadas. Monitoreo de la cintica del consumo de oxgeno El oxgeno disuelto se determin mediante un mtodo no invasivo de extincin de luminiscencia utilizando un medidor de oxgeno de fibra ptica de canal nico Fibox 3 Trace junto con sensores de oxgeno luminiscentes PSt3 (PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Alemania). La sonda Fibox 3 mide el tiempo de cada de la luminiscencia de los puntos del sensor de luminforo montados dentro de un vaso de vidrio transparente. El sensor de luminforo se excita con una luz monocromtica modulada de intensidad sinusoidal entregada por la fibra ptica. Su tiempo de cada provoca un retraso de tiempo en la seal de luz emitida por el luminforo. El tiempo de cada disminuye en presencia de oxgeno. Por lo tanto, la excitacin del sensor genera una respuesta proporcional a la cantidad de OD alrededor del sensor. Los puntos de mini sensor sensibles al oxgeno se encolaron con silicona en las posiciones centrales en la pared interna de matraces de 100 ml, lo que les permiti estar en contacto con el lquido. Luego, los matraces se llenaron hasta el borde con una solucin modelo o vino previamente suministrado con oxgeno atmosfrico a una concentracin de saturacin cercana (aproximadamente 7 mg / L) mediante agitacin intensa. Posteriormente, los matraces se sellaron con tapones roscados provistos de un revestimiento de cono de plstico que garantiza la exclusin de cualquier burbuja de aire en la interfaz entre el lquido y la tapa interna. Las condiciones de almacenamiento y tratamiento de muestras complementarias se especifican en la seccin Resultados. Se obtuvieron lecturas DO de los lquidos sin abrir los matraces, apuntando la fibra ptica de transferencia de luz en los puntos del sensor a travs del vidrio. Las mediciones se realizaron con una velocidad de grabacin de un punto de lectura por tres segundos. Las lecturas se tomaron como vlidas cuando la desviacin estndar fue <2%, despus de lo cual se calcul la media. El rango de medicin DO fue de 0 a 22 mg / L con un lmite de deteccin de 0.015 mg / L. La calibracin manual se aplic utilizando los datos de calibracin por lotes obtenidos del fabricante. La agitacin recurrente de los matraces cerrados evit la sedimentacin de las las, imitando as las condiciones de almacenamiento ms reales. Las lecturas de DO fueron realizadas peridicamente hasta agotarse (0.2 mg / L), y los datos de OD se trazaron en funcin del tiempo. De acuerdo con la forma y la ecuacin de las curvas obtenidas, la interpretacin de los datos se realiz de dos maneras diferentes: en las soluciones modelo, la pendiente lineal de la curva proporcion la tasa de consumo de oxgeno (OCR) en mg / (L h) de levadura directamente. En vinos reales que muestran una forma de curva lineal, el OCR de la levadura se obtuvo mediante la sustraccin del OCR de un blanco filtrado. Sin embargo, en muchos vinos, el cambio de OCR en el tiempo se ajust mejor con una funcin exponencial independientemente de la presencia o ausencia de levadura. Esto permiti calcular el porcentaje y la cantidad absoluta de DO consumida por la levadura. Para ese propsito,a travs de anlisis de regresin en dos funciones matemticas y normaliz ambas funciones al mismo punto cero antes de integrarlas a lo largo del tiempo. La divisin de la integral de la alcuota no filtrada por la integral del blanco filtrado proporcion el efecto de DO consumido en porcentaje que no pudo atribuirse al efecto de la levadura sino a la oxidacin qumica de la matriz del vino. La parte restante correspondi al efecto de la levadura en la disminucin general de OD expresada en porcentaje. Capacidad total de consumo de oxgeno La capacidad total de consumo de oxgeno de las suspensiones de levadura se midi en la solucin del modelo en condiciones de posible suministro de oxgeno de hasta 80 mg / L, utilizando un ensayo manomtrico estndar diseado originalmente para la evaluacin de la demanda biolgica de oxgeno del agua (OxiTop , WTW, Weilheim, Alemania). Los volmenes definidos de suspensiones de levadura lavadas a fondo se transfirieron a botellas de color mbar de 500 ml selladas hermticamente con sensores de presin manomtrica. Las botellas se agitaron continuamente a 200 rpm y a 20 C en una plataforma de agitacin magntica de 6 posiciones para asegurar el suministro constante de oxgeno desde el espacio superior durante el experimento. La disminucin de la presin controlada se relacion con el consumo de oxgeno que, a su vez, se grafic con el tiempo. Se utiliz un conjunto de control que no contena levadura para corregir la absorcin de oxgeno de la matriz de la solucin modelo. La desviacin estndar de la medicin fue 10% de las lecturas. Anlisis qumicos El acetaldehdo, el dixido de azufre libre, el cido lctico y el azcar residual se midieron enzimticamente utilizando kits de prueba apropiados (R-Biopharm AG, Darmstadt, Alemania). Anlisis estadstico Todos los anlisis estadsticos se realizaron con el software R v. 3.2.1 (19). Los grficos se obtuvieron utilizando el paquete 'ggplot2' (20); Se produjeron modelos de regresin lineal y no lineal utilizando el paquete 'nls2' (21). Resultados Efecto de la concentracin de levadura en OCR La solucin modelo se eligi para estudiar el efecto de la concentracin de levadura en su capacidad para consumir DO. Por lo tanto, se evit cualquier interferencia de los componentes del vino oxidable. Las concentraciones de levadura ensayadas fueron 5, 25, 50, 100, 200, 300 y 400 NTU. El consumo de oxgeno en cada lote fue casi constante durante las pruebas, siguiendo una cintica de orden cero que permiti expresar el OCR en mg / (L h) de oxgeno (fig. 1). Figura 1 Tasa de consumo de oxgeno (OCR) de las cepas de levadura en la solucin modelo a 20 C segn se ve afectada por la concentracin de levadura. Las levaduras se cosecharon y se ensayaron una o tres semanas despus del final de la fermentacin alcohlica. (SO2) libre = 0 mg / L; N = 2; NTU = nefelomtrico Aunque todas las levaduras se cosecharon y se ensayaron dentro de un mes despus del final de la fermentacin alcohlica, hubo notables diferencias en el OCR entre las cepas de levadura a concentraciones determinadas. Sin embargo, estas diferencias deben considerarse con precaucin, ya que podran verse afectadas por variables matriciales y tcnicas, as como por un consumo residual y respiratorio de DO. Las tasas de consumo reproducibles requeran un mnimo de 50 NTU de levadura. Por encima de ese nivel mnimo, el OCR vari de 0.27 a 2.09 mg / (L h). Curiosamente, el OCR no siempre aumenta con el aumento de las concentraciones de levadura en una forma proporcional, es decir, el OCR por clula disminuye a densidades celulares ms altas. En estos casos, cuando el OCR se grafica contra NTU, la pendiente de la curva obtenida sugiere un comportamiento de tipo Michaelis-Menten. Este patrn ha sido observado por otros autores (11) y se cree que es causada por un impedimento estrico de difusin de oxgeno a nivel de partculas como resultado de la presencia fsica de clulas de levadura, haciendo que la difusin de OD en el lquido sea la etapa limitante de la velocidad. Sin embargo, dado que este comportamiento no pudo verificarse en todo el conjunto de datos, se utiliz un modelo lineal de anlisis de regresin para probar el efecto de la concentracin de levadura en el OCR. Como era de esperar, podra confirmarse que las concentraciones de levadura elevadas conducen a un aumento de OCR (nivel de confianza del 99.9%). Esta tendencia general es vlida para todas las cepas de levadura en consideracin. Los datos por debajo de 50 NTU se descuidaron ya que el lmite de cuantificacin no permiti mediciones reproducibles. Efecto de la temperatura en el OCR Dado que el consumo de DO de las clulas de levadura se basa en la oxidacin de compuestos de membrana de levadura complejos, se espera que dependa tambin de la temperatura. El efecto de la temperatura en las cepas de levadura con concentraciones ajustadas a 200 NTU se evalu en la solucin modelo a 20, 15 y 5 C. El consumo de DO sigui una cintica de orden cero para cada temperatura (tabla 1). tabla 1 Efecto de la temperatura en la tasa de consumo de oxgeno (OCR) por diferentes cepas de levadura en solucin modelo a 20 C El uso de un modelo de regresin lineal para examinar el efecto de la temperatura y las cepas de levadura en el OCR muestra que la temperatura tiene una influencia significativa (nivel de confianza del 99%). Este comportamiento se encontr de cada una de las diferentes cepas de levadura en un grado variable, con niveles de confianza para las diferencias entre las cepas de levadura que van del 90 al 99%. Bajo las condiciones de almacenamiento de vino fro, el OCR de las clulas de levadura disminuye notablemente. Este efecto de temperatura est de acuerdo con los resultados de un estudio clsico que muestra que las tasas de consumo de OD obedecen a la ecuacin de Arrhenius cuando la relacin de la tasa de consumo a la temperatura se calcula como una constante cintica (22). Sin embargo, la tasa de consumo de oxgeno de los vinos filtrados tambin avanza a una velocidad menor cuando la temperatura disminuye (6). Por lo tanto, cuando las las de levadura y los compuestos de matriz de vino oxidables compiten por DO en vinos reales, la contribucin porcentual de levadura al consumo total de oxgeno no se ve necesariamente afectada por la temperatura. Efecto del dixido de azufre libre en el OCR Dado que la mayora de los vinos se almacenan con concentraciones variables de dixido de azufre libre despus de la fermentacin, otra cuestin pertinente es si las adiciones de SO 2 tendrn algn efecto en el OCR de las clulas de levadura posteriores a la fermentacin. Las mediciones de OCR de las seis cepas de levadura suspendidas a 200 NTU en la solucin modelo enriquecida con cantidades crecientes de SO2 mostraron un fuerte efecto supresor de SO2 (fig. 1). Con un pH de vino promedio = 3.5, hay un lmite crtico alrededor de 20 mg / L de SO2 libre por encima del cual el OCR de la levadura se vuelve casi insuficiente para tener algn efecto prctico. Agotamiento de DO por reacciones con SO2 durante el curso del ensayo no puede explicar este comportamiento ya que aumentara el OCR cuando aumenten las concentraciones iniciales de SO 2. La razn por la cual el SO2 inhibe fuertemente la absorcin de DO por la levadura sigue siendo desconocida, pero la inhibicin de las enzimas no identificadas por SO2 podra ser una causa. Figura 2. Efecto de la SO2 libre en la tasa de consumo de oxgeno (OCR) de las cepas de levadura en la solucin modelo a 20 C. Las levaduras se cosecharon dentro de las dos semanas posteriores al final de la fermentacin alcohlica y se ajustaron a 200 unidades de turbidez nefelomtrica (NTU). Boxplots Efecto de la matriz de vino en OCR Se investig el efecto de la matriz de vino (blanco vs. vino tinto) utilizando tres cepas de levadura (CE 1118, CY 3079 y Fermicru VB 1). Se agregaron cantidades definidas de levadura cosechada despus de la fermentacin alcohlica a un vino blanco filtrado estril y tres vinos tintos diferentes (A, B y C) sin ningn dixido de azufre libre. Despus de un mes de almacenamiento en condiciones anaerbicas, los vinos se saturaron con oxgeno y se registr la disminucin de DO. Sigui un patrn casi lineal comparable al de la solucin modelo. Para calcular el OCR neto de las levaduras, se corrigi la disminucin global de DO para la unin qumica de oxgeno por los respectivos vinos sin agregarle levadura, que sirvi como un blanco. Los resultados se dan en la Tabla 2 Tabla 2 Efecto de la matriz del vino sobre la tasa de consumo de oxgeno (OCR) de la levadura suspendida en vinos reales a 20 C, afectados por la concentracin de levadura Nuevamente, el OCR no se mejora al aumentar las concentraciones de levaduras de forma lineal, confirmando as los resultados obtenidos en la solucin modelo. Adems, para concentraciones de levadura comparables, las figuras de OCR son del orden de las encontradas en la solucin modelo (Fig. 1). Sin embargo, hay una clara tendencia hacia una disminucin de la OCR de levadura en los vinos tintos en comparacin con el vino blanco. Probando la hiptesis de que la matriz de vino tinto da como resultado una OCR ms baja que la matriz del vino blanco, se usaron t-tests pareados para las tres series de experimentos. Las hiptesis fueron confirmadas para EC 1118, CY 3079 y Fermicru VB 1 en un nivel de confianza de 90, 99 y 95%, respectivamente. Este efecto matricial se ha explicado por una adsorcin parcial de polifenoles de vino tinto por levaduras. Como consecuencia, estos fenoles interactan fuertemente con los componentes de la membrana celular de la levadura responsable del consumo de oxgeno. Se supone que provocan un colapso del espacio intermembrana citoplsmico, que reduce la accesibilidad y la reactividad del oxgeno hacia los esteroles y los cidos grasos insaturados de la membrana celular. Las prdidas mayores de reactividad general de oxgeno ocurren durante los primeros diez das de contacto de levadura con polifenoles de vino tinto. Estas prdidas son irreversibles y tambin se observaron despus de que los polifenoles solubles se hubieran separado de las clulas de levadura (8,23). Contrariamente a estos hallazgos obtenidos en soluciones modelo con 3, 6 y 9 g / L de material fenlico extrado del vino tinto, el impacto de los fenoles de vino tinto en el OCR de levadura en condiciones ms realistas de vinos tintos estndar (aproximadamente 2 g / L de los fenoles totales) parece bastante insignificante. Capacidad total de consumo de oxgeno Se utilizaron tres cepas de levadura (EC 1118, CY 3079 y Fermicru VB 1) suspendidas en solucin modelo a una concentracin de 300 NTU para evaluar su capacidad total de absorcin de oxgeno y su cintica de consumo utilizando el mtodo manomtrico a 20 C. Como se muestra en la Fig. 3, el trazado de la absorcin de oxgeno frente al tiempo produjo curvas cncavas que mostraban un aumento casi lineal del oxgeno consumido al principio, seguido de una transicin a un estado estacionario que indicaba la reduccin de los recursos de absorcin de oxgeno de la levadura despus de 45 a 55 h y 40 a 60 mg / L de DO consumido. Estos resultados indican que incluso concentraciones menores de clulas de levadura suspendidas correspondientes a aprox. 50 NTU (3.15 106 clulas / mL) sera suficiente para consumir una concentracin de saturacin de DO. En condiciones de vinificacin industrial, la capacidad total de consumo de oxgeno de las las de levadura no es un factor limitante para proteger el vino contra la oxidacin. Fig. 3 La capacidad total de consumo de oxgeno y la cintica del consumo se muestran a travs del oxgeno disuelto (DO) consumido por las clulas de levadura suspendidas en una solucin modelo de 300 unidades de turbidez nefelomtrica (NTU) un mes despus de la fermentacin alcohlica. Las barras de error indican el Efectos combinados de concentracin de las, edad y SO2 libre en vinos reales. En un ensayo no estructurado, se obtuvieron muestras de 25 vinos blancos sin filtrar producidos en condiciones comerciales y fermentadas con las cepas de levadura utilizadas en este estudio. Las muestras se dividieron en dos partes alcuotas, una de ellas contena la levadura original y la otra se filtr para servir como un blanco. Despus del suministro de oxgeno por aireacin, la disminucin de DO en ambas alcuotas a 20 C se grafic con el tiempo. La concentracin de levadura en los vinos oscil entre 8 y 310 NTU, dixido de azufre inicial libre de 0 a 57 mg / L, y la edad de los vinos de 2 a 26 semanas despus de la fermentacin alcohlica. Los diagramas de disminucin de OD obtenidos fueron cercanos a funciones lineales o exponenciales dependiendo del vino individual. Ambos patrones han sido reportados por otros autores (24,25). En la mayora de los vinos filtrados, sin embargo, las parcelas tomaron la forma de una curva ms o menos convexa que se ajustaba a una funcin exponencial negativa. Corresponden a una cintica de reaccin de primer orden que indica un cambio del OCR a lo largo del tiempo y que representa la unin qumica exclusiva de DO. En los vinos sin filtrar que contenan levadura, tanto el consumo de DO por la levadura y el consumo de DO debido a la unin qumica se acumularon a un total, que an mostraba un orden de reaccin global cercano a uno que podra representarse mejor mediante una ecuacin exponencial. Fig. 4 da un ejemplo. En estas condiciones, no se obtuvieron valores de OCR realizables ya que cambian durante todo el perodo de prueba de acuerdo con la concentracin instantnea de DO (10). En cambio, el tratamiento matemtico de las ecuaciones de ambas curvas, tal como se describe en la seccin Materiales y mtodos, proporcion el porcentaje y la cantidad absoluta de DO consumida por la levadura, y la parte restante corresponde a la DO consumida por la oxidacin qumica de la matriz del vino. Fig. 4 Consumo exponencial de oxgeno disuelto (DO) en un vino blanco (43 mg / L de SO2 libre) con levadura suspendida (Fermicru VB 1, 50 NTU) y despus de la filtracin, 8 semanas despus de la fermentacin La DO consumida por la levadura oscil entre 0 y 47% (datos no mostrados). Se observaron las tendencias del gran impacto de la concentracin de levadura y SO2 libre en el consumo de DO por levaduras, lo que confirma los resultados obtenidos en la solucin modelo. Sin embargo, al utilizar los anlisis multivariados, ninguno de los parmetros probados (cepa de levadura, concentracin de levadura, vino, edad y concentracin de SO2 libre) mostr influencia significativa en la tasa de consumo de OD por levadura, expresada como el coeficiente de velocidad de reaccin de cintica de primer orden. La combinacin y la interaccin de los diversos parmetros no permiten una prediccin confiable de la reactividad de la levadura hacia DO en un vino dado. Sntesis de acetaldehdo El acetaldehdo total se midi despus del agotamiento completo de DO en los 25 vinos mencionados anteriormente. Las diferencias en la concentracin de acetaldehdo entre las alcuotas filtradas y no filtradas de cada vino no fueron significativas y no excedieron 3 mg / L (datos no presentados). Estos resultados indican que el consumo de hasta 7.5 mg / L de DO por lilas de levadura posteriores a la fermentacin de las cepas de S. cerevisiae analizadas en este estudio no provoca ningn aumento en el contenido de acetaldehdo. Sugieren la ausencia de cualquier metabolismo respiratorio, lo que apoya los hallazgos anteriores (7,10) que la OD se consume principalmente por la oxidacin lipdica. Por otro lado, dado que la viabilidad de la levadura puede variar considerablemente en la prctica, no se puede excluir que la respiracin contribuya al consumo de DO bajo diferentes condiciones enolgicas. Discusin La capacidad de consumo de oxgeno de las clulas de levadura despus de la fermentacin se conoce tanto en la industria del vino como en la de la cerveza durante un tiempo considerable. Sin embargo, no est claro cmo se ve afectada por los parmetros enolgicos, y cunta DO se consume realmente por las las de levadura en lugar de reaccionar con los constituyentes del vino intrnsecos mediante la unin qumica, lo que conduce necesariamente a la oxidacin del vino. Los las de levadura de vino suspendido pueden consumir hasta varias concentraciones de saturacin de DO, con el grado exacto dependiendo principalmente de su cantidad. Su cintica de consumo de DO vara entre un patrn lineal y una cintica de primer orden. A pesar de su considerable capacidad total de consumo de oxgeno, que depende principalmente de la oxidacin lipdica (7,10), no pueden consumir todo el oxgeno recogido por el vino. Nuestros resultados indican una unin qumica de oxgeno concomitante por los constituyentes del vino oxidables. La velocidad a la que las clulas de levadura consumen oxgeno, reportada como OCR, es un parmetro esencial para evaluar el equilibrio entre las cantidades de DO consumidas por la biomasa de levadura y por la matriz del vino, respectivamente. Se puede suponer que cuanto ms alta es la OCR de las las de levadura, menos DO est disponible para la oxidacin qumica del vino. Sin embargo, es imposible predecir hasta qu punto la levadura contribuye al consumo total de DO en condiciones vitales comerciales por dos razones: en primer lugar, las combinaciones e interacciones de parmetros enolgicos variables como la cepa de levadura, la concentracin, la edad, la matriz del vino y el SO2 libre hacen que sea difcil predecir la velocidad a la que la DO consume la levadura como tal; en segundo lugar, la tasa de unin qumica de DO a los fenlicos del vino es una variable desconocida, lo que hace que sea imposible deducir el porcentaje de DO consumido por la levadura de su OCR. Se ha demostrado por primera vez que el dixido de azufre inhibe fuertemente las reacciones involucradas en el consumo de oxgeno por las las de levadura, con niveles de ms de 20 mg / L de SO2 libre en el pH del vino que lo hace casi sin sentido. Por lo tanto, los efectos antioxidantes de los las de levadura y el dixido de azufre no pueden usarse de manera complementaria. En los vinos almacenados con concentraciones relativamente altas de SO2 libre, la proteccin contra la oxidacin de las las de levadura es menos beneficiosa que en los vinos con concentraciones bajas de sulfito. Dado que el efecto antioxidante de las las de levadura se expresa ms cuando el SO2 libre es bajo o ausente, son una valiosa herramienta de vinificacin cuando se producen vinos sin SO2 aadido. Cuando los vinos se almacenan en tanques de acero inoxidable, la exposicin inadvertida al oxgeno atmosfrico se produce durante las operaciones de la bodega, como bombeo, centrifugacin, filtracin, picado, estabilizacin en fro y transporte de vino a granel. En estas condiciones, la magnitud de la absorcin de oxgeno es altamente variable y vara de 0.1 a 3 mg / L en cada una de estas operaciones (26,29). El almacenamiento debajo del espacio superior puede proporcionar cantidades adicionales de oxgeno. Por lo tanto, se ha propuesto una filtracin retardada para hacer uso de la absorcin de oxgeno por las las de levadura y mitigar el efecto perjudicial de la absorcin incontrolada de oxgeno por los vinos blancos afrutados y sensibles al oxgeno (30). Sin embargo, la propiedad antioxidante de las las de levadura se ve disminuida en gran parte por la presencia de SO2 libre. Cuando los vinos se almacenan en barriles estndar de 225 L, la cantidad de oxgeno que reciben vara entre 10 y 45 mg / L por ao con un promedio de 20 mg / L por ao, disminuyendo con la edad de los barriles (31,32) .Suponiendo una absorcin promedio de oxgeno de 0.05 mg / L por da en el barril, se necesitara un OCR de levadura de 0.002 mg / (L h) para eliminar ese oxgeno a la velocidad que disuelve en el vino si las clulas de levadura fueran el nico oxgeno receptor. Sin embargo, una unin qumica simultnea y variable de oxgeno es inevitable. Aumenta con concentraciones crecientes de SO2 libre y disminuye el efecto reductor ejercido por las las de levadura. Como consecuencia prctica, el envejecimiento tradicional del vino blanco en condiciones semi-oxidativas en barriles se lleva a cabo con bajas concentraciones de SO2 libre y altas cantidades de las de levadura peridicamente resuspendidas por agitacin. El comportamiento redox durante el envejecimiento tradicional del barril no se aplica a los vinos blancos afrutados generalmente almacenados en tanques con mayores concentraciones de SO2 libre. El suministro continuo de oxgeno comparable al envejecimiento en barriles tambin se produce cuando los vinos tintos se someten a microoxigenacin en tanques. Las las de levadura compiten por el oxgeno con los fenoles del vino tinto y dificultan el proceso de envejecimiento del vino (8). Este hallazgo explica por qu los vinos tintos jvenes resisten ms consumo de oxgeno que los viejos despus de la clarificacin. Sin embargo, estas relaciones se complican an ms por una adsorcin parcial de los polifenoles en las membranas de las clulas de levadura, lo que reduce la reactividad global de ambas levaduras y polifenoles hacia el oxgeno (23). Nuestros resultados indican que una concentracin de levadura tpica de 100 NTU en vinos tintos jvenes puede consumir DO a razn de 0.1 a 1 mg / (L h) durante el primer mes despus de la fermentacin primaria (Tabla 2). Por lo tanto, fueron solo un poco menos efectivos que en los vinos blancos, donde consumieron hasta el 47% del DO total. Estos hallazgos indican que las las de levadura pueden consumir una cantidad sustancial de DO provista durante la micro-oxigenacin y retirarla de las reacciones con fenoles de vino tinto segn lo previsto por este tratamiento. La cuantificacin de la biomasa de levadura es esencial para el correcto funcionamiento con las de levadura. Las clulas de levadura suspendidas producen turbidez que vara en funcin de la cantidad de clulas de levadura por unidad de volumen. A diferencia del recuento de clulas, la medicin de la turbidez es un procedimiento fcilmente manejable implementado en muchas bodegas. Sin embargo, a pesar de su factibilidad para evaluar las concentraciones de levadura en la cerveza (33) o despus de la fermentacin de los jugos de uva filtrados, tiene algunas limitaciones cuando se aplica a los vinos reales. No es factible despus de la fermentacin malolctica o en vinos obtenidos de jugos mal clarificados debido a fuentes de turbiedad distintas de la levadura. En el caso de los vinos blancos, la clarificacin estricta del jugo con enzimas pectolticas se considera un factor determinante para determinar la calidad del vino. Se ha recomendado una turbidez de zumo residual de entre 50 y 100 NTU (34,35) Esta turbidez residual consiste predominantemente en partculas de tejido de fruta que tienden a sedimentarse al final de la fermentacin primaria. En estas condiciones, el uso de turbidmetros nefelomtricos puede permitir una evaluacin de la densidad celular de levadura suspendida en los vinos blancos. Sin embargo, los procedimientos de calibracin apropiados deben tener en cuenta la no linealidad de la curva de calibracin y para diferentes principios de medicin (36,37). Conclusiones El concepto novedoso de controlar el consumo de DO en el vino que contiene las de levadura en comparacin con el de una alcuota filtrada utilizado como un blanco permiti diferenciar con precisin entre las cantidades de DO consumidas por las clulas de levadura y por la matriz del vino, respectivamente. Las clulas de levadura posfermentacin aceleran significativamente la tasa de consumo de DO en vinos blancos y tintos al consumir cantidades variables de DO. De este modo, protegen el vino contra reacciones de oxidacin qumica hasta cierto punto sin producir acetaldehdo. La tasa y el alcance de este consumo de oxgeno dependen de la cantidad de las de levadura suspendidas, dixido de azufre libre, matriz de vino, temperatura, edad y cepa de levadura. Las diversas combinaciones e interacciones de estos parmetros no permiten predecir el consumo de DO y el efecto antioxidante de las las de levadura bajo condiciones de vinificacin comerciales. En el mejor de los casos, se puede afirmar que este efecto aumenta con concentraciones crecientes de clulas de levadura suspendidas, aunque no siempre de forma lineal. Por otro lado, el nivel de dixido de azufre libre es de gran importancia, disminuyendo drsticamente la tasa de consumo de oxgeno de las las de levadura y su capacidad para proteger el vino de la oxidacin. Por lo tanto, el dixido de azufre y las las de levadura no actan como antioxidantes de manera complementaria. El uso de las de levadura para prevenir la oxidacin es ms eficiente en vinos con bajo o libre de sulfitos. Expresiones de gratitud Los autores agradecen el apoyo tcnico provisto por Vino Kupljen, Jeruzalem, Eslovenia, para confirmar las conclusiones de este estudio en condiciones de vinificacin comercial. Referencias 1. 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