Una enzima de restricción (o endonucleasas de restricción) es aquella que

puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una

molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o
diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a éste, dependiendo de la
enzima.
Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son
reconocidos.
El mecanismo de corte de DNA se realiza a través de la ruptura de 2 enlaces
fosfodiester en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. Éstos
pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o ohesivos/escalonados.

Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo, ya que

los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en
la cercanía (Apareamiento de Watson & Crick).

Corte cohesivo Corte romo

SmaI
Eco RI
•Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y
modificación (metila). Al reconocer la secuencia específica de DNA corta al azar en
sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea aguas arriba o aguas abajo. El corte
deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar
de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases
aproximadamente), además de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg ++ como cofactores.

•Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación.
El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que el
corte es resistente y predecible. Por esta característica es que son muy utilizadas para
clonación de genes, ya que al cortar en sitios específicos se pueden recuperar
secuencias conocidas. Sólo requieren Mg ++ como cofactor, no necesitan de ATP.

•Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades
enzimáticas. Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27 pares de
bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos
secuencias de reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA.
Necesitan ATP, Mg++ y SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.

Hay otros sistemas de restricción descubiertos actualmente, como el sistema tipo 4 de

E. coli (Eco571) que consta de una sola enzima que corta únicamente DNA metilado
en una secuencia específica, y que además metila.
Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras
enzimas llamadas ligasas. Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es
capaz de replicarse independientemente del ADN de la célula anfitriona en la
cual crece. Dentro de este grupo de vectores están los Plásmidos, moléculas
circulares de ADN halladas en las bacterias.

Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas

especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo
extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas
Isoesquizómeros. Por ejemplo, están los isoesquizómeros Asp718 y KpnI.

El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los microbiólogos Werner

Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las
endonucleasas de restricción lo que condujo al desarrollo de la tecnología de
ADN recombinante. El primer uso práctico de su trabajo fue la manipulación de
la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabéticos.
NOMENCLATURA
El nombre de cada enzima de restricción está asignado según el origen
bacteriano de la misma. La nomenclatura utilizada para denominar estas
enzimas consiste en:
1º. Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo (ej.
Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin)); y por ello las tres primeras
letras del nombre se escriben en cursiva.
2º. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli )
3º. En números romanos, un número para distinguir si hay más de una
endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima
de restricción.
4º. Todas deberían llevar delante una R de restricción o un M de metilasa según
la función de la enzima, pero generalmente se omite.
De esta manera, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se construiría
de la siguiente manera:

Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:

E Escherichia Género de la bacteria

co coli Especie de la bacteria

R RY13 Cepa de la bacteria

La primera enzima Orden de identificación de la

I
identificada enzima en la bacteria
 Enzima Origen Bacteriano Sitio de Reconocimiento Resultado del Corte
5'GAATTC 5'---G AATTC---3'
EcoRI Escherichia coli
3'CTTAAG 3'---CTTAA G---5'
5'GGATCC 5'---G GATCC---3'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens
3'CCTAGG 3'---CCTAG G---5'
CH3 CH3
| |
5'GATC 5'---GA TC---3'
DpnI* Diplococcus pneumoniae
3'CTAG 3'---CT AG---5'
| |
CH3 CH3

5'AAGCTT 5'---A AGCTT---3'

HindIII Haemophilus influenzae
3'TTCGAA 3'---TTCGA A---5'
5'TCGA 5'---T CGA---3'
TaqI Thermus aquaticus
3'AGCT 3'---AGC T---5'
5'GCGGCCGC 5'---GC GGCCGC---3'
NotI Nocardia otitidis
3'CGCCGGCG 3'---CGCCGG CG---5'
5'GANTC 5'---G ANTC---3'
HinfI Haemophilus influenzae
3'CTNAG 3'---CTNA G---5'
5'GATC 5'--- GATC---3'
Sau3A Staphylococcus aureus
3'CTAG 3'---CTAG ---3'
5'CAGCTG 5'---CAG CTG---3'
PovII* Proteus vulgaris
3'GTCGAC 3'---GTC GAC---5'
5'CCCGGG 5'---CCC GGG---3'
SmaI* Serratia marcescens
3'GGGCCC 3'---GGG CCC---5'
5'GGCC 5'---GG CC---3'
HaeIII* Haemophilus egytius
3'CCGG 3'---CC GG---5'
5'AGCT 5'---AG CT---3'
AluI* Arthrobacter luteus
3'TCGA 3'---TC GA---5'
5'GATATC 5'---GAT ATC---3'
EcoRV* Escherichia coli
3'CTATAG 3'---CTA TAG---5'
5'GGTACC 5'---GGTAC C---3'
KpnI[1] Klebsiella pneumonia
3'CCATGG 3'---C CATGG---5'
5'CTGCAG 5'---CTGCA G---3'
PstI[1] Providencia stuartii
3'GACGTC 3'---G ACGTC---5'
5'GAGCTC 5'---GAGCT C---3'
SacI[1] Streptomyces achromogenes
3'CTCGAG 3'---C TCGAG---5'
5'GTCGAC 5'---G TCGAC---3'
SalI[1] Streptomyces albue
3'CAGCTG 3'---CAGCT G---5'
5'GCATGC 5'---G CATGC---3'
SphI[1] Streptomyces phaeochromogenes
3'CGTACG 3'---CGTAC G---5'
5'TCTAGA 5'---T CTAGA---3'
XbaI[1] Xanthomonas badrii
3'AGATCT 3'---AGATC T---5'
* = ADN queda con extremos romos
Uno de los campos en los que el uso de enzimas de restricción ha tenido mayor
implicación ha sido el diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas con
cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o
deleciones de fragmentos. Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de
la enzima de restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de
corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se
deberían observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una
electroforesis.
El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. M. Southern para
la detección de genes específicos en el ADN celular.
El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados
por tamaños mediante una electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos
de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico
separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas.
Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa,
con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los
fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuación el filtro se incuba durante
un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante
la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla
de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de
ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla
mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas
radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas
Se muestra la dotación genética (azul) de un individuo homocigoto (A) y uno
heterocigoto. (B) para un marcador; tras hibridarse con una sonda específica
(rosa) se observa el resultado del Southern a la derecha.
El northern o northern blot, se utiliza para identificar las cadenas de
ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a
diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el
método northern sirve para identificar ARN.
El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una
electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que
mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso
continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El
método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar
estudios de expresión génica; para conocer qué genes están activos
formando ARN mensajero en qué condiciones, en qué tejidos o tipos
celulares.
Hibridación in situ
Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales
biológicos para su observación al microscopio, junto con el desarrollo
de técnicas de hibridación tipo northern ha llevado a poder realizar la
hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material
orgánico, utilizando técnicas inmunohistoquímicas se puede conocer la
localización precisa de los tejidos y células que están expresando los
genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas.

También en esta categoría destaca el FISH, técnica de hibridación in

situ, donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a
secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma, con la que
comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un
microscopio electrónico.
Resolving capacity of agarose gels with or
without 50 % formamide.
HpaII fragments of pBR322 DNA (0.8 μg)
were electrophoretically separated on a 2
mn thick gel until the dye marker was
within 4cm of the bottom of the gel and
then stained with Et Br.
The fragment lengths were obtained from
sequence data.
Lane 1: 2% agarose gel
lane 2: 2 % agarose-50% formamide gel
1ane 3: 7% agarose-50% formamide gel