2.

METODO DE DIFUSION CON DISCO EN AGAR

Fernando García, PhD

2.1. Fundamento de la prueba.

Una suspensión de la bacteria en estudio se inocula sobre la superficie de una placa de agar Mueller-Hinton.
Posteriormente se colocan sobre la superficie del agar discos de papel de filtro impregnados con cantidades
estandarizadas de agentes antimicrobianos. Luego del período de incubación se mide el diámetro de la zona
de inhibición alrededor de los discos (ver Figura 2.1). El tamaño de la zona de inhibición es inversamente
proporcional a la concentración inhibitoria mínima (MIC) de la bacteria (ver Figura 2.2) y mediante el uso de
tablas de referencia (ver anexos 2.1., 2.2., 2.3. y 2.4) se prepara un reporte cualitativo (sensible, intermedio
o resistente).
A B

Figura 2.1. Principio de la técnica de difusión con disco en agar. La concentración del antibiótico decrece
conforma mayor sea la distancia desde el borde del disco (A). En el área en donde la concentración del
antibiótico sea insuficiente para inhibir el crecimiento, se observará un margen a partir del cual ocurrirá un
crecimiento confluente(B).
2. Método de difusión con disco en agar – Fernando García, PhD

Resistente Intermedio Sensible

) l m g/ µ C ( MI
Diámetro de la zona de inhibición (mm)
Figura 2.2. Ejemplo de un análisis de regresión para determinar la relación entre la CIM y los puntos de
quiebre en
la prueba de difusión con disco. En este caso, zonas de inhibición de ≥ 20 mm se interpretan como
susceptible con
una MIC de ≤ 8 µg/ml, mientras que zonas de inhibición de ≤ 11 mm se interpretan como resistente con una
MIC de
≥ 32 µg/ml. Zonas de inhibición de 12-19 mm se interpretan como intermedio con una MIC de 16 µg/ml.

2.2. Materiales.
¾ Cultivos frescos de 18-24 horas en medio sólido de la bacteria a probar.
¾ Placas de agar Mueller-Hinton con un espesor de 4 mm (24 ml de medio en placas de Petri de
90 mm de diámetro).
¾ Tubos conteniendo solución salina (0.85% NaCl) estéril.
¾ Discos de 6 mm de diámetro impregnados con agentes antimicrobianos.
¾ Torundas de algodón estériles.
¾ Pipetas Pasteur estériles.

¾ Tubos conteniendo estándar de McFarland 0.5. El diámetro de los tubos debe ser igual al de

los tubos conteniendo la solución salina estéril para hacer la suspensión de la bacteria.

¾ Pinzas.

222. Método de difusión con disco en agar – Fernando García, PhD

¾ Regla milimétrica.

2.3. Procedimiento.

1. Permitir que las placas de agar Mueller-Hinton y los discos alcancen la temperatura ambiente
antes de utilizarlos.
2. Preparar una suspensión en solución salina estéril a partir de un cultivo fresco. La turbidez de
la suspensión se debe ajustar a la turbidez del estándar 0.5 de McFarland (1.5 × 108UFC/ml).
Utilizar esta suspensión para inocular las placas de agar Mueller-Hinton antes de 15 minutos.
3. Introducir la torunda de algodón en la suspensión y rotarla contra las paredes internas del tubo
para remover el exceso de inóculo.
4. Inocular con la torunda la superficie del agar en tres direcciones, rotando la placa
aproximadamente 60º entre las inoculaciones. Utilizar una torunda por cada placa de medio.
5. Permitir que el inóculo sobre la superficie del medio de cultivo se seque antes de aplicar los
discos. La aplicación de los discos se debe hacer luego de 3 minutos y antes de 15 minutos
de inoculada la placa.
6. Aplicar los discos a la superficie del medio de cultivo utilizando pinzas:
¾ No se deben colocar más de 6 discos en las placas que tienen 90 mm de diámetro y la
distancia entre los centros de los discos no debe ser menor a 25 mm.

232. Método de difusión con disco en agar – Fernando García, PhD

¾ Una vez colocados, presionar levemente cada uno de los discos para que se adhieran a la
superficie del agar.
¾ No volver a colocar los discos una vez que han hecho contacto con la superficie del agar,
debido a que la difusión de la sustancia empieza inmediatamente.
¾ Una vez colocados los discos, las placas deben ser colocadas en la incubadora antes de
15 minutos.
7. La incubación se debe efectuar a 35ºC por 16-18 horas. Si se prueban especies de
Staphylococcus con penicilinas β-lactamasa-resistentes (meticilina, oxacilina, nafcilina) la
incubación debe prolongarse adicionalmente 6-8 horas (24 horas en total) y el medio de
cultivo debe contener 4% de NaCl adicional para inducir el fenotipo.
8. Realizar la lectura de la prueba mediante determinación del diámetro de la zona de inhibición
(incluyendo el diámetro del disco):
¾ La lectura de la prueba se puede realizar solamente si hay crecimiento confluente.
¾ Colocar la placa sobre una superficie negra pero bien iluminada (luz directa a 45º), con
el fondo hacia arriba y la tapa hacia abajo. En el caso que se utilicen medios de cultivo
opacos (agar Mueller-Hinton suplementado con sangre), colocar la placa con el fondo
hacia abajo y remover la tapa para realizar la lectura.
¾ Medir el diámetro de inhibición con una regla milimétrica al milímetro más cercano.
¾ Si aparecen colonias individuales dentro de la zona de inhibición, tales colonias deben
ser subcultivadas, identificadas y analizadas mediante una prueba de susceptibilidad a
antimicrobianos.

2.4. Reporte de resultados.

¾ Si los criterios de control de calidad (ver 2.5) son aceptables, interpretar los diámetros de la
zona de inhibición de acuerdo a los criterios dados en las tablas adjuntas y reportar los
resultados de la siguiente manera (ejemplo):

242. Método de difusión con disco en agar – Fernando García, PhD

Cultivo positivo por Escherichia coli
Prueba de susceptibilidad a antimicrobianos:
Ampicilina Sensible ≤ 8 µg/ml

Cefazolina Sensible ≤ 8 µg/ml

Gentamicina Intermedio 8 µg/ml

Mezlocilina Sensible ≤ 16 µg/ml

Tetraciclina Resistente ≥ 16 µg/ml

¾ Si una cepa de Staphylococcus resulta resistente a meticilina, oxacilina o nafcilina, se debe

reportar como resistente a todos los antibióticos β-lactámicos incluyendo combinaciones con

inhibidores de β-lactamasas, todas las penicilinas, todas las cefalosporinas e imipenem,

independientemente de los respectivos resultados de las pruebas de susceptibilidad.

2.5. Control de calidad.

¾ Cepas bacterianas para control de calidad.

Cepas bacterianas Uso Comentarios

E. coli ATCC 25922 Pruebas de rutina No productora de β-lactamasa

S. aureus ATCC 25923 Pruebas de rutina No productora de β-lactamasa

P. aeruginosa ATCC 27853 Aminoglicósidos

E. faecalis ATCC 29212 Trimetoprim-sulfametoxazole Monitoreo de concentración de

timidina en el agar: altas

concentraciones antagonizan la

actividad de trimetoprimsulfametoxazole, trimetoprim y

sulfonamidas.

E. coli ATCC 35218 Combinaciones de β-lactámico

con inhibidor de β-lactamasas

Productora de β-lactamasa

¾ Frecuencia del control de calidad.

9 Debe ser realizado diariamente y cada vez que se adquiere un nuevo lote de cada uno de

los materiales, incluyendo los medios de cultivo y los discos impregnados con

antibióticos.

252. Método de difusión con disco en agar – Fernando García, PhD

9 Los diámetros de las zonas de inhibición deben estar dentro de los límites establecidos.

9 Si el control de calidad se realiza diariamente, no deben darse más de un resultado de 20

fuera de los límites establecidos (límite de confidencialidad del 95%).

2.6. Consideraciones generales sobre el método de difusión con disco.

¾ Errores frecuentes.

9 Errores clericales al transcribir los resultados.

9 Errores técnicos en la realización de la prueba:

™ Lectura errónea de las zonas de inhibición.

™ Inóculo muy denso o muy liviano.

9 Errores en los materiales:

™ Variabilidad en la preparación de las placas de agar Mueller-Hinton.

™ Pérdida de potencia de los discos por mal almacenamiento, mala manipulación o discos

defectuosos.

™ Contaminación de los materiales utilizados.

9 Errores en los equipos.

¾ Limitaciones del procedimiento.

9 Esta técnica está estandarizada para bacterias no fastidiosas de crecimiento aerobio rápido,

incluyendo especies de la familia Enterobacteriaceae, Staphylococcus, Acinetobacter,

Enterococcus, algunas especies de Streptococcus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas

aeruginosa y otras especies y géneros relacionados.

9 Algunas cepas de Staphylococcus resistentes a meticilina pueden no ser detectados mediante

esta técnica.

9 Esta técnica no debe utilizarse para pruebas con vancomicina cuando se analizan especies de

Enterococcus y Staphylococcus debido a la pobre difusión de la droga.

9 Numerosos factores influyen el resultado de la prueba, incluyendo el inóculo, la tasa de

crecimiento, la formulación y el pH del medio, las condiciones de incubación, el contenido

262. Método de difusión con disco en agar – Fernando García, PhD

del disco, la tasa de difusión de la droga y la lectura de la zona de inhibición, por lo que es

fundamental adherirse estrictamente al procedimiento.

272. Método de difusión con disco en agar – Fernando García, PhD

Anexo 2.1. Interpretación de las zonas de inhibición para especies de la familia Enterobacteriaceae.

Antimicrobiano Disco (µg) Zona de inhibición (mm)

http://www.netropica.org/bacteriologia/DifusionKB.pdf

NUMERO MAS PROBABLE:

http://www.uprm.edu/biology/profs/massol/manual/p4-nmpenumeracion.pdf

http://aprendeenlinea.udea.edu.co/revistas/index.php/vitae/article/viewFile/595/503

http://books.google.com.co/books?
id=Z6onofK2ToEC&pg=PA52&dq=COMO+SE+HACE+UN+ANTIBIOGRAMA+GENTAMICINA&hl=es&ei
=aDc7TcuQIMXflgfkrMjqBA&sa=X&oi=book_result&ct=book-
thumbnail&resnum=1&ved=0CCQQ6wEwAA#v=onepage&q=COMO%20SE%20HACE%20UN
%20ANTIBIOGRAMA%20GENTAMICINA&f=false