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Introduccin

A las Fermentaciones Alimentarias

TEMA

1.

INTRODUCCIN

LAS

FERMENTACIONES

ALIMENTARIAS. 1.1. Antecedentes histricos 1.2. Usos de la fermentacin en la industria alimentaria (TEMAS 8, 9 y 10) 1.3. Origen de los microorganismos industriales (TEMA 2) 1.4. Requisitos de las cepas industriales (TEMAS 4, 5) 1.5. Objetivos de la mejora gentica de cepas industriales (TEMAS 4, 5) 1.6. Objetivos del diseo de fermentadores (TEMAS 6, 7) 1.7. Objetivos del diseo y eleccin del sustrato de la fermentacin (TEMA 3, 4)

TEMA 1. Introduccin a las fermentaciones alimentarias

BREVE HISTORIA DE LAS FERMENTACIONES ALIMENTARIAS 10.000 a.C. 4000 a.C. Pan 1000 a.C. Bebidas alcohlicas destiladas 1680 A. van Leeuwenhoek. Nacimiento de la tecnologa microbiana. Primera observacin de levaduras de cerveza 1781 1836 1847 1856 1881 Produccin de levadura de panadera prensada Caracterizacin de las levaduras como materia viva Fermentaciones llevadas a cabo por hongos L. Pasteur. Confirmacin del papel fermentador de las levaduras en vino y la cerveza R. Koch. Desarrollo de tcnicas para la obtencin de cultivos puros. Produccin de cido lctico por fermentacin 1894 Produccin de enzimas amilolticos por fermentacin en fase slida 1879-1919 Produccin industrial de levaduras de panaderas 1916 1923 1930 1935 1970 1973 Produccin de protena unicelular a partir de melazas (levadura panadera) Produccin de citrato por fermentacin Produccin de glutamato por fermentacin Produccin de vitamina B12 por fermentacin Produccin de glucosa isomerasa microbiana Produccin de -amilasas bacterianas estables Desarrollo de las tcnicas de clonacin y nacimiento de la Ingeniera Gentica Vino y probablemente vinagre 5.000 a.C. Cerveza, queso y otros productos lcteos fermentados

TEMA 1. Introduccin a las fermentaciones alimentarias

USOS 1.

DE

LA

FERMENTACIN

EN

LA

INDUSTRIA

ALIMENTARIA Alimentos fermentados - Proceso espontneo - Efecto conservante Produccin de cidos orgnicos Descenso del pH Produccin de sustancias txicas - Aumento del valor nutritivo de los alimentos - Incremento de la digestibilidad mediante la reduccin de los niveles de sustancias txicas y de antinutrientes - Modificacin de las caractersticas organolpticas del alimento fermentado (aroma, sabor, textura) 2. Aditivos y enzimas de uso alimentario - Enzimas Fuente de enzimas menos dependiente de las variaciones en la materia prima que los animales y vegetales Posibilidad de incrementar la produccin mediante la modificacin de las condiciones de fermentacin y la mejora gentica de las cepas de produccin - Aditivos de bajo peso molecular Puede ser ms rentable que la sntesis qumica o la purificacin a partir de fuentes naturales Ms selectiva que la sntesis qumica

TEMA 1. Introduccin a las fermentaciones alimentarias

ORIGEN DE LOS MICROORGANISMOS INDUSTRIALES 1. Alimentos fermentados - Seleccin involuntaria segn las caractersticas del proceso - Seleccin in vitro de aquellas cepas que presentaran unas caractersticas ms interesantes 2. Produccin de aditivos y enzimas de uso alimentario - Seleccin a partir de cualquier fuente natural - Colecciones de cultivo pblicas y privadas

TEMA 1. Introduccin a las fermentaciones alimentarias

REQUISITOS DE LAS CEPAS INDUSTRIALES 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Posibilidad de obtener cultivos puros Genticamente estables Fcil de mantener por largos perodos de tiempo Tasa rpida de produccin de formas de propagacin Tasa rpida de crecimiento en preinculo y en fermentador Ausencia de problemas tecnolgicos durante el escalado Nutricionalmente poco exigentes Autoproteccin (bajada de pH, temperatura ptima extrema, produccin de agentes antagonistas, etc). Produccin rpida de los metabolitos de inters 10. Fcil separacin entre el producto y el microorganismo 11. Produccin mayoritaria del metabolito de inters 12. Falta de produccin de sustancias txicas 13. Susceptible de mejora gentica

TEMA 1. Introduccin a las fermentaciones alimentarias

OBJETIVOS DE LA MEJORA GENTICA DE CEPAS INDUSTRIALES 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Aumento en la tasa de crecimiento (produccin de biomasa) Aumento de la eficacia de utilizacin de sustratos baratos o disminuir requerimientos nutricionales Aceleracin de la formacin de producto Aumento del rendimiento del metabolito de inters Reduccin de la formacin de espumas Reduccin de la produccin de sustancias que interfieran con la purificacin del metabolito de inters Evitar la produccin de antibiticos (en alimentos o aditivos y enzimas alimentarios) Produccin de nuevas sustancias (ingeniera gentica combinatoria

TEMA 1. Introduccin a las fermentaciones alimentarias

OBJETIVOS DEL DISEO DE FERMENTADORES 1. 2. 3. 4. 5. 6. Control de la entrada y salida de microorganismos, nutrientes y productos de la fermentacin Control de los intercambios de gases y energa Proporcionar un ambiente ptimo para el crecimiento del microorganismo o para el desarrollo del proceso fermentativo Optimizacin del rendimiento del producto respecto al coste energtico y de los sustratos de fermentacin Facilitar la recuperacin de los productos de la fermentacin (ya sea en forma de biomasa o en el medio de cultivo) Los fermentadores industriales estn generalmente diseados para procesos concretos

TEMA 1. Introduccin a las fermentaciones alimentarias

OBJETIVOS DEL DISEO Y ELECCIN DEL SUSTRATO DE LA FERMENTACIN 1. Alimentos fermentados - Sustrato tradicional - Sustrato tradicional con correcciones (adicin o purificacin) para: Favorecer o garantizar el desarrollo de los microorganismos deseables Mejorar o garantizar la calidad del producto, o crear nuevos productos alimenticios 2. Aditivos y enzimas - Proporcionar todos los elementos y la energa necesarios para el crecimiento del microorganismo y la formacin del producto - Evitar la presencia de sustancias inhibidoras del crecimiento o de la sntesis del producto (incluidos algunos nutrientes) - Extender en el tiempo la fase productiva de crecimiento (p.ej., cultivo continuo) - Favorecer la recuperacin del producto al final del proceso - Evitar la formacin de espuma - Reducir costes mediante el uso de subproductos (bagazo, suero de quesera,...) * El medio debe estar adaptado a cada fase del proceso (mantenimiento de la cepa, preinculo, escalado, produccin,...)

TEMA 2. PRINCIPALES MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN LAS FERMENTACIONES ALIMENTARIAS 2.1. Introduccin 2.2. Levaduras 2.2.1. Caractersticas generales 2.2.2. Reproduccin de levaduras 2.2.3. Ciclo fermentativo (S. cerevisiae) 2.2.4. Levaduras de inters industrial 2.2.5. Produccin de alimentos fermentados 2.2.6. Ventajas de S. cerevisiae en las fermentaciones alimentarias 2.3. Bacterias lcticas 2.3.1 Caractersticas generales 2.3.2. Principales familias 2.3.3. Ciclos fermentativos a)Va homofermentativa b)Va heterofermentativa c) Va de Bifidobacterium 2.3.4. Produccin de alimentos fermentados 2.3.5. Bacterias lcticas para la produccin de aditivos 2.3.6. Ventajas de las bacterias lcticas en fermentaciones alimentarias 2.3.7. Desventajas de las bacterias lcticas en fermentaciones alimentarias 2.3.8. Caracteres genticos codificados en plsmidos de L. lactis 2.3.9. Bacterias lcticas como alterantes de alimentos 2.3.10. Carcter probitico de cepas de bacterias lcticas

2.4. Bacterias acticas 2.4.1. Caractersticas generales 2.4.2. Principales gneros 2.4.3. Familias 2.4.4. Ciclo fermentativo 2.5. Bacterias propinicas 2.5.1 Caractersticas generales 2.5.2. Ciclo fermentativo 2.6. Bacterias del cido glutmico 2.6.1 Caractersticas generales 2.6.2. Ciclo fermentativo 2.7. Mohos 2.7.1. Caractersticas generales 2.7.2. Caractersticas morfolgicas 2.7.3. Reproduccin 2.7.4. Principales gneros 2.7.5. Mohos de uso industrial 2.7.6. Mohos utilizados en la produccin de cidos orgnicos 2.7.7. Mohos utilizados en la produccin de enzimas

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FERMENTACIN

Mecanismo por el cual los microorganismos sintetizan ATP (energa) como resultado de reacciones de xido-reduccin que implican compuestos orgnicos

Reacciones internamente balanceadas Oxidacin parcial de los tomos de C generacin parcial de E Oxidacin Liberacin de E (catabolismo) Reduccin Consumo de E (anabolismo)

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1.Energa ATP fosforilacin a nivel de sustrato 2.Eq. O-R (eliminacin de e- productos de fermentacin)

Produccin de compuestos de alta energa Compuestos orgnicos con grupos fosfato o CoA (hidrlisis exotrmica)

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

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LEVADURAS CARACTERSTICAS GENERALES DE LEVADURAS Hongos unicelulares Grupo de microorganismos hetereogneo (comprende 60 gneros y unas 500 especies) Saccharomyces cerevisiae Hongo ascomiceto unicelular Reproduccin asexual por gemacin Reproduccin sexual por ascosporas Producto principal de la fermentacin etanol y CO2 Microorganismo eucariota modelo (ciclo celular, bioqumica, gentica, etc.) REPRODUCCIN DE LEVADURAS REPRODUCCIN ASEXUALGEMACIN Gemacin Formacin de una yema desde la madre No se forman yemas sobre el mismo lugar N de yemas por clula limitado (hasta 45) Gemacin de levaduras haploides (ms comn) o diploides

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REPRODUCCIN SEXUAL Formacin de ascosporas Factores que pueden influir en la esporulacin - Heterotalismo

- Composicin del medio

- Reduccin en la concentracin de oxgeno

- Temperatura

Presentan dos tipos conjugativos distintos (sistema bipolar) S. cerevisiae ( y a), Saccharomycopsis elipytica (A y B), Schizocaccharomyces pombe (+ y ) Slo se conjugan tipos distintos (Heterognesis) Tipos conjugativos oligopptidos de la membrana celular distintos

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REPRODUCCIN SEXUAL Cultivo axnico formacin de diploides??? Cambio en el tipo conjugativo de la clula

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CICLO FERMENTATIVO

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

PRODUCCIN DE ALIMENTOS FERMENTADOS Levaduras de panadera y productos de panificacin Levaduras de cervecera y cervezas Levaduras de vinificacin y vinos Levaduras de destilacin y licores Levaduras para alimentacin animal y humana Productos derivados de las levaduras (autolisados, etc) Produccin de etanol industrial y carburante VENTAJAS DE S. CEREVISIAE EN LAS FERMENTACIONES

ALIMENTARIAS Crecimiento rpido sobre sustratos ricos en azcar (malta, mosto, harina) El etanol y el CO2 inhiben el crecimiento de microorganismos competidores Factor Killer para competir con otras levaduras Poco exigentes respecto a los nutrientes Tolerancia al SO2 utilizado en vinificacin

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BACTERIAS LCTICAS CARACTERSTICAS GENERALES Bacterias Gram positivas Forma de cocos (Streptococos) o bacilos (Lactobacilos) Anaerobios facultativos (excepto en el intestino de animales) Produccin de cido lctico a partir de glucosa (como nico o principal producto) Homofermentativas, heterofermentativas y bifidobacterium Catalasas negativas (excepto en medios ricos en hemo o manganeso) Manganeso proteccin frente a oxgeno comparable a la accin de superxido-dismutasas (2 Mn2+ + 2 O2- 2 MnO2+) Complejas necesidades de factores de crecimiento Aparicin en leche Tolerantes a pH cidos (pH = 5) Produccin de alimentos de textura filante o espesa (dextrosa) crecimiento en medios hipersacarosados (Leuconostoc mesenteroides) Las cepas industriales suelen presentar auxotrofas diversas (aminocidos, vitaminas y bases nitrogenadas) tiles como conservantes de alimentos Tambin pueden causar deterioro en alimentos

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CICLOS FERMENTATIVOS A) CICLO HOMOFERMENTATIVO Ruta de Embden-Meyerhof Un solo producto de fermentacin (cido lctico) A veces existe produccin de formato, etano o acetato por desviacin a Acetil CoA Produccin de dos molculas de ATP a partir de glucosa No existe produccin de CO2 B) CICLO HETEROFERMENTATIVO Varios productos de fermentacin (principalmente cido lctico, adems etanol, CO2, diacetilo, etc.) No fructosa-difosfato-aldolasa (sin ruptura de fructosa-bifosfato a triosa fosfato) Degradacin de glcidos por la va de las pentosas fosfatos o de las hexosas fosfato Oxidacin de glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconato Descarboxilacin para producir pentosa fosfato Fosfocetolasa (ruptura a triosa fosfato y acetil fosfato) Produccin de una molcula de ATP a partir de glucosa Produccin de CO2 (descarboxilacin del fosfoglucanato) Condiciones de anaerobiosis oxidacin por medio de una flavoprotena

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C) CICLO DE BIFIDOBACTERIUM Bacilos heterofermentativos Transformacin de fructosa-6-fosfato en eritrosa-4-fosfato y acetil-fosfato Reordenacin de eritrosa-4-fosfato a heptosa-fosfato y triosa-fosfato Posterior transformacin a acetil-fosfato y gliceraldehdo-3-fosfato Diferencia fundamental con la va heterofermentativa no producen CO2
hexoquinasa Glucosa-6-fosfato glucosa-6-fosfato isomerasa Fructosa-6-fosfato transaldolasa Pseudoheptulosa-7fosfato transcetolasa Ribosa-5-fosfato ribosa-5-fosfato isomerasa Ribulosa-5-fosfato ribosa-5-fosfato epimerasa Xilulosa-5-fosfato 2 Acetil-fosfato 2 ADP Acetato quinasa 2 ATP 2 Acetato 2 Gliceraldehido-3-fosfato 2 NAD 2 NADH+ 2 Pi

2 Glucosa 2 ATP
2 ADP Glucosa-6-fosfato glucosa-6-fosfato isomerasa ADP ATP

Fructosa Fructosa-6-fosfato fructosa-6-fosfato fosfocetolasa fructosaquinasa Eritrosa-4-fosfato ATP ADP Gliceraldehido-3-fosfato AcetilAcetato fosfato Acetato Xilulosa-5-fosfato quinasa 2 ATP 2 ADP xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa

2 cido 1,3-difosfoglicrico 2 ADP Ganancia neta = 3 ATP (2 acetato + 2 lactato) por cada 2 molculas de glucosa fermentada Otros productos (acetato, formiato, glicerol) se forman por rutas alternativas 2 ATP Fosfoenolpirvico 2 ADP 2 ATP Pirvico 2 NADH+ 2 NAD 2 Lactato

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PRINCIPALES FAMILIAS a)Streptococcaceae Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus Homofermentativos Produccin de cido lctico L(+) Clulas en pares o cadenas Streptococcus

Enterococcus

Lactococcus

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Leuconostoc Heterofermentativos cido lctico D(-), etanol y CO2 Clulas en pares o cadenas Parecidos morfolgicamente a Streptococcus

Oenococcus Pediococcus

Homofermentativos Produccin de cido lctico L(+) Clulas en pares o tetradas b)Lactobacillaceae Produccin de cido lctico L(+) Forma bacilar Generalmente inmviles La mayora son aerotolerantes Grandes exigencias nutritivas Ms de 70 especies reconocidas

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Lactobacillus Thermobacterium Homofermentativos L. casei, L. alimentaricus, L. bavaricus, L. carnis, L. Plantarum

Lactobacillus casei Streptobacterium Heterofermentativos facultativos L. delbrueckii, L. acidophillus, L. bulgaricus, L. gasseri, L. helveticus, L. Jensenii

Lactobacillus bulgaricus

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Betabacterium Heterofermentativos obligatorios L. kefir, L. brevis, L. buchneri, L. cellobiosus, L. Fermentum

Lactobacillus brevis Bifidobacterium (Lb. bifidus) Hbitat ms comn intestino de lactantes Distinto ciclo fermentativo Cepas probiticas alimentos funcionales y nutracuticos

Bifidobacteria bifidum

Bifidobacteria longum

Bifidobacteria adolescentis

Bifidobacterium breve

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PRODUCCIN DE ALIMENTOS FERMENTADOS (SOLAS O EN COMBINACIN CON LEVADURAS U HONGOS) Queso Yogur, kfir y otros productos lcteos fermentados (incluyendo probiticos) Embutidos Encurtidos (pepinillos, aceitunas) Sauerkraut Pescado fermentado Algunos tipos de pan Papillas de mandioca o tapioca Papillas de cererales Vino (fermentacin malolctica) Bebidas alcohlicas a partir de frutos tropicales o cereales BACTERIAS LCTICAS PARA LA PRODUCCIN DE ADITIVOS Produccin de cido lctico Produccin de diacetilo Produccin de bacteriocinas (nisina) conservante en industria alimentaria Produccin de polisacridos extracelulares (dextranos) VENTAJAS DE LAS BACTERIAS LCTICAS EN FERMENTACIONES ALIMENTARIAS Crecimiento rpido en los sustratos alimentarios Anaerobiosis facultativa Rpido descenso de pH Resistencia a pH cido Produccin de sustancias antimicrobianas (bacteriocinas) Actividad proteltica limitada

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DESVENTAJAS DE LAS BACTERIAS LCTICAS EN FERMENTACIONES ALIMENTARIAS Sensibilidad a fagos de algunas cepas industriales Inestabilidad gentica de algunos caracteres tecnolgicos relevantes Requerimientos nutricionales complejos (vitaminas y aminocidos) BACTERIAS LCTICAS COMO ALTERANTES DE ALIMENTOS Produccin de aminas biognicas Fermentacin malolctica indeseada Picado lctico de los vinos Alteraciones en la cerveza Industria azucarera Productos lcteos CARCTER PROBITICO DE CEPAS DE BACTERIAS LCTICAS DEFINICIN Microorganismos vivos que cuando son ingeridos en cantidades suficientes tienen efectos beneficiosos sobre la salud, lo que va ms all de los efectos nutricionales convencionales Principales vehculos para la adicin de cepas probiticas leches fermentadas Cepas usuales de los gneros Lactobacillum y Bifidobacterium CEPAS PROBITICAS Bacterias del gnero Lactobacillus Lb. acidophilus Lb. acidophilus LC1 Lb. acidophilus NCFB 1748 Lb. plantarum

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Lb. casei Lb. casei inmunitas

Lb. casei Shirota

Lb. rhamnosus (cepa GG) Kaiku actif Lb. helveticus

Lb. delbruekii subesp. Bulgaricus Lb. Fermentum

Bacterias del gnero Bifidobacterium B. bifidum Bifidus essensis Bifidus lactis

B. longum Otras bacterias

B. infantis

B. brevis

B. adolescentis

Streptococcus salvarius subesp. thermophilus Lactococcus lactis subesp. thermophilus Lactococcus lactis subesp. cremoris Enterococcus faecium Leuconostoc mesenteroides subesp. dextranicum Propionibacterium freudenreichii Pediococcus acidilactici

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CRITERIOS APLICADOS A LAS CEPAS PROBITICAS Microorganismos de origen humano Resistentes a las condiciones cidas del estmago, bilis y enzimas digestivas Preferiblemente aislado de otras especies microbianas Capaces de colonizar el intestino humano Efecto beneficioso para la salud del consumidor Clulas viables en nmero suficiente Seguras para el consumo humano (GRAS) Buenas propiedades sensoriales Eficacia cientficamente probada EFECTOS BENEFICIOSOS Prevencin de la intolerancia a la lactosa Resistencia a patgenos entricos Proteccin frente al cncer de colon Estimulacin de la respuesta inmune Prevencin de alergias Efecto antihipertensivo Reduccin de los niveles de colesterol (proteccin cardiovascular) Prevencin de infecciones del tracto urogenital Prevencin de lceras debidas a Hellicobacter pylori

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BACTERIAS ACTICAS
CARACTERSTICAS GENERALES Mviles (flagelacin pertrica o polar) Oxidacin completa o incompleta de alcoholes (p.ej. etanol) Produccin de cidos orgnicos (cido actico) Oxidacin a pH cido (pH < 5) Reconocimiento en placas de agar-CaCO3 que contengan etanol

Acetobacter aceti

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PRINCIPALES GNEROS Familia Acetobacteriaceae Gnero Acetobacter Flagelacin pertrica Oxida hasta CO2 el cido actico (relacionado con la presencia de un ciclo completo del cido ctrico) Bacterias superoxidantes Gnero Gluconobacter (antes Acetomonas) Flagelacin polar Bacterias suboxidantes CICLO FERMENTATIVO Oxidacin de alcoholes primarios (etanol, butanol), secundarios (1,2propanodiol, 2,5-hexanodiol), polioles (glicerol, manitol, sorbitol), monosacridos (glucosa, fructosa, arabinosa, xilosa) y cidos orgnicos (cido lctico, cido glioxlico, cido glucnico) completa e incompleta

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BACTERIAS PROPINICAS
CARACTERSTICAS GENERALES Gnero Propionibacterium Medio neutro Aisladas, pares, pequeas cadenas o grumos Morfolgicamente parecidas a Corynebacterium con pequeas protuberancias, a veces curvadas Elaboracin del queso Emmental Cepas salvajes procedentes del estmago de rumiantes

Propionibacterium

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CICLO FERMENTATIVO Queso produccin a partir de lactosa o cido lctico Produccin de cido propinico, succnico, actico y diacetilo Expulsin de CO2 formacin de ojos en el queso

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BACTERIAS DEL CIDO GLUTMICO


CARACTERSTICAS GENERALES Principal aplicacin industrial produccin de aminocidos (especialmente cido glutmico) Cepas silvestres bajos rendimientos Mejora de cepa mediante mutagnesis clsica e ingeniera gentica Utilizacin de mutantes auxtrofos (auxtrofas para la biotina, a veces tambin tiamina) Formacin de cido glutmico Corynebacterium glutamicum Utilizacin de melazas o almidn hidrolizado junto con sales amnicas Adicin de 0.5 g/g de biotina al medio fermentativo

Corynebacterium glutamicum

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CICLO FERMENTATIVO

Ruta de Embden-Meyerhof a partir de una hexosa Ciclo de los cidos tricarboxlicos formacin de isocitrato Descarboxilacin oxidativa de isocitrato a -cetoglutarato Conversin a glutamato (junto con NH3)

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MOHOS
CARACTERSTICAS GENERALES Hongos multicelulares Aspecto aterciopelado o algodonoso Parte principal del hongo es blanca; a veces coloreada, oscurecida o como ahumada CARACTERSTICAS MORFOLGICAS Base para su identificacin y clasificacin Constituidos por hifas (sumergidas o no) y micelio Hifas vegetativas (de crecimiento) y frtiles (rganos reproductores) Hifas septadas (con tabiques transversales) o no septadas REPRODUCCIN A partir de un trozo de micelio (raro) Esporas asexuales Producidas en gran cantidad Pequeas, ligeras y resistentes a la desecacin Diseminacin area para la formacin de nuevos mohos Tres tipos principales: 1. Conidiosporas Conidiforos (hifas frtiles)

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Conidiforo del tipo del Aspergillus

del tipo del Penicillium

2. Artrosporas u oidios Artrosporas (por fragmentacin de hifa)

3.

Esporangiosporas Esporangiforos (hifas frtiles)

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Esporas sexuales No septados Zigomicetos Zigosporas Unin de porciones apicales de dos hifas del mismo o semejante micelio Membrana de proteccin frente a desecacin Reproduccin asexual esporangios

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Septados Ascomicetos Ascosporas Unin de dos clulas del mismo micelio o dos micelios separados Ascosporas recogidas en asca (generalmente 8) Ascas simples o agrupadas en una cubierta (ascocarpo) Membrana de proteccin frente a desecacin Reproduccin asexual Conidios

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PRINCIPALES GNEROS
Gnero Aspergillus Ascomiceto Esporas asexuales Conidios

Principales especies A. niger, A. flavus, A.oryzae

Gnero Penicillium
Ascomicetos Esporas asexuales Conidios Neutraliza el cido lctico Genera aromas caractersticos

Principales especies P. Roqueforti, P. Camemberti, P. Nalgiovense

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Gnero Geotrichum Incluido a veces en los hongos en forma de levadura Masa firme con aspecto de fieltro que posteriormente se torna blanda y cremosa Esporas asexuales (artrosporas)

Principales especies Geotrichum candidum

Gnero Rhizopus
Zigomicetos Esporas asexuales esporangiosporas Masa algodonosa de color marrn negruzco

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Gnero Mucor Zigomicetos Esporas asexuales esporangiosporas Masa algodonosa de color marrn-negro grisceo

MOHOS DE USO INDUSTRIAL A. niger


Caractersticas generales de Aspergillus niger Aerobio estricto Cabezuelas (esporas) grandes, muy apretadas y globulares Cabezuelas de color negro, castao negruzco o castao prpura Conidios rugosos con bandas pigmentadas Produccin de ctricos, cido glucnico y diveras enzimas Gran versatilidad nutritiva

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

Ciclo fermentativo para la produccin de cido ctrico Ciclo de los cidos tricarboxlicos No se libera CO2 durante la formacin de citrato Enzima clave piruvato carboxilasa (incrementada por concentraciones elevadas de azcar) Inhibicin de -cetoglutarato deshidrogenasa acumulacin de citrato Necesario oxgeno disuelto pH < 2.0 (a pH superiores acumula cido glucnico)

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

A. flavus y oryzae
Aerobio estricto Cabezuelas de color verde amarillento Uso en alimentos orientales fermentados Gran versatilidad nutritiva No tiene requerimientos nutricionales especiales

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

P. Roqueforti
Conidios verde-azulados Uso en queso Roquefort y otros quesos de pasta azul (Gorgonzola, Stilton, etc.) Tolera atmsferas pobres en oxgeno Resiste a un amplio rango de pHs (3,0-10,5) Estimulado en atmsferas ricas en alcohol Soporta elevadas concentraciones de sal Actividades proteolticas y lipolticas Liberacin de cidos grasos formacin de alcoholes secundarios voltiles (aroma) Distintos tipos de cepas Indeseable en otros tipos de queso (Cammembert, Emmental, etc.)

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

P. camemberti
Utilizado para la elaboracin de los quesos de pasta blanda y corteza florida (camembert, brie, etc.) Esporas preparadas en laboratorios especializados Tradicionalmente las cepas utilizadas en quesera provenan de formas salvajes Actualmente provienen de mutaciones espontneas o provocadas Cepas distintas en funcin del color, velocidad de crecimiento, densidad del tallo, rapidez e intensidad de esporulacin, facilidad de germinacin de las esporas, etc. Resiste a un amplio rango de pHs Soporta elevadas concentraciones de sal

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

Geotrichum candidum
Oidium lactis Hongo de las lecheras Color blanco o cremoso Quesos de corteza lavada (Pont-lEveque, Limburger) Neutraliza la pasta quesera Favorece el desarrollo de grmenes caseolticos Desarrollo excesivo altera el aroma y sabor final Control de crecimiento mediante sal y temperatura de maduracin

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

Starters utilizados en charcutera


Cubierta externa de los salchichones color blanco marfil Debaryomyces hansenii (levadura) o Penicillum nalgiovense (moho) Otros mohos (Penicillium verrucosum) contaminaciones indeseables

P. nalgiovense

P. verrucosum

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

Mohos utilizados en las preparaciones culinarias exticas (Extremo Oriente y frica)


Mejora de la digestibilidad de las materias primas (enzimas amilolticas, celulolticas, lipolticas y proteolticas) Formacin de caractersticas organolpticas interesantes Principales cepas utilizadas Rhizopus Rhizopus oryzae, Rhizopus microsporus Amylomyces rouxxi Actinomucor elegans Mucor circinelloides Aspergillus Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus Principales materias primas utilizadas Cereales arroz, trigo, cebada, maz, sorgo Leguminosas soja Otros cacahuete, mandioca, coco Mezcla de varias Productos elaborados Koji salsa de soja y/o arroz fermentado (Aspergillus oryzae y Aspergillus parasiticus) Miso bebida de soja que se utiliza en distintas preparaciones alimenticias (Actinomucor elegans) Chu Bolas de harina de arroz inoculadas con Amylomyces rouxii Tempeh Fermentacin tpica de Indonesia de la soja, mandioca o coco por Rhizopus oryzae o R. microsporus.

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

Mohos utilizados en la produccin de cidos orgnicos

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

Mohos utilizados en la produccin de enzimas

TEMA 2. Principales organismos utilizados en las fermentaciones alimentarias

PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS ENZIMAS FNGICOS


-amilasa y amiloglucosidasa de Aspergillus niger Hidrlisis del almidn (mejora de la fermentacin del pan) sin los inconvenientes (subproductos) de una hidrlisis por va cida Enzimas aptas para la coagulacin de la leche Rhizomucor pusillus y Rhizomucor miehiei. Pectinasas de Aspergillus Clarificacin de zumos de frutas y de vinos; gelificacin de confituras; desagregacin de los muclagos de los granos de caf antes del secado Lactasa de Aspergillus niger y A. foetidus Hidrlisis de lactosa en las leches condensadas (reduccin de su cristalizacin) Proteasas de Aspergillus oryzae Acelera la maduracin de algunos quesos (Cheddar y Gouda) y mejora su aroma y sabor Glucosa oxidasa de Aspergillus niger Antioxidante y prevencin de las reacciones de Maillard en las industrias de huevos en polvo y las fbricas de mayonesa industrial Celulasas de Aspergillus o de Trichoderma Mejora la digestibilidad de las frutas y legumbres deshidratadas

TEMA

3.

CLASIFICACIN

DE

LOS

PROCESOS

FERMENTATIVOS
3.1. Principales factores fsico-qumicos que afectan al crecimiento de microorganismos 3.1.1. Temperatura 3.1.2. pH 3.1.3. Actividad de agua 3.1.4. Concentracin de oxgeno 3.2. Mtodos de medida del crecimiento microbiano 3.3. Cultivos discontinuos 3.3.1. Crecimiento microbiano 3.3.2. Cinticas de crecimiento 3.3.3. Ecuaciones de equilibrio 3.4. Cultivos continuos 3.4.1. Ecuaciones de equilibrio 3.4.2. Quimiostato, turbidostato 3.4.3. Aplicaciones de los cultivos continuos 3.5. Cultivos fed-batch

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

PRINCIPALES FACTORES FSICO-QUMICOS QUE AFECTAN AL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS TEMPERATURA

Relacin temperatura-velocidad de crecimiento (ecuacin de Arrhenius) = Ae Ea/RT donde = velocidad de crecimiento A = constante de Arrhenius Ea = energa de Activacin R = constante de los gases T = Temperatura absoluta Temperaturas cardinales mnima, mxima y ptima

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

Clasificacin Psicrfilos (T ptima 15C) Psicrotolerantes (T ptima 20-40C) Mesfilos (mayoritarios) (T ptima 20-40C) Termfilos (T ptima >45C) Hipertermfilos (T ptima >80C)

T de crecimiento

T de produccin

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

pH Influencias sobre el crecimiento microbiano y actividad enzimtica Ms habituales pH 6 Inusuales a pH < 2 y > 10 Clasificacin: acidfilos, neutrfilos y alcalfilos

pH intracelular cercano a la neutralidad (efecto sobre componentes celulares) Homeostasis Variacin del pH a lo largo del proceso de fermentacin Uso de tampones y control automtico del pH

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

Actividad de agua (aw) Disponibilidad de agua y concentracin de solutos disueltos en ella aW = PS/PW donde PS = presin de vapor del agua en una solucin PW = presin de vapor del agua pura 0 <aW < 1

Microorganismos halfilos , halotolerantes y halfilos extremos Organismos osmfilos y xerfilos

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

En ambientes con baja aW concentracin interna de solutos (equilibrio osmtico) bombeo de iones hacia el interior celular o sntesis de un soluto orgnico (solutos compatibles)

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

Concentracin de oxgeno Clasificacin Aerobios procesos de respiracin Microaerfilos Anaerobios facultativos o aerotolerantes Anaerobios estrictos u obligados condiciones anxicas Productos txicos de oxgeno perxido de hidrgeno (H2O2) superxido (O2-) radicales hidroxilo (OH) Sistemas enzimticos para la eliminacin de productos txicos Catalasa destruccin de perxido de hidrgeno Peroxidasa destruccin de perxido de hidrgeno Superxido dismutasa (SOD) destruccin de aniones superxido Otros Bacterias lcticas Utilizacin de complejos de protenas y manganeso libre para la eliminacin de aniones superxido

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

MTODOS DE MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO


Recuento directo de clulas Recuento de viables contaje en placa o contaje de colonias Recuento directo de viables por tincin selectiva Peso seco (o masa celular) Turbidez densidad ptica (DO) Impedancia

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

CULTIVO DISCONTINUO O BATCH


Sistema cerrado

CRECIMIENTO CELULAR

Tiempo de generacin-velocidad de crecimiento


Crecimiento celular incremento en el nmero de clulas en una poblacin Velocidad de crecimiento cambio en el nmero de clulas o masa celular por unidad de tiempo Tiempo de generacin tiempo requerido para que a partir de una clula se formen dos clulas (duplicacin de una poblacin de clulas) tiempo de duplicacin

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

CINTICA DE CRECIMIENTO
FASE EXPONENCIAL

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

RELACIN EXISTENTE ENTRE BIOMASA Y SUSTRATO

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

CINTICA DE FORMACIN DE PRODUCTOS

1) Productos unidos al crecimiento microbiano 2) Productos independientes del crecimiento microbiano

1) Metabolitos primarios Producidos por clulas en crecimiento

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

2) Metabolitos secundarios Producidos por clulas en fase de deceleracin o fase estacionaria qp puede permanecer constante durante el crecimiento o puede variar de una forma ms compleja que en el caso anterior

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

ECUACIONES CINTICAS ECUACIN DE MONOD Relacin entre la velocidad de crecimiento () y sustrato residual (s)

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

CRECIMIENTO CON DOS SUSTRATOS LIMITANTES

INHIBICIN POR SUSTRATO

INHIBICIN EN GENERAL DEL CRECIMIENTO

I = sustancia limitante

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

CULTIVO CONTINUO Elongacin de la fase exponencial por adicin de medio fresco El crecimiento solo se encuentra limitado por el nivel de sustrato Un fermentador bien mezclado con flujos constantes de entrada de medio fresco y salida de lquido del reactor a volumen constante alcanza un estado de equilibrio

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

ECUACIONES DE EQUILIBRIO
VOLUMEN = CONSTANTE

CONCENTRACIN DE BIOMASA

CONCENTRACIN DE SUSTRATO

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

CARACTERSTICAS CINTICAS Y Ks y mx dan lugar a distintas curvas

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

QUIMIOSTATO Permite el control de la densidad de poblacin (produccin celular) mediante la variacin en la concentracin del nutriente limitante Permite el control sobre la velocidad de dilucin mediante la concentracin de sustrato limitante Uso de quimiostatos en cadena

TURBIDOSTATO La concentracin de clulas en el cultivo se mantiene constante controlando el flujo del medio Turbidez se mantiene constante Monitorizacin de la biomasa con una clula fotoelctrica APLICACIONES DEL CULTIVO CONTINUO Produccin de vinagre y etanol Produccin de biomasa de levadura Optimizacin del medio de cultivo (identificacin de sustratos esenciales para cepa de trabajo)

TEMA 3. Clasificacin de los procesos fermentativos

CULTIVOS FED-BATCH Cultivo discontinuo al que se aaden nutrientes, aditivos o medio fresco para: Poder utilizar sustratos que inhibiran la produccin a concentraciones elevadas Mejorar el rendimiento en biomasa Produccin de metabolitos tpicos de fase estacionaria (se prolonga la fase estacionaria y as controlas a los microorganismos y sus productos) Reducir la viscosidad del medio de fermentacin (en la produccin de polisacridos extracelulares) Elegir el momento adecuado para inducir la produccin (cambiar el tipo de sustrato que se mete y elegir cundo) Evitar problemas de contaminacin o estabilidad gentica que se dan en cultivo continuo

TEMA 4. SUSTRATOS Y MEDIOS DE CULTIVOS UTILIZADOS EN LAS FERMENTACIONES ALIMENTARIAS. 4.1. Introduccin 4.2. Composicin de un medio de cultivo 4.3. Sustratos utilizados como fuente de carbono 4.4. Sustratos utilizados como fuente de nitrgeno 4.5. Tipos de medios de cultivo 4.6. Control del proceso (pH, espuma, oxgeno, temperatura, reguladores de la formacin de producto) 4.7. Esterilizacin de cultivos

TEMA 4. Sustratos y medios de cultivo utilizados en las fermentaciones alimentarias

INTRODUCCIN elementos para la sntesis celular y produccin de metabolitos Requisitos rentables

Diferentes medios a escala de laboratorio e industrial COMPOSICIN DE UN MEDIO DE CULTIVO Debe proporcionar la energa y los elementos necesarios para la construccin y la supervivencia de las clulas Fuente de energa (suele coincidir con la de carbono) Macronutrientes (fuente de C, N, P, K y Mg) Micronutrientes (Fe, Mn, Zn, Mo, Cu, V, Co, B, Ni, Cr) Factores de crecimiento especficos de la cepa Componentes opcionales Sales con efecto tampn Agentes antioxidantes Agentes quelantes La mezcla debe tener una composicin equilibrada La forma qumica de los diferentes nutrientes debe ser asimilable Propiedad selectiva para proteger la fermentacin de contaminaciones

TEMA 4. Sustratos y medios de cultivo utilizados en las fermentaciones alimentarias

Objetivos de un medio de cultivo Mxima produccin Constantemente adaptada al proceso de fermentacin Recuperacin del producto Eliminacin de la represin catablica Materiales de fcil disposicin en cantidad suficiente Bajos costes Impedir que las impurezas dificulten la recuperacin del producto Implicaciones en el procesado posterior Subproductos proceso de recuperacin ms caro y complejo agentes antiespumantes problemas en el procesado de productos asociados con el crecimiento microbiano Impacto econmico sobre la productividad, purificacin del productos y tratamiento de desechos

TEMA 4. Sustratos y medios de cultivo utilizados en las fermentaciones alimentarias

SUSTRATOS UTILIZADOS COMO FUENTE DE CARBONO


Melazas (50% de azcar) Lactosuero (5-8% de lactosa) (poco usado por microorganismos) Extracto de malta (90% de azcar) Almidn y dextrinas Lquidos sulfticos (2-3% de azcar) (residuos de papeleras) Celulosa Aceites vegetales Metanol Etanol Compuestos petroqumicos

SUSTRATOS UTILIZADOS COMO FUENTE DE NITRGENO


Sales de amonio, urea, amonaco Lquido de maceracin de maz (4% de aminocidos) Extracto de levadura Peptonas Harina de soja una vez extrado el aceite (50% de protena)

TEMA 4. Sustratos y medios de cultivo utilizados en las fermentaciones alimentarias

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO (EN FUNCIN DE SUS COMPONENTES)


Definido Semisinttico Complejo

TEMA 4. Sustratos y medios de cultivo utilizados en las fermentaciones alimentarias

CONTROL DEL PROCESO VARIABLES pH Necesario para el desarrollo celular y formacin de producto Control de forma indirecta mediante un balance equitativo entre las fuentes de carbohidrato y nitrgeno Uso de tampones pH 6,0 y 7,5 Uso de fosfato inorgnico, cidos orgnicos, carbonato clcico, hidroxisales Espuma Desnaturalizacin de protenas Puede ocupar totalmente la cabeza del fermentador prdida de materia Utilizacin de agentes tensioactivos Reducen la tensin superficial de las espumas Eficacia (f) de las condiciones de fermentacin (composicin del medio, cepas microbianas, etapa del crecimiento, configuracin de las vas de aireacin y del fermentador) Uso de soportes (aceites orgnicos y minerales) Mnima cantidad usada Deben ser termolbiles y baratos

TEMA 4. Sustratos y medios de cultivo utilizados en las fermentaciones alimentarias

Oxgeno Requerimientos en procesos aerobios Influencia sobre los procesos metablicos Velocidad de absorcin especfica de oxgeno concentracin de oxgeno disuelto Antioxidantes como proteccin del producto Temperatura Temperatura ptima para la produccin celular o de metabolitos Uso de termostatos Regulacin de la formacin de producto Precursores Inhibidores Inductores

TEMA 4. Sustratos y medios de cultivo utilizados en las fermentaciones alimentarias

ESTERILIZACIN DE CULTIVOS OBJETIVOS Evitar el desarrollo de microorganismos patgenos Evitar el desarrollo de microorganismos alterantes Incrementar la reproducibilidad del proceso (rendimiento, pureza y tiempo de produccin) PUNTOS DE CONTROL DE LA ESTERILIDAD Mantener la pureza del inculo Esterilizar el medio de cultivo y los aditivos Esterilizar el material en contacto con el medio (recipiente del fermentador, vlvulas, conductos) Esterilizar los gases entrantes y salientes Mantener las condiciones aspticas durante la manipulacin Construccin apropiada del biorreactor para su esterilizacin y para la prevencin de la contaminacin durante la fermentacin PRINCIPALES MTODOS DE ESTERILIZACIN Calor hmedo (autoclave o chorro de vapor) Calor seco Radiacin (Rayos X, UV y rayos ) Esterilizacin qumica con lquidos o gases (desinfectantes) Filtracin Nuevos mtodos (altas presiones, campos elctricos)

TEMA 5. OBTENCIN Y MEJORA DE CEPAS PARA USO INDUSTRIAL 5.1. Introduccin 5.1.1. Origen de cepas industriales 5.1.2. Objetivos de la mejora de cepas 5.1.3. Mtodos de mejora gentica 5.2. Mutagnesis clsica 5.2.1. Tipos de mutaciones 5.2.2. Tipos de lesin primaria por agente mutagnico en el DNA 5.2.3. Fases de formacin de un mutante 5.2.4. Agentes mutagnicos 5.2.5. Mejoras realizadas por mutagnesis clsica 5.2.6. Identificacin de mutantes 5.3. Mutagnesis dirigida

TEMA 5. Obtencin y mejora de cepas para uso industrial

ORIGEN DE CEPAS INDUSTRIALES Procesos totalmente tradicionales Alimentos fermentados mediante la utilizacin de cepas seleccionadas Produccin biotecnolgica de aditivos o enzimas OBJETIVOS DE LA MEJORA DE CEPAS Motivo principal econmico (alto rendimiento de producto) Objetivo de un programa de mejora gentica de cepas (f) proceso que se quiera mejorar y tipo de sustancia que se quiera obtener produccin de biomasa la velocidad de crecimiento Mejorar caractersticas organolpticas del producto la produccin de aditivos y enzimas extenso programa de desarrollo de cepas Uso de cepas con propiedades fermentativas mejoradas los tiempos de fermentacin la produccin de metabolitos indeseables ( pureza del aditivo o enzima) formacin de sustancias txicas Necesidades reducidas de O2 la produccin de espumas el uso de sustratos baratos Facilitar la recuperacin de los productos

TEMA 5. Obtencin y mejora de cepas para uso industrial

MTODOS DE MEJORA GENTICA Aislamiento de mutantes espontneos Mutantes espontneos obtenidos mediante el cultivo con factor selectivo Mutagnesis inducida (no dirigida) y seleccin de mutantes Mutagnesis dirigida Sistemas naturales de recombinacin genticas (hibridacin y recombinacin) Cepas obtenidas mediante ingeniera gentica TIPOS DE MUTACIONES Mutaciones espontneas: 10-10 y 10-5 organismos por generacin y por gen, (f) de las condiciones de crecimiento del organismo Causas -Integracin y excisin de elementos -Errores durantes la replicacin del DNA Error no corregido por la DNA polimerasa Error provocado por la presencia de tautmeros infrecuentes

TEMA 5. Obtencin y mejora de cepas para uso industrial

Desaminaciones espontneas

Mutaciones inducidas Agente mutagnico 10-5-10-3 aislamiento de mejores productores de metabolitos secundarios 10-2-10-1 aislamiento de mutantes auxtrofos

TEMA 5. Obtencin y mejora de cepas para uso industrial

TIPOS DE LESIN PRIMARIA POR AGENTE MUTAGNICO EN EL DNA Dmeros de pirimidina

Modificacin qumica de las bases (alquilaciones y desaminaciones) transiciones Cambios de bases transversiones Entrecruzamientos entre las cadenas complementarias de DNA

TEMA 5. Obtencin y mejora de cepas para uso industrial

Intercalamiento de agentes mutagnicos en el DNA mutaciones por desplazamiento de lectura

Inserciones y deleciones de pocos nucletidos Rupturas del DNA por medios fsicos Rupturas en cadena sencilla Rupturas en cadena doble translocaciones, inversiones o mutaciones cromosomales similares

TEMA 5. Obtencin y mejora de cepas para uso industrial

FASES DE FORMACIN DE UN MUTANTE Lesiones premutacionales en el DNA Intervencin de los mecanismos celulares de reparacin Replicacin del DNA lesionado (puede estar acoplada a mecanismos de reparacin) Fijacin de la mutacin (conservacin de la mutacin) AGENTES MUTAGNICOS Radiacin UV de onda corta (200-300 nm) y onda larga (300-400nm) Radiaciones ionizantes (rayos X, y ) Agentes qumicos Mutgenos que afectan al DNA en ausencia de replicacin (HNO2, NH2OH, agentes alquilantes (EMS, DES, NTG)) Anlogos de bases: apareamiento incorrecto en replicacin (5-bromouracilo (BU), 2-aminopurina (AP)) Mutaciones por corrimiento de lectura ( acridina, proflavina, acriflavina)

TEMA 5. Obtencin y mejora de cepas para uso industrial

MEJORAS REALIZADAS POR MUTAGNESIS CLSICA Capacidad acidificante y proteoltica de diferentes cepas de bacterias lcticas Cepas termosensibles de Lactococcus con el fin de acelerar la maduracin de los quesos Produccin de aminocidos especficos en Corinebacterium Produccin de glucoamilasa por Aspergillus niger

TEMA 5. Obtencin y mejora de cepas para uso industrial

MUTAGNESIS DIRIGIDA

TEMA 5. Obtencin y mejora de cepas para uso industrial

IDENTIFICACIN DE MUTANTES A.Aislamiento de mutantes resistentes Siembra sobre un medio selectivo (con una sustancia txica que impida el crecimiento de la cepa silvestre) solamente pueden desarrollarse los clones resistentes Diferencias en el fenotipo del microorganismo Aislamiento de mutantes que son resistentes a antibiticos Mutantes con sensibilidad al fro o al calor

TEMA 5. Obtencin y mejora de cepas para uso industrial

B. Aislamiento de mutantes auxtrofos Siembra sobre un medio completo con agar crecimiento de todas las cepas Filtro de terciopelo o papel transferencia a otra placa con medio seleccionado Discriminacin de los mutantes auxtrofos Recuperacin de los mutantes en la placa maestra Tambin se pueden seleccionar haciendo uso de medios con penicilina