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ANTIBIOGRAMA

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2. METODO DE DIFUSION CON DISCO EN AGAR Fernando García, PhD 2.1. Fundamento de la prueba.

Una suspensión de la bacteria en estudio se inocula sobre la superficie de una placa de agar Mueller-Hinton. Posteriormente se colocan sobre la superficie del agar discos de papel de filtro impregnados con cantidades estandarizadas de agentes antimicrobianos. Luego del período de incubación se mide el diámetro de la zona de inhibición alrededor de los discos (ver Figura 2.1). El tamaño de la zona de inhibición es inversamente proporcional a la concentración inhibitoria mínima (MIC) de la bacteria (ver Figura 2.2) y mediante el uso de tablas de referencia (ver anexos 2.1., 2.2., 2.3. y 2.4) se prepara un reporte cualitativo (sensible, intermedio o resistente). A B

Figura 2.1. Principio de la técnica de difusión con disco en agar. La concentración del antibiótico decrece conforma mayor sea la distancia desde el borde del disco (A). En el área en donde la concentración del antibiótico sea insuficiente para inhibir el crecimiento, se observará un margen a partir del cual ocurrirá un crecimiento confluente(B).

En este caso. ¾ Cultivos frescos de 18-24 horas en medio sólido de la bacteria a probar. mientras que zonas de inhibición de 11 mm se interpretan como resistente con una MIC de 32 µg/ml. ¾ Discos de 6 mm de diámetro impregnados con agentes antimicrobianos. ¾ Torundas de algodón estériles. Ejemplo de un análisis de regresión para determinar la relación entre la CIM y los puntos de quiebre en la prueba de difusión con disco. PhD Resistente Intermedio Sensible ) l m g/ µ C ( MI Diámetro de la zona de inhibición (mm) Figura 2.2.2. zonas de inhibición de 20 mm se interpretan como susceptible con una MIC de 8 µg/ml. Método de difusión con disco en agar Fernando García.2. Zonas de inhibición de 12-19 mm se interpretan como intermedio con una MIC de 16 µg/ml. ¾ Placas de agar Mueller-Hinton con un espesor de 4 mm (24 ml de medio en placas de Petri de 90 mm de diámetro). ¾ Tubos conteniendo solución salina (0. Materiales. . 2.85% NaCl) estéril.

Procedimiento. PhD ¾ Una vez colocados. Permitir que las placas de agar Mueller-Hinton y los discos alcancen la temperatura ambiente antes de utilizarlos. Método de difusión con disco en agar Fernando García. ¾ Colocar la placa sobre una superficie negra pero bien iluminada (luz directa a 45º). las placas deben ser colocadas en la incubadora antes de 15 minutos. Introducir la torunda de algodón en la suspensión y rotarla contra las paredes internas del tubo para remover el exceso de inóculo. La turbidez de la suspensión se debe ajustar a la turbidez del estándar 0. 4. ¾ Tubos conteniendo estándar de McFarland 0. Aplicar los discos a la superficie del medio de cultivo utilizando pinzas: ¾ No se deben colocar más de 6 discos en las placas que tienen 90 mm de diámetro y la distancia entre los centros de los discos no debe ser menor a 25 mm. presionar levemente cada uno de los discos para que se adhieran a la superficie del agar. Inocular con la torunda la superficie del agar en tres direcciones. El diámetro de los tubos debe ser igual al de los tubos conteniendo la solución salina estéril para hacer la suspensión de la bacteria. 3. 7. Si se prueban especies de Staphylococcus con penicilinas -lactamasa-resistentes (meticilina. ¾ Una vez colocados los discos. oxacilina.5 de McFarland (1. 1. PhD ¾ Regla milimétrica. debido a que la difusión de la sustancia empieza inmediatamente. rotando la placa aproximadamente 60º entre las inoculaciones. 232.5 × 108UFC/ml). La incubación se debe efectuar a 35ºC por 16-18 horas. con . 2. Preparar una suspensión en solución salina estéril a partir de un cultivo fresco. La aplicación de los discos se debe hacer luego de 3 minutos y antes de 15 minutos de inoculada la placa. Utilizar esta suspensión para inocular las placas de agar Mueller-Hinton antes de 15 minutos. 8. ¾ No volver a colocar los discos una vez que han hecho contacto con la superficie del agar. 222. Permitir que el inóculo sobre la superficie del medio de cultivo se seque antes de aplicar los discos. Utilizar una torunda por cada placa de medio. 5.3. 2. Método de difusión con disco en agar Fernando García. Realizar la lectura de la prueba mediante determinación del diámetro de la zona de inhibición (incluyendo el diámetro del disco): ¾ La lectura de la prueba se puede realizar solamente si hay crecimiento confluente. 6. nafcilina) la incubación debe prolongarse adicionalmente 6-8 horas (24 horas en total) y el medio de cultivo debe contener 4% de NaCl adicional para inducir el fenotipo. ¾ Pinzas.¾ Pipetas Pasteur estériles.5.

2.4. Método de difusión con disco en agar Fernando García.5) son aceptables. Cepas bacterianas Uso Comentarios E. todas las penicilinas. PhD Cultivo positivo por Escherichia coli Prueba de susceptibilidad a antimicrobianos: Ampicilina Sensible 8 µg/ml Cefazolina Sensible 8 µg/ml Gentamicina Intermedio 8 µg/ml Mezlocilina Sensible 16 µg/ml Tetraciclina Resistente 16 µg/ml ¾ Si una cepa de Staphylococcus resulta resistente a meticilina. faecalis ATCC 29212 Trimetoprim-sulfametoxazole Monitoreo de concentración de timidina en el agar: altas . ¾ Si los criterios de control de calidad (ver 2. oxacilina o nafcilina. aureus ATCC 25923 Pruebas de rutina No productora de -lactamasa P. interpretar los diámetros de la zona de inhibición de acuerdo a los criterios dados en las tablas adjuntas y reportar los resultados de la siguiente manera (ejemplo): 242. Reporte de resultados. todas las cefalosporinas e imipenem. ¾ Si aparecen colonias individuales dentro de la zona de inhibición. tales colonias deben ser subcultivadas. Control de calidad. independientemente de los respectivos resultados de las pruebas de susceptibilidad. colocar la placa con el fondo hacia abajo y remover la tapa para realizar la lectura. 2. aeruginosa ATCC 27853 Aminoglicósidos E.5. ¾ Medir el diámetro de inhibición con una regla milimétrica al milímetro más cercano. identificadas y analizadas mediante una prueba de susceptibilidad a antimicrobianos.el fondo hacia arriba y la tapa hacia abajo. se debe reportar como resistente a todos los antibióticos -lactámicos incluyendo combinaciones con inhibidores de -lactamasas. coli ATCC 25922 Pruebas de rutina No productora de -lactamasa S. En el caso que se utilicen medios de cultivo opacos (agar Mueller-Hinton suplementado con sangre). ¾ Cepas bacterianas para control de calidad.

9 Errores técnicos en la realización de la prueba: Lectura errónea de las zonas de inhibición. coli ATCC 35218 Combinaciones de -lactámico con inhibidor de -lactamasas Productora de -lactamasa ¾ Frecuencia del control de calidad. 252. ¾ Errores frecuentes. no deben darse más de un resultado de 20 fuera de los límites establecidos (límite de confidencialidad del 95%). E. 9 Errores clericales al transcribir los resultados. 2. incluyendo los medios de cultivo y los discos impregnados con antibióticos. Inóculo muy denso o muy liviano. mala manipulación o discos defectuosos. ¾ Limitaciones del procedimiento. Pérdida de potencia de los discos por mal almacenamiento. PhD 9 Los diámetros de las zonas de inhibición deben estar dentro de los límites establecidos. . 9 Errores en los equipos. Método de difusión con disco en agar Fernando García. Consideraciones generales sobre el método de difusión con disco. 9 Si el control de calidad se realiza diariamente. trimetoprim y sulfonamidas. Contaminación de los materiales utilizados. 9 Debe ser realizado diariamente y cada vez que se adquiere un nuevo lote de cada uno de los materiales.6. 9 Errores en los materiales: Variabilidad en la preparación de las placas de agar Mueller-Hinton.concentraciones antagonizan la actividad de trimetoprimsulfametoxazole.

Staphylococcus. el contenido 262. Método de difusión con disco en agar Fernando García.pdf NUMERO MAS PROBABLE: http://www. incluyendo especies de la familia Enterobacteriaceae.udea. 9 Numerosos factores influyen el resultado de la prueba.php/vitae/article/viewFile/595/503 http://books.9 Esta técnica está estandarizada para bacterias no fastidiosas de crecimiento aerobio rápido.1. PhD del disco. 9 Algunas cepas de Staphylococcus resistentes a meticilina pueden no ser detectados mediante esta técnica. Acinetobacter.co/revistas/index. las condiciones de incubación. 9 Esta técnica no debe utilizarse para pruebas con vancomicina cuando se analizan especies de Enterococcus y Staphylococcus debido a la pobre difusión de la droga. la formulación y el pH del medio.edu. la tasa de crecimiento. Pseudomonas aeruginosa y otras especies y géneros relacionados. incluyendo el inóculo. Listeria monocytogenes.edu/biology/profs/massol/manual/p4-nmpenumeracion. la tasa de difusión de la droga y la lectura de la zona de inhibición.org/bacteriologia/DifusionKB.pdf http://aprendeenlinea.com.google.uprm. Método de difusión con disco en agar Fernando García. Interpretación de las zonas de inhibición para especies de la familia Enterobacteriaceae. PhD Anexo 2. Enterococcus. algunas especies de Streptococcus.netropica.co/books?id=Z6onofK2ToEC&pg=PA52&dq=COMO+SE+HACE+UN+ANTIB IOGRAMA+GENTAMICINA&hl=es&ei=aDc7TcuQIMXflgfkrMjqBA&sa=X&oi=book_result&ct=book- . 272. Antimicrobiano Disco (µg) Zona de inhibición (mm) http://www. por lo que es fundamental adherirse estrictamente al procedimiento.

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