Detección de Chlamydia trachomatis en Mujeres

Embarazadas por la Técnica de Papanicolaou, Ensayo

Inmunoenzimatico y Reacción en Cadena de la Polimerasa
 OBJETIVO

• Comparar tres diferentes pruebas diagnosticas utilizadas para la

detección de Chlamydia trachomatis a 125 mujeres
embarazadas con o sin síntomas que asistieron a su primera
consulta en el Hospital General Regional Ignacio Zaragoza de
México D. F.
• Técnica de Papanicolaou
• Ensayo inmunoenzimatico
• Reacción en cadena de la polimerasa
CONCEPTOS GENERALES
Clasificación científica de la Chlamydia trachomatis
Chlamydia:
Palabra del griego khlamýs, khlamýdös que significa "capa" o
"encapotado"

REINO ORDEN FAMILIA GENERO ESPECIE

C. Abortus
C.Psittaci
Chlamydophila C. Pecorum
C. Caviae
Bacteria Chlamidiales Chlamydiaceae
C. Felis
C. Trachomatis
Chlamydia C. Muridarum
C. Suis

Nueva clasificación propuesta por Karin Everett, Bush y Anderson en 2002

 Chlamydia trachomatis
características
• En un microorganismo intracelular obligado que infecta a las
células del epitelio plano, glandular y especialmente el de
reparación o de metaplasia.
• Es una bacteria Gram-negativa, aerobia y no móvil.
• La Chlamydia es reconocida como el patógeno de transmisión
sexual más común en el mundo.
• Tiene propiedades similares a los VIRUS , ya que contienen
DNA Y RNA.
• Se comporta como PARASITO intracelular ya que utiliza las
proteínas celulares para su crecimiento y multiplicación.
 Chlamydia trachomatis
características
• No pueden sintetizar ATP, por lo que requieren un hábitat
intracelular.
• Se dividen por fisión binaria.
• Son esféricas u ovaladas observándose como cocos.
• Morfológicamente presenta dos estructuras diferentes que
son los llamados Cuerpos Elementales (CE) y los Cuerpos
Reticulados (CR).
• la Chlamydia se adhiere a la base de los micro vellos de la
célula y de allí se interna por un mecanismo de endocitosis.
 Chlamydia trachomatis

Complicaciones en la mujer por orden de aparición:

1) Infección vaginal: Al inicio del contacto, portadora asintomática.

2) Cervicitis: Inflamación del cuello de la matriz por la infección.
3) Endometritis: Infección de la mucosa de la cavidad de la matriz.

4) Salpingitis: Inflamación de las trompas de Falopio.

5) Enfermedad Inflamatoria Pélvica (Linfogranuloma venéreo):
Infección de la cavidad peritoneal y estructuras anexas
 Chlamydia trachomatis
En las mujeres embarazadas, si no es tratada la enfermedad
puede provocar partos prematuros.

Cérvix con secreción

 Chlamydia trachomatis
La chlamydia puede provocar en el hombre:

• Epididimitis (esterilidad).

• Linfogranuloma venéreo.

• Uretritis, cuyos síntomas son:

-Dificultad para orinar.
-Micción dolorosa.
-Sensación de orinar.
-Secreción del pene.
-Sensibilidad testicular.
 Chlamydia trachomatis

En los niños la chlamydia puede causar:

Conjuntivitis neonatal.
Neumonía temprana
Conjuntivitis purulenta
Rinitis
Vulvitis
Otitis
Rinofangitis
 Manifestación clínica y Serotipos

Manifestaciones clínicas
Especie Serotipo Enfermedad
A,B,C Tracoma
Conjuntivitis
Uretritis
Cervicitis
D,E,F,G,H,I,J Salpingitis
Chlamydia tracomatis
Endometritis
Epididimitis
Neumonía
Linfogranuloma
L1, L2, L3 venéreo
 Ciclo de vida de la Chlamydia trachomatis
La diferencia de la Chlamydia de otras bacterias y de los virus
es que presentan dos estructuras morfológicas diferentes.

Cuerpos Elementales.

Cuerpo Reticulares.
 Cuadro comparativo
Cuerpos elementales y Cuerpos reticulares
Características Cuerpos elementales Cuerpos reticulares
Forma Redondos Redondos
Tamaño 300nm a 400nm 800nm a 1000nm
Fase Extracelular Intracelular
Metabolismo Inactivos Activos
Estructura Resistentes Frágiles
Fase infectiva Si No
Fase replicativa No Si
Síntesis de ATP No No

C.Reticular

C.Elemental

Cuatro cuerpos elementales rodeada por el cuerpo reticulado que los produjo De la Universidad de Southampton Escuela de Medicina .
Ciclo de crecimiento de la Chlamydia
 Ciclo de desarrollo de la Chlamydia trachomatis

célula
cuerpo
elemental núcleo

inclusión

Cuerpo
reticular
 Citología

Para Shinna y Gupta, la imagen que da mayor sensibilidad diagnostica es

al inicio del ciclo celular, en la que se puede observar una fina
vacuolación del citoplasma en forma de mordidas de polilla o como
inclusiones nebulares, sumado a esto se puede observar una gran
presencia de polimorfonucleares
No se le considera positivo a infección de Chlamydia
 Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
Técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por
Kary Mullis. Bioquímico estadounidense que imita el
fenómeno de replicación del ADN que ocurre de
manera natural en las células vivas

Para llevar a cabo esta técnica los científicos aíslan el

fragmento que va a ser amplificado en un tubo de
ensayo y le aplican calor para separar las dos cadenas
de la molécula

La PCR utiliza una enzima llamada

Polimerasa para multiplicar rápidamente
el pequeño fragmento de ADN.
 Ciclo de la PCR

Se divide en 3 fases:
1)Desnaturalización
Donde se calienta el ADN para separar las cadenas que lo
forman
2)Templado
La temperatura de la mezcla se rebaja para que los cebadores o
fragmentos iniciadores del ADN se enlacen con las cadenas
separadas de esta molécula
3) Polimerización
La temperatura de la mezcla se eleva hasta los 75 °C para que
la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN
Ciclo de la PCR
 Inmunoensayo enzimático (EIA)
• El fundamento de esta técnica consiste en que la Chlamydia
trachomatis cuando está presente en la muestra, se une al
anticuerpo monoclonal anti-LPS usado como el reactivo
detector, presente en la placa comercial, formando un
complejo que se revela al adicionar el conjugado del
anticuerpo anti-inmunoglobulina humana con la peroxidasa y
posteriormente, el sustrato de enzima.

• Se desarrolla un color amarillo a naranja en proporción a la

cantidad de antígeno presente en la muestra por medio de un
detector espectrofotométrico.
 Inmunofluorescencia (DIF)
• La inmunofluorescencia (DIF) es una técnica que emplea
anticuerpos conjugados a fluorocromos.
• Sobre un porta se deposita una muestra en la que se busca la
presencia de un determinado antígeno.
• Se añade un suero específico del antígeno problema marcado
con isotiocinato de fluoresceína (conjugado).

Detención de antígeno por Inmunofluorescencia Directa

Si el antígeno problema se encuentra presente en la
muestra, se une el conjugado. En caso contrario el
conjugado se elimina con un lavado del porta.
La lectura se realiza en un microscopio de fluorescencia,
que emite luz ultravioleta de una determinada longitud de
onda.
ESTUDIO
 Material y métodos

Material biológico
• 2 muestras fueron tomadas a cada una
de las 125 mujeres embarazadas al
acudir a su primera revisión medica

• Las muestras fueron tomadas con un

hisopo de algodón esterilizado

• Todos las muestras fueron encontradas

satisfactorias para su evaluación
citopatológica. De las que 105
mostraban síntomas de la infección y
20 no mostraban ningún síntoma
 Estudio citológico
El primer hisopo de algodón fue extendido en una laminilla fue
teñida usando la técnica de Papanicolaou y observada en un microscopio
de luz.
Se encontró:
Células de metaplasia infectadas con
Chlamydia que contenían múltiples o
sencillas inclusiones al interior del
citoplasma. Los cuerpos de inclusión
tenían una homogénea distribución de
apariencia nebular o también en forma
de inclusiones densas, tipo tiro al blanco.

Ademas se observo una sustancial

cantidad de polimorfonucleares
•Células de metaplasia donde se observan múltiples inclusiones nebulares dentro del citoplasma
•el contorno de las vacuolas no está claramente definido.
•Polimorfonucleares.
•Inclusiones nebulares se observa al interor de la celula de metaplasia.
•Nucleos excentricos
•elcontorno de la celula esta bien definido.
 Inmunoensayo enzimático (EIA)

• El segundo hisopo de algodón

fue puesto en el medio de
transporte incluido en el equipo
de EIA.

• Todas las muestras se probaron

para el antígeno según las
instrucciones incluidas en el
Detector de inmunoensayo
equipo

• La muestra fue considerada positiva si la densidad óptica

estuviera más allá del límite calculado usando un control negativo
 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Termociclador
• 500 micro litros de la mezcla
preparada para EIA fueron tomados
y procesados.

• Fueron centrifugadas por 15

minutos a 4 C, se des-ionizó y se
lavaron por 10 minutos.

• Se volvió a centrifugar y se
incubaron a 54 C con proteinasa
por 10 minutos

Tubos de PCR
 Inmunoflourescencia (DIF)
• Las muestras cuyos resultados difirieron
fueron testeados (probados) por DIF.
• Las muestras fueron analizadas con un
microscopio de fluorescencia.
• El criterio usado para determinar positivo a
Chlamydia fue la presencia de 5 o más
cuerpos elementales.

Una muestra fue considerada como

Verdadera positiva cuando 2 o más
de las técnicas de diagnostico
comparadas, demostraron la
presencia de Chlamydia
RESULTADOS
 Detección De Chlamydia trachomatis
Grupo
Sintomáticas Asintomáticas
  (112) (13)  
Método Positivos Positivos Total positivos
Papanicolaou 2 2 4
EIA 11 1 12
PCR 2 1 3

sintomáticas asintomáticas
Papanicolaou EIA Papanicolaou EIA
PCR NEGATIVAS PCR NEGATIVAS
2% 10% 15%
2% 8%

8%
87% 69%
Muestras Positivas para Chlamydia trachomatis
Por los 4 diferentes métodos
MUESTRA PAPANICOLAOU EIA PCR DIF
24        
25        
47        
50        
71        
72        
74        
77        
89        
99        
101        
103        
104        

POSITIVO  
NEGATIVO  
 Características sociales y demográficas de las
pacientes
• La edad promedio de las personas infectadas fue de 24 años
• 2 de las pacientes infectadas eran solteras
• Las pacientes eran sexualmente activas con una edad
promedio de 21 años
• 100% de los participantes estaban en el tercer trimestre de su
embarazo
• El número de embarazos promedio fue de 3
• El número promedio de parejas sexuales fue de 1
• El nivel socioeconómico promedio fue medio
• Solo una paciente tenia historia de ETS
Resumen
Análisis Comparativo para la detección de Chlamydia por los 3
diferentes métodos
Positivos
Método Sensibilidad Especificidad verdaderos Precisión

Papanicolaou 100 99.18 75 99.2

EIA 100 92.62 25 92

PCR 100 100 100 100

En resumen a pesar de que la técnica de Papanicolaou no es
considerada fiable para el diagnostico de la Chlamydia ésta
puede ser superior a el Ensayo Inmunoenzimatico y ofrecer un
diagnostico adecuado en mujeres embarazadas cuando la
muestra es satisfactoria para ser diagnosticada y es realizada
por personal experimentado y calificado.

Por otra parte, PCR demostró ser la prueba diagnóstica con

mas especificidad y sensibilidad
 Hallazgos citológicos
Diagnostico citológico
Negativas 2
Cándida spp 17
Coco bacilar 5
Actinomyces spp 1
Proceso inflamatorio 96
chlamydia 4
Total muestras 125
80
70
Negativas 1.6%
60
Candida spp 13.6%
50
Cocobacilar 4.0%
40
Actinomyces spp 0.8%
30 Proc. Inflamatorio 76.8%
20 Chlamydia 3.2%
10
0
Porcentaje de casos
Varios autores como, Geerling, Kapur y Waters no consideran a la técnica de
Papanicolaou lo suficientemente especifica debido a la dificultad para diferenciar
entre una real inclusión de Chlamydia de otros con características morfológicas
o estructuras parecidas como núcleos degenerados, gránulos de lípidos, detritus
bacterial, por consiguiente han sugerido que la Chlamydia es encontrada solo en
casos donde las inclusiones son de tipo nebular y no en las de tipo de tiro al
blanco, ya que estas representan material celular amorfo, según Michelle Henry
En este estudio el tipo de inclusiones encontrados en las muestras
positivas fueron del tipo nebular y tales inclusiones fueron encontradas
en un número limitado

Esta observación es respaldada por varios investigadores como Kellogg y

Foster que han reportado que tales inclusiones son muy frágiles y por lo
tanto rara vez son encontradas intactas
 Conclusión

La técnica de Papanicolaou y PCR son adecuadas pruebas

diagnosticas para la detección de Chlamydia trachomatis. EIA
no es una prueba diagnóstica confiable en mujeres
embarazadas de bajo riesgo y baja
 BIBLIOGRAFIA

Bañuelos C. Deleon I. Hernandez J. Martinez L. Akle D. Miranda J. Reyes E. Detection of Chlamydia

trachomatis in women by the Papanicolaou technique, enzime immunoassay and polimerase chain
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Henry M. Jensen K.Skoglund C. Armstrong D. Clamydia trachomatis in routine cervical

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Barnes. R. Infecciones causadas por Chlamydia trachomatis . Enfermedades de Transmisión

Sexual. Philadelphia , USA. Cap 6. 1999.
Murray P. Drew W. Kobayashi G. Thompson J. Microbiología médico 1ª edición Española 1992. p.
354-378.

Masson-salvat Diccionario medico.3ª edición. Barcelona: Salvat editores, S.A. 1971: p.45.

Bush, R.M. and Everett, K.D.E. Molecular Evolution of the Chlamydiaceae.

Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 203 -204. 2001