RFLP

Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restriccin Restriction Fragment Length Polymorphism

En 1980 Mark Skolnick, Ray White, David Bostein and Ronald Davis crearon polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin ( RFLP, pronunciado rif-lip ) marcador molecular del genoma humano. Un RFLP es definido por la existencia de una alelo alternativo asociado con fragmentos de restriccin que difiern en tamao uno de otro. RFLPS son visualizados por la digestin de DNA de diferentes individuales con restriccin de endonucleasas, seguidos por el gel de electroforesis para separar fragmentos de acuerdo al tamao, entonces Southern blotting y la hibridacin o una sonda marcada que indentifica el locus bajo investigacin. Un RFLP es demostrado cada vez que patrn obtenido del Southern blot con uno individual es diferente del obtenido con otro individual. Esas regiones variables no necesariamente ocurren en genes, y la funcin de ms de estos en el genoma humano es desconocido (1). La informacin gentica de todos los organismos est contenida en la secuencia de nucletidos del ADN de los cromosomas nucleares y el genoma de los organelos. A pesar de que el ADN es capaz de replicarse con un alto grado de fidelidad, existen diversos mecanismos que introducen cambios mutacionales a esta informacin. Es tal la cantidad de ADN en una clula eucaritica que dos organismos nunca son idnticos en las secuencias de bases de ADN que conforman su genoma. Existen por lo tanto un alto grado de variabilidad a este nivel en las poblaciones vegetales. Una forma de determinar y de utilizar esta variacin natural es mediante digestin del ADN vegetal con ciertas nucleasas provenientes de microorganismos llamadas enzimas de restriccin, las cuales reconocen secuencias de nucletidos especficos, llamadas sitios de restriccin, en las que introducen cortes para producir fragmentos. El nmero y el tamao de los fragmentos producidos por la digestin con una enzima particular reflejan la distribucin de los sitios de restriccin en una molcula de ADN particular. Los fragmentos de restriccin pueden ser separados de acuerdo a su tamao por electroforesis en gel de agarosa. Cuando la molcula de ADN es pequea, como en el caso del ADN de cloroplastos, la cantidad de fragmentos es pequea, alrededor de 40 en caso de cloroplastos, y el patrn de restriccin es fcilmente discernible. Los ADN de cloroplastos que difieren en la secuencia de bases por substituciones de estas o por arreglos causados por inserciones, deleciones o inversiones, producirn fragmentos de restriccin de diferentes tamaos, estas diferencias se conocen como polimorfismos en el largo de los fragmentos de restriccin o RFLP y pueden ser usados como una medida directa de la variabilidad gentica (2).

RFLPS y Polimorfismos RFLPs son las variaciones estructurales en el DNA entre alelos y puede ser usado como marcadores genticos para mapear genes y especificar lugares en un cromosoma, diagnosticar enfermedades o como simulacin de huellas dactilares. Los polimorfismos son las diferencias en una secuencia de ADN debido a mutaciones. Los polimorfismos son utilizados por los cientficos como los marcadores de ADN. Cuando el DNA es cortado en fragmentos por enzimas de restriccin, los polimorfismos provocaran que el DNA sea cortado en diferentes fragmentos. Cuando el DNA es eletroforetizado, habr un nuevo bandeado patrn. Todos los organismos vivos con polimorfismos sin cambios hacen que su patrn de banda sea nico (3). Secuencia polimrficas. Las secuencias polimrficas (tambin conocidas como secuencias annimas, loci annimoss, loci polimrficos, marcadores annimos o marcadores polimrficos) son secuencias de ADN que, normalmente, no codifican para un producto gnico, se distribuyen de forma ms o menos aleatoria a los largo del genoma y presentan como caracterstica singular el hecho de ser polimrficas. Esta ltimo hecho es de suma importancia pues confiere a este tipo de secuencias, la caracterstica primordial del anlisis gentico, la variabilidad. Las variantes de un locus es lo que conocemos como alelos. Ya hemos utilizado este concepto anteriormente al hablar de los alelos de loci implicados en enfermedades. Sin embargo, este tipo de alelos son, afortunadamente, muy poco frecuentes y no nos seran tiles en los estudios de ligamiento. Por el contrario las secuencias annimas o loci polimrficos presentan por definicin varios alelos con una frecuencia significativamente alta en la poblacin (superior al 1% para el menos frecuente) Si el locus a, que est implicado en una enfermedad hereditaria, esta ligado al locus b, que es una secuencia annima de ADN. Lo primero que necesitaremos ser identificar las variantes de la secuencia annima en cada uno de los miembros de la familia y estudiar su segregacin juntamente con la de la enfermedad. La aplicacin de diversos mtodos estadsticos nos permitir establecer la existencia o no de ligamiento entre los dos loci investigados y estimar la distancia que los separa. En los estudios de ligamiento la distancia que separa a dos loci se mide en funcin de la frecuencia en que ambos recombinan. La unidad de distancia es el centimorgan (cM) . Si dos loci recombinan en el 1% de las meiosis, decimos que les separa una distancia de 1 cM. La frecuencia de recombinacin entre dos loci puede variar desde 0 (decimos entonces que dichos loci estn ntimamente ligados) hasta el 50% y decimos entonces que son independientes. Aunque no nos podemos extender aqu sobre este aspecto, no existe siempre una relacin lineal entre distancia gentica (frecuencia de recombinacin medida en cM) y distancia fsica (nmero de nucletidos

que las separan, medida en pares de bases). Para frecuencias de recombinacin inferiores al 20% se puede establecer una relacin de 106 pares de bases por cada 1% de recombinacin (4). El uso de los RFLPs en el genoma nuclear o mitocondrial puede ser muy til para el aislamiento de genes relacionados con la patogenicidad y la virulencia a travs de chromosome walking y por otro lado el polimorfismo en el ADN ribosomal (ADNr) logra ser informativo hasta el nivel de especie para muchos hongos. Algunas de las extensivas aplicaciones de esta tecnologa en los hongos entomopatgenos, son los estudios de discriminacin de especies, patotipos (razas), grados de virulencia, estudio de orgenes geogrficos, de poblacin y mecanismos de recombinacin gentica (5). Beneficios de Anlisis RFLP A pesar del hecho de que es menos difundidas hoy, ha habido numerosos beneficios a los anlisis de RFLP. Desempea un papel importante al permitir a los cientficos a mapear el genoma humano, as como proporcionar informacin sobre las enfermedades genticas. RFLP es til para encontrar dnde un gen especfico para una enfermedad se encuentra en un cromosoma. Esto se logra observando el ADN de un conjunto de miembros de la familia que sufren de la enfermedad y la bsqueda de alelos de RFLP que comparten el mismo tipo de patrn de herencia de la enfermedad. Mediante el uso de anlisis de RFLP, los cientficos son capaces de determinar otros que podran estar en riesgo de la enfermedad o de un portador del gen mutado. Adems de sus beneficios para las pruebas de enfermedades genticas, RFLP fue tambin uno de los primeros mtodos utilizados para la tipificacin gentica tambin conocida como la huella gentica, los perfiles o ensayos. Esta aplicacin se utiliza para proporcionar un perfil gentico de una persona, que podra ser utilizado para comparar las muestras en la escena del crimen o para averiguar la paternidad de una persona. No slo eso, pero el anlisis RFLP tambin tuvo papeles en ayudar a nuestra comprensin de los aspectos genticos de los patrones de reproduccin de varios animales diferentes. Desafos de Anlisis RFLP A pesar de sus muchos beneficios y til solicitudes anteriores, el anlisis de RFLP sigue siendo un proceso lento y tedioso ms en comparacin con algunas de las tcnicas de anlisis ms recientes de ADN. No slo eso, sino que requiere de mucho mayor tamao de las muestras que otras formas de anlisis. En RFLP, la muestra general, tendra que ser aproximadamente del tamao de una moneda de una libra. Mientras que puede parecer pequea, es grande en relacin a otras tcnicas como el anlisis de PCR que requieren slo unas pocas clulas para la secuenciacin de xito. La duracin del proceso en s es largo y tomar hasta un mes para llevar a cabo. Reacciones en cadena de polimerasa (PCR) se han convertido en un sustituto de muchas de las aplicaciones anteriores de RFLP. Hoy en da, RFLP tiene variaciones como el polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin terminal (TRFLP), que tiende a tener aplicaciones relacionadas con la caracterizacin de las bacterias y las comunidades relacionadas. Es algo as

como una mezcla de PCR y RFLP. La tcnica utiliza la amplificacin por PCR del ADN con cebadores que tienen una etiqueta fluorescente. Despus de los productos de la PCR se digieren las enzimas RFLP, los patrones que se producen se pueden ver con una secuencia de ADN, que luego son analizados. RFLP ya no puede ser ampliamente utilizado, pero todava ha sido importante para establecer nuestra comprensin del anlisis de ADN, a la vez que estimular el desarrollo de tcnicas nuevas y ms eficientes. Es probable que las tcnicas actuales hagan lo mismo en el futuro por su refinamiento y reemplazo con ms tipos avanzados de anlisis de ADN (6).

RAPDS Polimorfismo de ADN Amplificado al Azar Random Amplified Polymorphic DNAs

La simplicidad y la aplicabilidad de la tcnica RAPD han cautivado los intereses de muchos cientificos. Tal vez la razn principal para el xito del anlisis de RAPD es la ganancia de un gran nmero de marcadores genticos que requieren pequeas cantidades de ADN sin el requisito para la clonacin, la secuenciacin o cualquier otra forma de la caracterizacin molecular del genoma de la especie en cuestin (7). La Tcnica basada en PCR para DNA, es llamada RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Marcadores RAPD son generados en una simple y estandarizada reaccin de PCR donde el primer del PCR consiste en secuencias la azar (tpicamente 10-15 bp de longitud). Siempre que sea el primer PCR tiene secuencia homologa con el DNA templado, estos se unen y los productos de PCR de variable peso molecular seran generados. Ningn conocimiento de secuencias de organismos es requerida para realizar un anlisis RAPD; sin embargo las condiciones debe mantenerse constante para obtener patrones de bandas reproducibles. Esta tcnica es til cuando se sabe poco sobre el genoma del organismo que se analiza. RAPD anlisis se utilizan comnmente en las cepas de bacterias, y para el anlisis de la variacin del genoma en plantas entre mltiples otras aplicaciones (1). Casi todos los marcadores RAPD son dominantes, es decir no es posible distinguir si un segmento de ADN es amplificado de un locus que es heterocigoto ( 1 copia) o homocigoto ( 2 copias). Marcadores codominantes observados de diferente tamao de segmentos de DNA amplificado del mismo locus, son detectados raramente. PCR es una enzimtica reaccin por lo tanto la calidad y la concentracin del templado de DNA, las concentraciones de los componentes y las condiciones del PCR pueden influir en el resultado. Por lo tanto, la tcnica de protocolos de laboratorio al desarrollarse necesita de cuidado para que pueda ser reproducible. Desajustes entre el primer y el templado puede dar lugar a la ausencia total de los productos de PCR, as como constituir una disminucin en el producto. En este caso los resultados del RAPD pueden ser difciles de interpretar. y y y y Desarrollo de locus especifico, marcadores codominantes RAPDS. La banda del marcador polimrfico del RAPD est aislado del gel. Esta es amplificado en la reaccin del PCR. El primer nuevo largo especifico es diseado para la secuencia de ADN, el cual es llamado Sequenced Characterized Amplified Region Marker (SCAR) (8).

Tcnica RAPD La tecnologa del RAPD estndar utiliza oligonucleoticos cotro sintenticos ( de 10 pb) de secuencias al azar como primer a amplificar cantidades totales en nanogramos bajo ADN genmico a bajas temperaturas reconocido por el PCR. Los productos de amplificacin son generalmente separados en geles de agarosa y teidos con bromuro de etidio. Primers decameros estn disponibles comercialmente en varias compaas (Operon technologies, Alameda, California). Welsh y McClelland independientemente desarrollaron una tecnologa independiente usando primers de 15 nucletidos y condiciones de electroforesis de RAPD llamada de forma arbitraria reaccin en cadena de la polimerasa cebada 8AP-PCR). Amplificacin por PCR con cebadores ms cortos de 10 nucletidos tambin se ha utilizado en la produccin de perfiles de DNA fingerprinting. Aunque estos enfoques son diferentes con respecto a la longitud de los cebadores al azar, las condiciones amplificacin y mtodos de visualizacin difieren de las condiciones del PCR estndar en que un solo nucletido de secuencia aleatoria se emplea y sin conocimiento previo del genoma objeto de anlisis necesario (7). Reproducibilidad de los marcadores RAPD Aunque el mtodo RAPD es relativamente rpido, barato y fcil de realizar en comparacin con otros mtodos que han sido utilizados como marcadores de ADN, la cuestin de la reproducibilidad se ha de una gran preocupacin desde la publicacin de la tcnica. De hecho, la PCR normal tambin es sensible a cambios en las condiciones de reaccin, pero la reaccin RAPD es mucho ms sensible que la convencional PCR debido a la longitud de una cartilla individual y arbitrario utilizado para amplificar regiones desconocidas de un genoma determinado. Este problema de la reproducibilidad es normalmente el caso de las bandas de menor intensidad. La razn de bandas con una intensidad alta o ms baja an no se sabe. Tal vez algunos cebadores no concuerdan perfectamente con la secuencia de cebado, la amplificacin en algunos ciclos no pueden reproducirse , y por lo tanto las bandas siguen siendo dbiles. El factor ms importante para la reproducibilidad del perfil de RAPD ha sido encontrado siendo el resultado de la inadecuada preparacin de templados de DNA. Las diferencias entre la concentracin de DNA y de dos individuales DNAs resultado de las muestras en el prdida o ganancia de algunas bandas . Dado que la amplificacin de RAPD se dirige con un oligonucletido solo, el DNA de casi de todas las fuentes es susceptible de amplificacin. Por lo tanto, el ADN del genoma en cuestin puede incluir DNA contaminantes del material con el que el DNA se ha aislado. Se requiere cuidado especial para mantener el ADN que se amplifique otros contaminantes de DNA (7).

Las ventajas del mtodo son su simplicidad y bajo costo, aunque tiene el inconveniente de ser un marcador de tipo dominante, es decir, no es posible discernir sobre la heterocigocidad de los loci observados. Adems, la reaccin es muy sensible a las condiciones de amplificacin y a la calidad y concentracin del ADN, las cuales influiran en la reproducibilidad del mtodo (10).

BIBLIOGRAFIA 1. Allison, L . (2007) Fundamental molecular biology. Blackwell Publishing Ltd. 2. Seminario taller biotecnologa ciencias agrcolas avances y aplicaciones. (1989) Universidad del Valle CATIE-AID-REDCA, Guatemala. 3. Science Education Partnership. PAPER RFLP TEACHER GUIDE (2002) Fred Hutchinson Cancer Research Center. 4. http://web.udl.es/usuaris/e4650869/docencia/segoncicle/genclin98/temes_teoria/diagos tic_mol/diagno3.html 5. Ayra L., Cabrera I., Gmez M., Hernndez D., Empleo de marcadores bioqumicos y de ADN en la caracterizacin Molecular de hongos entomopatogenos. Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical (IIFT), Habana Cuba. 6. http://www.exploredna.co.uk/rflp-analysis.html 7. Bardaki F. (2000) Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Markers. Cumhuriyet University, Faculty of Arts and Science, Department of Biology. Sivas-TURKEY 8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRAPD.shtml 9. Narvaz R. C., Valenzuela B. J., Muoz Sch. C., Hinrichsen R. P. (2000) Comparison of RAPD and AFLP as methods for genetic identification on Vitis based on the analysis of anonymous genomic sequences. Agricultura Tcnica (Chile)

LINKS DE CONSULTA

DISEO DE PCR Y PCR-RFLP http://insilico.ehu.es/edu/PCR_es/login.php http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/RFLP.html

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