Compartimientos intracelulares y claslflcaclon de protefnas

A diferencia de las bacterias, que generalrnente constan de un unico compartirniento rodeado por una membrana plasmatica, la celula eucariota esta subdividida en compartimientos. rode ados pOI membrana, que son funcionalmente distintos. Cada eompartimiento u organulo contiene su propia co1ecci6n de enzimas, otras molecules especializadas y un complejo sistema de distribuci6n que transporta espeefficamente los compuestos de un compartimiento a otro. Para entender la celula eucariota es necesario conoeer 10 que sucede en cada uno de estos compartimientos, c6mo se desplazan las rnoleculas entre ellos y c6mo se generan los compartimientos a sf mismos y se conservan.

Las protefnas juegan un papel central en la compartimentacion de una celula eucariota. Catalizan las reacciones que tienen lugar en cada organulo y transportan selectivamente pequefias moleculas hacla dentro y hacia fuera de su interior o lumen. Tamblen acnian como marcadores especfficos de superficie de los organulos que dirigen el destino de protelnas y de lipidos al organulo apropiado. Una celula de mamffero contiene aproximadamente 10 mil rnlllones (l010) de moleculas doe protefna, de unos 10 000 tipos distintos. La sfrrtesis de la mayorfa de todas estas proteinas ernpieza en el citosol, el espacio cormin que engloba a los organulos. Una vez sintetizada, cada protefna es transportada especfficamente al CODlpartimienta celular que la necesita. Por ello e1 tema central de este capitulo y tambien del siguiente sera el trafico intracelular de proteinas. EI conocimiento de este trafico de protefnas desde un compartimiento a otro permite empezar a comprender e1 desconcertarte laberinto de membranas intracelulares.

La compartimentaci6n de las celulas superiores

En esta secci6n introductoria vamos a dar una vision general de los distintqs comparrimientos de La celulas y de las relaciones que existen entre ellos, Para poder hacerlo, hemos organizado los organulos conceptualmente en un pequeno numero de familias, revisando como las proteinas se dirigen a organulos especfficos y c6mo atraviesan las membranas de los organulos.

Todas las celulas eucariotas tienen la misma colecci6n basica de organulos rodeados de membrana'

Muchos proeesos bioquimicos vitales ocurren en 0 sabre superficies de membrana. As], e1 rnetabolismo lipfdico -esta catalizada mayoritariamente por enzi-

589

cltosnl

retlculo andoplasmatleo .. -s-r-r-e--s-r- con pollrribosomas unidos a su membrana

membrana plesmatlea

mas unidas a membranas y Ia fosforilacion oxidativa y Ia fotosfntesis requieren una membrana semipermeable para acoplar el transporte de H+ con Ia stntesls de ATP. Ademas, los sistemas de membranas intracelulares no s610 proporcionan un area extra de membrana, sino que crean compartimientos que estan separados del citosol, dando a la celula espacios acuosos funcionalmente especializados. Como la bicapa lipidica de los organulos de membrana es impermeable a la mayona de las molecules hidrofflicas, la membrana de cada organulo ha de disponer de protefnas transportadoras que son responsables de la importaci6n 0 exportacion de metabolitos especfficos. Cada membrana de un organulo ha de tener tamblen un mecanisme de importaci6n y de incorporacion al organulo de las protefnas especfficas que hacen que dicho organulo sea unico.

En Ia Figura 12-1 se ilustran los compartimientos mas importantes comunes a todas las celulas eucariotas. El nucleo contiene el genoma principal y es el lugar mas importante de sfntesis de DNA y de RNA. El citoplasma que 10 circunda consiste en el citosol y los organulos citoplasmaticcs suspendidos en 131. El citosol constituye un poco mas de la mitad del volumen total de la celula y es ellugar donde no solo tiene lugar Ia sfntesis de protefnas sino tamblen donde se desarrollan la rnayorfa de las reacciones del metaboHsmo intermediario celular -es decir, el elevado mimero de reacciones mediante las cuales algunas molecules pequefias son degradadas y otras son sintetizadas proporcionando los elementos para la construccion de las macromolecules (se explica en el Capitulo 2).

Aproximadarnente lamitad del area total de membrana de una celula se utiliza para englobar los espacios laberfnticos del reticula endoplasmdtico (ER). EI ER presenta muchos ribosomas unidos a su superficie citoplasmatica, los cuales sintetizan protefnas integrales de membrana y protefnas solubles destinadas a ser segregadas a a ser transportadas a otros organulos, Veremos que existe una diferencia importante entre el sistema a traves del cuallas protefnas son dirigidas al ER 0 a otros organulos citoplasmaticos: mientras que las protemas son translocadas a otros organulos solamente cuando su slntesis ha concluido, son translocadas al ER durante su slntesis, por 10 que los ribosomas sabre los que se estan produciendo estan unidos a la membrana del ER. El ER tambien produce los ltpidos del resto de la celula y tambien acnia como almacen de iones Cat .... El complejo de Golgi consiste en una serie de compartimientos organizados en forma de sacos discoidales llamados cistemas del Golgi; recibe llpidos y protefnas del ER y las distribuye bacia diferentes destinos intracelulares, generalmente modlflcandolas covalentemente durante el via]e.

Las mitocondrias y (en Jas plantas) los cloroplastos, generan Ia mayor parte del ATP que se utiliza para desplazar las reacciones biostntetlcas que requieren un aporte de energfa libre. Los lisosomas presentan enzimas digestivas que de"

590 Capitulo 12 : Compartimientos Intracelulares y clasificaci6n de proteinas

Figura 12-1 Las prlnclpales compartlmientos Intracelulares de una ctHula anbnal. E1 citosol [gris), el reticula endoplasmatico, el complejo de Golgi, el mieleo, las mitocondrias, los endosomas, los llsosomas y los peroxisomas son diferentes compartimientos que se hallan aislados del resto de la celula mediante, al menos, una membrana dotada de penneabilidad selectiva.

Tabla 12-1 Voliimenes relativos ocupados por los prlnclpales compartimientos Iatraeeluleres en una celula hepatica Upica. (hepatoclto)

Compartimiento intracelular

Porcentaje del volumen celular total

NULneroap~ado por eelula"

Citosol

Mito con dria

Vesiculas del ER rugoso Vesiculas del ER lisa y de Golgi Nucleos

Peroxisomas

Lisosomas

Endosomas

54 22 9 6 6 1 1 1

1 1700 1

1 400 300 200

• Se cree que todas las clsternas del renculo endoplasmatlco lisa y rugosa estan conectadas, formando un unieo gran compartimiento. En cada eelula el complejo de Gelgi esta organizado en un ni1mero discrete de grupos de cisternae aplladas (d1ctiosomas) y todaVia no ee ha establecldo

claramente el grado de interconexi6n entre ellos. .

gradan tanto organulos muertos como macromoleculas y partfculas captadas del exterior de Ia celula par endocitosis. En su cantina hacia los lisosomas, las rnacromoleculas y las particulas endocitadas primero han de pasar par una serle de compartimientos Ilamados endosomas. Los peroxisomas (tam bien conocidos como microcuerpos; son pequefios compartimientos vesiculares que contienen enzimas que participan en diversas reacciones oxidativas, En general, cada organulo rodeado por membrana realiza el mismo tlpo de funciones basicas en todos los tipos celulares pero varia en abundancia y puede tener propiedades adicionales que difieren de un tipo celular a otto de acuerdo con las funciones especializadas de las celulas diferenciadas,

En su conjunto, estos organulos ocupan cas! la mltad del volumen celular ITabla 12-1), Y se requiere una gran cantidad de membranes intracelulares para fabricarlos todos. AsI. en las dos celulas de mamIfero que se analizan en la Tabla 12-2,

Tabla 12-2 Cantidades relativas de tipos de membrana en dos celulas eucariotas

Tipo de membrana

Porcentaje de membrana celular total

Hepatocito*

Celula exocrina pancreatlca"

Membrana plasmatlca Membrana del ER rugose Membrana del ER liso Membrana del complejo de Golgi Mitocondrias

Membrana extema Membrana interna Niicleo

Membrana interna

Membrana de Las vesiculas secretoras Membrana de los lisosomas Membrana de los peroxisomas Membrana del endosoma

2 35 16 7

5 60 <1 10

7 32

4 17

0,2

no determinado 0,4

0,4

0,4

0,7 3

no determinado no determinado no detenninado

• Estas dos celulas son de tamafio muy diferente, ya que el hepatoclto tiene conio proriledio un volumen de 5000 !J.l111, en comparacton a los 1000 flm' de In celula exocrtna pancreatica, las areas totaIes de membrana ce.Jular se estiman en 110 000 !J.l112 Y 13000 )lm2, respectivamente.

La compartimentacl6n de las celulas superiores

591

reticula endoplasmatico

el reticulo endoplasmatico tiene una superficie de membrana total que es 25 y 12 veces mayor respectivamente que la membrana plasmatica, En terminos de superficie y de masa, pues, en la mayorfa de la celulas eucariotas la membrana plasmatica es s610 una membrana minoritaria (Figura 12-2).

Los organulos rodeados de membrana no se hallan distribuidos al azar en el citosol; por el contrario, a menudo ocupan posiciones caracterfsticas. Asi, en la mayo ria de celulas el complejo de Golgi esta cerca del nucleo mientras que La red de tubules del ER se extiende a partir del mlcleo pOI todo el citosol. Estas distribuciones caracterfsticas parecen depender de las interacciones de los organulos con el citoesqueleto: par ejemplo, la localizacion del ER y del complejo de Golgi depende de la red de microtubulos, Si se despolimerizan experimentalmente los micronibulos can una droga, el complejo de Golgi se fragmenta y se dispersa por toda la celula y Ia red del ER se colapsa hacia el centro celular, a centrosoma, a partir del cual emerge la red de microtiibulos (vease Capitulo 16).

La relaci6n topol6gica de los organulos rodeados de membrana puede ser interpretada en termlnos de sus origenes evolutivcs-

Para entender la relaci6n que existe entre los cornpartimientos de la celula, resulta util considerar como pueden haber evolucionado, Se cree que los precursores de las primeras celulas eucariotas fueron organismos parecidos a bacterias, los cuales generalmente tienen membrana plasmatic a pero no membranas intemas. En estas celulas, por 10 tanto, la membrana plasrnatica realiza todas las funciones dependientes de membrana, como el bombeo de protones, la sfntesis de ATP, y la sfntesis de lfpidos. No obstante, las celulas eucariotas actuales tie-

592 Capitulo 12: Compartimientos lntracelulares y clasificaci6n de protefnas

Figura 12-2 Elecrronmlcrograffa de una parte de una celula hepatica vista en secci6n transversal. Se indican ejernplos de la mayorfa de los principales compartimientos

in tracelulares, (Por cortesta de Daniel 5. Friend.)

(AI

(81

(CI

Figura 12-3 Organizacl6n de membranas especializadas en las bacterias. (Al Zonas (patches) de la superficie celular, consistentes en protefnas especializadas de membrana. (8) Zonas invaginadas de membrana plasmatica que incrementan la eantidad de membrana disponible para funciones especializadas, como por ejemplo, para fotosmtesis. (C) Internalizaci6n de las zonas invaginadas de membrana; formando vesiculas euya cara interior es topologtcamente equivalente a la cara exterior dela celula, En algunos tipos de bacterias fotoslnteticas se presentan vesiculas de membrana de este tipo; su rslacion topol6gica con la superficie de la celula es similar a la del ER,]a del complejo de Goigi, la de los endosornas y la de los llsosomas en las celulas eucariotas.

nen una dimensi6n lineal entre 10 y 30 veces mayor y un volumen entre 1000 y 10000 veces mayor que una bacteria tfpica como E. coli. 5e puede proponer que la profusion de membranas intemas responde en parte a una adaptaci6n a este incremento en tamafio: las celulas eucariotas tienen una relacion entre superfide y volumen mucho menor, de forma que probablemente el area de su membrana plasrnatlca es demasiado pequefia para contener la gran cantidad de funclones vitales ligadas a membrana que presenta una celula,

Evidentemente, la evolucion de las membranas intemas ha sido paralela ala especiallzaci6n de la funci6n de las membranas, En algunas bacterias actuales existen zonas (patches) espeoializadas de la membrana plasmatica en las que se presentan una coleccion determinada de protefnas de membrana que realizan una serie de funclones relacionadas (Figura 12-3Aj. Estas porciones especializadas de membrana, tales como la "membrana purpura" en Halobacterium que condene bacteriorrodopsina (se discute enel Capitulo 10) a los eromat6foros en las bacterias fotosinteticas (se dis cute en el Capitulo 14), representan organulos primitivas. En algunas bacterias fotosinteticas, estas zonas de membrana se han transformado en zonas mas elaboradas concretandose en invaginaciones de Ia membrana plasmatica (Figura 12-3B), mientras que en otras baeterias parece que estas invaginaciones se han separado completatnente de La membrana plasmatica formando vesiculas cerradas intracelulares rodeadas de membrana, especlalizadas en la fotosfntesis (Figura 12-3CJ.

Puede esperarse que un organulo eucariota que se haya origin ado por el procedimiento que se ilustra en la Figura 12-3 tenga un interior topologicamente equivalente at exterior de la celula, Veremos que este es el caso del ER, del complejo de. Golgi, del endosoma y del Iisosoma -asi como del gran mimero de intermediaries vesiculares de las vias secretora y endocttica (vesiculas de transporte). Podemos per tanto pensar que todos estos organulos son miernbros de la misma familia y que, tal como veremos en detalle en el proximo oapftulo, sus interiores se comunican intensamente entre sl y con e1 exterior de la celula via vesiculas de transporte que emergen por gemaci6n de un organulo y se fusionan con otro (Figura 12·4). En bacterias los ribosomas se hallan unidos a Ia cara citos6liea de La membrana plasmatica pOI 10 que el origen evolutivo de Ia membrana del ER a partir de la membrana plasmatica puedeexpUcar por que en las celulas eucariotas los ribosomas se encuentran unidos a la membrana del ER.

Este esquema evolutivo tambien ofrece una explicaci6n razonable para la arquitectura del micleo, con su doble membrana. En las bacterlas un unico cromosoma esta unido a puntos especiales del interior de la membrana plasmatica. Es par 10 tanto posible que La doble envoltura nuclear se originara como una invagination profunda de la membrana plasmatica, tal como se muestra en Ia Figura 12-SA. Est'e esquema podria expliear par que el compartimiento nuclear es topo16gicamente equivalente al citosol, De heche, en las celulas eucariotas superiores Ia envoltura nuclear se rompe durante la mitosis, permitiendo que el contenido nuclear se disperse porel eitosol, una situaci6n que nunea sueede con I'll contenido de ningt1n OtIO organulo delimitado por membrana. Tal y

lisosoma

'[membrana env. altura intern.~.

nuclear mstnbran

externa

complejo vesicula

de Goigi de secrecclon

La compartfmentacidn de las celulas superiores

Figura 12-4 Belaclones topol6gicas entre los compartimientos de una ct'Hula eucarlota, Los espacios topo16gicamente equlvalsntes se presentan en rojo. Los ciclos de gemacldn yfuslon permiten en principto que cualquler lumen se

com unique con oualquier otro y con el exterior celular, Laflechas azules indican la direcci6n de salida del traflco de vesfculas desde el ER hasta e1 complejo de Golgi y 1a membrana plasmatica (0 los lisosomas) y los puntas negros representan protefnas que son segregadas por la celula, Algunos organulos sin embargo -de forma mas notable las mitocondrias y (en plantas) los cloroplastos- no partidpan en esta comunicaci6n vesicular por lo que estan alslados del traficn entre organulos que se muestra aqu!.

593

(A) VIA EVOLUTIVA PROPUESTA PARA EL NUCLEO Y PARA EL RETlcULO ENDOPLASMATICO

citosol nucleo

DNA ribosomas unidos a membrana

mssosoma

membrana nuclear extern a

CEI I u la _p roca rlota

ancestral membrana

nuclear interna

complejo de poro nuclear

lamina nuclear

18) VIA EVOLUTIVA PROPUESTA PARA LA MITOCONDRIA

celulu procariota

ctllula aucarlota ancestral

como tambien predice el esquema de la Figura 12-5A, el espacio entre las dos membranas nucleares es topol6gicamente equivalente al exterior de la celula y es continuo con ellumen del ER.

Como se discute en el Capftulo 14, las mitocondrias y los cloroplastos difieren de los otros organulos rodeados de membrana en que presentan su propio genoma. La naturaleza de estos genomas y la estrecha similitud existente entre las protefnas de estos organulos y las de algunas bacterias actuales sugiere claramente que las mitocondrias y los cloroplastos evolucionaron a partir de bacterias gue fueron "engullidas" por otras celulas con las que inicialmente vivieron en simbiosis (se explica en los Capftulos 1 y 14). De acuerdo con el esquema hipotetico de la Figura 12-5B, la membrana interna de las mltocondrias y de los cloroplastos co-rresponde a la membrana plasmatica original de las bacterias, mientras que el lumen de estos organulos evolucion6 a partir del citoplasma bacteriano. Como podna esperarse de sus orfgenes, estos organulos permanecen aislados del extenso trafico de vesiculas que eonecta el interior de la mayoria de los crganulos entre sf y con el exterior de la celula,

Este esquema evolutivo agrupa los principales compartlmientos intracelulares de la celulas eucariotas'en cinco grupos: (1) el mlcleo y el citosol, que se comuniean entre sf a traves de los poros nucleates, por 10 que son topologicamente continuos (a pesar de ser funcionalmente diferentes); (2) todos los organulos que acnian en las rutas de secrecion y de endocitosis -incluyendo el ER, el complejo de Golgi, los endosomas, los lisosomas, y numerosas clases de vesiculas de transporte; (3) las mitocondrias: (4) los plastos (5610 en plantas); y (5) los peroxisomas (cuyos origenes evolutivos seran explicados mas adelante).

Las protefnas pueden desplazarse entre compartimientos de diferentes maneras"

Todas las protefnas empiezan a ser sintetizadas en el citosol, excepto las que son sintetizadas en los ribosomas de las mitocondriaS y de los plastos. Su destino siguiente depende de su secuencia de aminoacidos, que puede presentar seiiales de clasificaci6n que dirigen su reparto bacia posiciones fuera del citosoL Muchas protefnas no presentan sefiales de clasificacion y, en conseeuencia, permanecen en el citosol como residentes permanentes, Sin embargo, muchas otras tienen sefiales de clasificacion espedfieas que las dirigen des de el citosol bacia el micleo, el ER, las mitocondrias, los plastos (en plantas), 0 los peroxisomas; las

594 Capitulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasificaci6n de protefnas

Figura 12-5 Hip6tesi,s sobre elorigen evolutlvo de algunos organulos rodeados de membrana. Los ortgenes de las mitocondrias, de los cloroplastos, del ER y del nucleo ce)ular pueden explicar las relaciones topologicas existentes entre estos compartimientos intracelulares en celulas eucariotas, (A) Posible via para la evoluci6n del ER y del nucleo. En algunas bacterias el DNA se halla unido a una invaginaci6n de la membrana plasrnatica Jlamada mesosoma. En eelulas procartotas muy primitivas, una invaginaci6n de este tipo pudo dar lugar a una envoltura alrededor del DNA permitiendo todavia el acceso del DNA al citosol celular (necesaria para pennitir que el DNA pueda dirigir la sfntesis de protefnas), Probablemente esta envoltura se gener6 completamente a partir de la membrana plasmatica, produciendo un compartimlento limitado por una doble membrana. Tal como se ilustra, la envoltura nuclear esta organizada mediante una capa fibrosa denominada lamina nuclear, que esta atravesada por canales de comunicaci6n denominados

complejos de para nucieares. Dado que el nucleo esta rodeado por dos membranae que contimian donde son atravesadas por estos poros, ellumen del micleo es topologicamente equivaJente al eitosol, El lumen del ER es continuo con el espacio que se halla entre las membranas nucleates interna y externa, y es topol6gicamente equivalente con el espaclo extracelular. (B) Se cree que las mitocondrias (y los c!oroplastos) se originaron mediante la incorporaci6n de una bacteria a una celula eucariota. Estas bacterias retuvieron su autonomia. Esta hlpotesls puede expllcar par que eJ lumen de estes organulos permanece aislado del extenso trafico de vesfculas que interconecta ellumen de muchos otros compartimientos lntracelulares,

Figura 12-6 Durante el transporte de las vesiculas se mantiene la "polaridad" de la membrana. N otese que tanto para las protelnas como para los ltptdos la orientacJ6n original del compartlmiento dador se rnantiene en la membrana del compartimiento diana y que los materiales solubles son transfertdos de lumen a lumen.

senales de clasificaci6n tarnbien pueden dirigir el transporte desde el ER hacia otros destinos celulares.

Para entender los principios generales por los que actuan las sefiales de clasificaci6n, es importante dlstinguir tres sistemas fundamentales diferentes mediante los cuales las protefnas se desplazan desde un compartimiento a otro. (l) El trafico de protefnas entre el citosol y el micleo tiene Ingar entre espacios topo16gicamente equivalentes, los cuales estan en continuidad a. traves de los complejos de para nucleares. Este proceso se llama transporte regulado porque el complejo de pora nuclear aetna como puertas selectivas que pueden transportar activamente macromolecules espedficas y ensamblajes macromoleculares, aunque tambien permiten difusi6n libre de molecules pequefias. (2) En el transporte transmernbrana, translocadores proteicos unidos a la membrana dirigen el transporte especifico de protein as a traves de la membrana desde el citosol hacia un espacio que es topol6gicamente dlstinto, Generalmente, La molecula de protefna transportada ha de despLegarse para poder deslizarse a traves de la membrana. Por ejemplo el transporte inicial de determinadas protefnas desde el citosol hacia el.lumen del ER 0 hacia el interior de las mitocondrias tiene lugar de este modo. (3) En el transporte vesicular, las vesiculas de transpotte cargan protelnas desde un compartimiento a otro. A medida que la membrana de un compartimiento va produciendo vesiculas par gemacion, estas vesiculas capturan W1 cargamento de muleculas del lumen del compartimiento. Tras el transporte y Ia fusion can la membrana de otro compartimiento, estas vesiculas descargan su cargamento en el interior de este otro compartimiento. POI ejemplo la transferencia de protemas solubles desde el ER aL complejo de Golgi tiene lugar por este mecanismo. Dado que las protetnas transportadas no atraviesan la membrana, solo se desplazan entre compartimientos que son topologicamente equivalentes (Figura 12-6) .. En e1 Capitulo 13 explicaremos con mas detalLe el transporte vesicular. Los tres sistemas mediante los que se transportan las proteinas entre distintos compartimientos se resumen en la Figura 12-7.

Cada Wl0 de los tres sistemas de transferencia proteica generalmente estan gulados selectivamente par protefnas receptoras complementarias que se hallan

Figura 12-7 "Mapa de carreteras" simplificado del traJieo proteico. Las protemas pueden desplazarse de un compartimiento a otro pormedio de un transporte regulado (en rojo), por medio de transporte transmembrana (azul), 0 por rnedio de transporte vesicular (verde). Las seiiales que dirigen el camino de una protefna determinadaa traves del sistema, determinandn su locallzacion definitrva en la celula, estan contenidas en Ia secuencia de aminoacldos de La proteina. El viaje comienza con la sfntesis de una protefna sobra lU1 ribosoma ytermina cuando se ha alcanzado el destino final. En cada una de las estaciones intermedias (reGuadros) se toma una decision respecto a si la proteina sera retenida en el compartimiento 0 bien contlnuara el viaje. En principio, se requlere una serial determinada tanto para retener la protefna en el compartimiento como para no retenerla. EI destino alternative es la ruta pot deJecto (en ausencia de serial). Por ejemplo, el transporte vesicular de protefnas desde el ER, a traves del complejo de Goigi, hasta la superficie celular, parece que no.necesita nlnguna senal especifica; las sefiales de retenclon'especfficas se requieren por consiguiente para retener las protem as en el ER y en el complejo de Golgi, cuyas protetnas especializadas residen alli.

Utilizaremos repetidamente esta figura como guia a traves de este capitulo y del siguiente, destacando la ruta particular que sera explicada,

La eompartimentaci6n de las celulas superiores

brcapa lipfdica

COMPARTIMIENTO OADOR

____ vesicula que se

• -- produce par gemacion, CUYO contenido va a ser transportado

vesfcula de trans porte en el eitoplasma

FUSI6N l

CLAVE: _ ~ transports

_ ~ transports transmembrana .. ~ transports vesicular

595

PROTEfNA DESPLEGADA

PROTEfNA PlEGADA

..............,

:3..77ii@&ij?~wM tr~~COOH....,___

p~ptido serial

lA)

zona --serial N

OOH

I

, I

en el organulo de destino. Por ejemplo, SI rum proteina grande ha de ser importada hacia el nucleo, ha de tener una senal de clasificacion que sea reconocida par protefnas receptoras asociadas con et complejo de para nuclear. Si una protefna ha de ser 'transferida directamente a traves de una membrana, ha de tener una sefial de clasificacion que sea reconocida par eI translocador de la membrana que tiene que atravesar, Del mismo modo, si una protetna ha de ser Incorporada en cierto tipo de vesiculas de transporte 0 retentda en ciertos organulos, sus senales de clasificaci6n han de ser reconocidas por un receptor ccmplementario de la membrana apropiada.

Los peptidos serial y Ia region sefiaI determinan el destino celular correcto de las protefnas"

Bxisten al menos dos tipos de sefiales de clasificacion enlas protetnas, Uno de ellos reside en una region continua de la secuencia de aminoacidos, tipicamente de 15~60 reslduos de largo. Este peptfdosenal es a menudo (pero no siernpre) eliminado de la proteina por una peptidasa de sefial especializada, una vez se ha ejecutado la decision de clasificacion, El otto tipo de senal conslste en una disposicion tridimensional caracterfstica de: los atomos de la superficie de la protema, que se forma cuando se pliega la proteina. Los restos de aminoacidos que constituyen Ia regi6n seiial pueden ser bastante distantes el uno del otto en la secuencia lineal de aminoacidos, y generalmente permanecen en la proteina madura (Figura 12~8). Los peptidos sefial son utilizados para dirigir las protetnas desde el citosol a! ER, a las mitocondrias, a los cloroplastos, a los peroxisomas y al micleo y tam bien son utilizados para retener las proteinas en el ER. Las regiones sefial identifican ciertas enzimas que han de ser marcadas con residues de azucar especificos que luego dirigen a las protefnas desde el complejo de Golgi a los lisosomas: las regiones sefial tambien se utilizan en otros pasos de clasificaci6n que estan menos caracterizados.

Para especificar los diferentes destinos celulares se utilizan diferentes tipos de peptidos serial. En general, las protefnas que estan destinadas a ser transferidas al ER tienen, en su extrema amino terminal, peptidos senal que en la parte central de su secuencia presentan entre 5 y 10 residues de aminoaeidos hidrofobicos, Lamayoria de estas proteinas pasaran despues desde el ER al complejo de Golgi;. no obstante, las protein as que presentan en su extrema carboxilo terminal una secuencia determinada de cuatro aminoacidos son retenidas permanentsmente en el ER. Las proteinas destinadas a las mitocondrias tienen peptidos se· rial en los que se alteman restos de aminoacldos cargados positivamente con restos de aminoacidos hidrof6bicos. Las proteinas destinadas a los peroxisomas tienen habitualmente una secuencia de tres aminoacidos en su extremo carboxi- 10. Muohas protefnas destinadas a1 mrcleo tienen peptidos sefial formados par una agrupacion de residuos de arninoacidos cargados positivamente, la cual se

596 Capitulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasifica.ci6n de protefnas

Figura 12·8 Los dos sistemas mediante los que se puede cedfflcar una.sefial de transporte en una protefua. (A) La senal se halla en una secuencia sencilla y discreta de aminoacidos, llamada peptido senal, que se halla expuesta en la protefna pJegada. Amenudo los peptidos serial se presentan en uno de los extremos de la cadena polipept!dica (tal como se presenta en la figural, pero tambien se pueden localizar en cualquier otro lugar de la protefna. (B) Se puede formar una region seiial mediante ill yuxtaposici6n de amtnoactdos proeedenteaderegtones que se hallaban fisicamente separadas antes de que la protetna se plegara (como se muestra en la figural; alternativamente, 1a sefial puede estar formada por zonas separadas de la superficie de la proteina plegada que se hallan separadas entre sf par disranciasfljas, En cualquier caso, la senal de transporte depende de [a conformaci6n tridimensional de la protefna. Par esta razon, este tipo de serial resulta diffcil el loealizar de. forma precisa.

Tabla I 2-3 Algunas secuencias tfpicas de pepddos sefial

Funcl6n del peptido sefial

Ejemplo de peptldo sefial

Importaci6n al ER

+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-leu-Leu-Leu-Val Gly-Ile- Leu - Phe- Trp-Ala - Thr-Glu -Ala -GIuGln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln-

- Lys-Asp-Glu- Leu-COOtH3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-PhePhe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-

Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-

- Pro- Pro- Lys- Lys- Lys-Arg - Lys - Val-

-Ser-Lys-Leu-

tH3N-Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Lys-Pro-Lys-

Retenci6n en ellumen del ER Importaci6n ala mitocondria

Importacion al nucleo Importaci6n alos peroxisomas Uni6n a membrana a traves de

la union covalente del extreme amino terminal al acido rnlrfstico

Los residues de aminoacidos cargados positlvamente S8 muestran en rojo y 10$ cargados negativamante en verde. En el recuadro amarillo se indica LIn gran bloqua de arninoacidos hidrofoblcos. H3N+ indica el extrema amino terminal de la proteins y COO- el carboxilo terminal.

encuentra habitualmente en lugares internos de la cadena polipeptfdica. En la Tabla 12-3 se muestran algunos peptidos senal tfpicos.

La importancia de cada uno de estos peptidos serial en eldestino de las protefnas se ha vis to en experlmentos en los que el peptide ha side transferido desde una proteina a otra mediante teentcas de ingenierla genetica: por ejemplo, colocando el peptide serial amino terminal que especifica para el ER, al principio de una protefna citosolica, se consigue que ahora la protefna se dirija al ER. Todos los peptidos senal que se hallan unidos a protetnas que tienen el mismo destino son funcionalmente intercambiables aunque sus secuencias de aminoactdos puedan variar mucho. A menudo, parece que para los procesos de reconocimiento, las propiedades ffsicas de estos peptidos senal, tales como 1a hidrofobicidad, son mas importantes que la secuencia exacta de aminoacidos,

Las regiones sefialson mucho mas diffciles de analizar que los peptidos sefial: en consecuencia, se conoce mucho menos sobre su estructura. Debido a que resultan de un patron complejo de plegamiento proteico tridimensional, no pueden simplemente transferirse de una protefna a otra.

En el Panel 12-1 (pag, 598) se ilustran los principaies rnetodos para estudiar c6mo se dirigen las protefnas desde el citosol a un compartimiento especffico y como se translocan a traves de las membranas.

Las celulas no pueden construir de novo sus organulos rode ados de membrana: necesitan informaci6n del propio organulo"

Cuando una celula se reproduce y se divide, tiene que duplicar sus organulos rodeados de membrana. Normalmente las celulas realizan esta duplicacion agrandando los organulos mediante la incorporad6n en ellos de nuevas moleculas, y la posterior divisi6n de estos organulos agrandados. Posteriormente, los organulos hijos son distributdos entre las dos celulas hijas, Esta herencia es esencial ya que una celula no puede fabricar de novo estas membranas. Por ejemplo, si se elimina completamente el ER de la celula, icomo puede reconstruirlo la celulai Las protemas de membrana que definen el ER y realizan muchas de su funciones clave son productos del propio ER. No se puede fabricar un nuevo ER sin la existencia previa de un ER, 0 al menos de una membrana que contenga los translocadores necesarios para Importar protelnas especfficas hacia el ER (y que carezca de los translocadores de otros organulos, necesarios para importar protefnas).

Asf, parece que la informacion necesaria para construir un organulo rodeado de membrana no reside s610 en el DNA que especifica las proteinas del organulo,

La compartlmentactdn delas celulas superiores

597

Aproximaci6n por transfecclon para definir secuencias sefial

Un sistema de mostrar que una secuencia senal €IS necesaria y suficiente para dirigir una protelna hacla

un compartimiento intracelular deteminado consiste en crear una proteina de fusion en la que la secuencia serial se halle unida, mediante tecntcas de ingenieria genetica, a una proteina que normalmente es residente an €II citosol. Dsspues de transfectuar cslutas con el cDNA que codifica esta protetna. sa determina la localizaci6n de la protelna de fusion mediante inmunomarcaje 0 por fraccionamiento celular.

secuencla senal a 0 b gen que codifica una protein a citos61ica

\ <

A

plasm i d 0 uti I izado pa ra tra nsteeta r ee I u I a s

/ "-

-~-~-

la secuencla seflal a (. ) dirige la proteina de fusion al organulo A

Is secueneia seflal b ( ) dirig.e la proteina de fusion al organulo B

Alterando la secuencia senal utlllzando mutagenesis dirigida puede determ inarse -que caracteristicas estructurales son importantes para su funci6n.

Aproximacion genetica para el estudio del mecanismo de translocaci6n de protelnes

enzlrna an el citosol:

- la celula viva sin necesltar hlstidlna como nutriente

aparato de translccaclon

.' : ~ .' .- ~ . .' .'.) ;' .~ ~~ . : :~

la enzima se ha dirigido - al ER: la celula rnuere al colocarla en un rnedlo sin histidlna

no toda 18 enzima sa

halta en el ER: 10 celulll vive aunque se coloque en ausencia de histidina

Aproximaci6n bioquimica para estudiar el mecanisme de transtocacion de la protein a

En este caso, una protelna marcada que contisne una secuencia senal especifica es transportada in vitro al interior de organulos aislados. Generalmente la protelna marcada es producida por traducclon en un sistema libre de celulas de un mRN.A que codifies la protelna: se utlllzan arnfnoacldos radiactivos para marcar la proteina acabada de sintetizar de forma que puada distinguirse de las muchas otrss proretnas que se hallan presentes en €II sistema de traducci6n in vitro.

Habitualmente se utilizan tres metodos para determinar si Ia proteina marcada se he translocado al organulo:

-..,....., ..... .,.." ..... "'"

'1.~-1lprqtef waf-ell a

C;:~f!lsciol)'l 't()l1~ior9~rfU.l~ e un f; trr{ugaci6N . secuimcia~seflal

V

proteina marcada

con radiactividad

lncubaelon sin el organulo

I '","""" 00&;'"'"

&

proteinas radlactivas en gel SDS

•• It ... proleasa ". , ..

. ®.;., ~1II'i"~

1 .. '~,1,

• • , ... i. It

• • protein~ ~

... " .

Para astudiar la translocaci6n de protefnas habitualmente se utilizan celulas de levadura con mutaciones en genes que codifican componentesde la maquinaria de translocacion. Debido a que las celulas mutantes que no pueden translocar protefnas a traves de sus membranes morlran, el truco consiste en disenar una estrategia que permita aislar las mutaciones que unlcarnente causan un defecto parcial en la translocaclon de proteinas.

Una via consiste en utilizer la ingeniaria ganetica para dlsanar celulas especiales de levadura. Por eJemplo, la enzlrna histidinol deshidrogenasa reside normal mente en €II citosol, donda es necesaria para producir el aminoacido esencial histidina a partir de su precursor histidinol. Se construye una cepa de levadura en la qua €II gen de la histidinol reductasa esta substituido por un gen construido de forma que codifique una proteina de fusion con una secuencia senal extra que dirige la proteina al interior del reticulo endoplasmatico (ER). Cuando estas celulas se hacen crecer en ausencia de histidina, mueren debido a que toda la histidinol deshidrogenasa esta secuestrada en €II ER, donde no es funcional. Sin embargo, las celulas con mutaciones que inactivan pardalmente €II mecanisme de translocacien de protefnas desde el citosol al ER sobrevivlrart debido a que habra suficiente cantidad de deshidroganasa. retenida en e.1 citosol para producir la histidina necesaria. A menudo se obtienen cslulas en las que la proteina mutante todavia actus parcialmente a temperatura normal pero que €IS completamente inactiva a tsmperaturas elevadas. Una celula que transporte una de estas mutaciones sensibles a la temperatura muere a temperaturas'elevadas, tenga 0 no histidina, ya que no puede transportar ninguna protelna al ER. Ello permits identificar el gen normal que fue modificado por la mutaci6n, mediante la transfecclon de la celula mutante con un vector plasmfdico de levadura en el que.se han clonado fragmentos al alar de DNA gen6mico: el fragmento especifico de DNA que recupera la celula mutante cuando se hace crecer a una temperatura elevada sera el que codifica la version salvaje dst gen mutanta.

Tamblen se requiere la informacion epigenetica en forma de al menos una proteina caracteristica en la membrana del organulo, y esta informacion es transmitida desde la celula padre a las de la pro genie en forma del propio organulo. Probablemente esta informacion es esencial para la propagaci6n de la organizacion celular en compartimlentos, al igual que la informacion en DNA es esencial para la propagaci6n de las secuencias de nuc1e6tidos y de aminoacidos,

Resumen

Las Cf!lulas eucariotas contienen memaranas ihtracelulares que encierran casi la mitad de su uolumen total en eompartimientos intracelulares individtulliuulos llamados orglinulos. En todas las eilulaseU(:(lriotas los prtncipaies tipos de orgdnulos rodeadbs de membra.na son el reticula endoplasJ'lUftico, el complejo de Golgi, el1lUcleo, las mttooondrias, los lisosomas, los endosomas y los peroxisomasj las celulas oogetales contienen; ademds, pinstos, como por ejemplo los cloroplastos. Cada orgtinulo contiene prote£nas caracterl.sticas que desarrollan sus fundones caracterlsticas.

Cuando la protelna de un orgdnulo acaba de ser sintetiztu:lo., encuentra el camino espedflco que ha de seguir desck el ribosoma dond» ha sido Sitltetizada hasta el orglinulo donde actuarti, guiada por una seiial especfjica que se ha.lla presente en su secuencia de aminodcidos y que actria como un peptido sefial a como una regiOn selia I. Los peptidos;y las reg/ones senal son reconocidos par protetnas receptoras complementarios presentes en los orgdnulos de destino. Las protelnas que actrian en el cuosol no presentan peptidos 0 regiones selial y por 10 tanto permanecen en el eitosol. despues de ser sintetizados.

EI transporte de molecules hacia dentro y hacia fuera del micleo"

La envoltura nuclear encierra el DNA y define el compartimiento nuclear. Esta formada par dos membranae concentricas que, tal como hemos visto, son conttnuas con el reticulo endoplasmatico. A pesar de que la membrana nuclear interna y la extema son continuas, las dos membranas presentan distinta cornposici6n proteica. La membrana nuclear interna contiene proteinas especificas que acnian como lugares de uni6n de la lamina nuclear que la soporta. Esta membrana esta rode ada por la membrana nuclear externa, la cual se parece enormemente a la membrana del retfculo endoplasmatico, que forma un continuo con ella (Figura 12-9). Como la membrana del ER rugoso, esta membrana externa esta generalmente tapizada par ribosomas que se hallan trabajando en la sintesis de protefnas, Las proteinas fabricadas en estos ribosomas son transportadas al espacio entre las membranas intema y enema (el espacio perinuclear), el cual a su vez es continuo con la luz del ER (vease Figura 12-9).

Existe un traflco bidireccional continuo entre el citosol y el nucleo. La gran cantidad de protefnas que actt1an en el ruicleo -tncluyendo las histonas, las DNA y RNA polimerasas, las proteinas reguladoras de genes y las protefnas de procesamiento del RNA- son Importadas de forma selectiva desde el citosol hacia el compartimiento nuclear, donde son fabricadas. AI mismo tiempo, los tRNA y mRNA son sintetizados en el compartimiento nuclear y luego son exportados al citosol. AI· igual que el proceso de importacidn, el proceso de exportaci6n es selectivo; por ejernplo, los mRNA s610 son exportados si han sldo modificados correctamente en el nucleo por reacciones de procesamiento de RNA. En algunos casos el proceso de transporte es complejo: par ejemplo, las proteinas ribos6micas son fabricadas en el oitosol, importadas al micleo -donde se ensamblan con RNA ribos6micos recien fabricados, formando partfeulasy luego son exportadas de nuevo al citosol como parte de la subunidad ribos6- mica, cada uno de estos pasos implica transpotte selectivo a traves de la envoltura nuclear.

El transporte de molecules hacia dentro y hacia fuera del nncleo

599

~~~~~~;ra [membrana

~ nuclear

interne

membrana nuclear externa

membrana. del ER

pore nuclear

lamina nuclear

espaclo perinuclear

Los poros nucleares atraviesan la envoltura nuclear'

En todas las celulas eucariotas, desde las Ievaduras basta las human as, la envol-

, tura nuclear esta perforada por los paras nucleares. Cada poro esta constituido pOI en una gran estructura discoidal conocida como el complejo del poro nuclear, que se ha estimado que tiene un peso molecular de alrededor de 125 millones de daltons y se cree que esta compuesto por mas de 100 protelnas diferentes, ordenadas segun una sorprendente simetria ortogonal (Figuras 12-10 y 12-11).

Cada complejo de poro presenta uno 0 mas canales acuosos abiertos, a traves de los cuales pueden difundir pasivarnente las moleculas solubles en agua que son mas pequefias de un determinado tamano. EI tamano efectivo de estos canales ha side determinado inyectando moleculas rnarcadas (que no son cornponentes nucleares) en el citosol y midiendo luego la veIocidad de diiusi6n hacia e1 nucleo, Las molecules pequefias (5000 daltons 0 menos) difunden tan rapidamente que puede considerarse que Ia envoltura nuclear es Iibremente, permeable a ellas, Una protefna de 17 000 daltons tarda 2 minutes en equilibrarse entre el citoplasma y el nucleo: una protefna de 44 000 da1tons tarda 30 minutes. Una protema globular mayor de 60 000 daItons parece que es completarnente incapaz de entrar en el micleo. Un analisis cuantitativo de estes datos sugiere que el paranuclear tiene un canal cilindrico Ilene de agua de aproximadamente .9 nm

fibrilla

membrana nuclear

subunl luminal ~.,..."""".

envoltura nuclear

__ !!.J

columnar

,lamina nuclear

[au la nuclear

subunldad del anlllo

intema

(A) 50 nm

600 Capitulo 12 : Compartlmientos intracelulares y claslflcaclon de protefnas

--

Flgur~ 12-9 La envoltura nuclear. La envoltura nuclear de doble membrana esta atravesada par paras nucleates y es continua eon el reticula endoplasmatico. No se muestran los ribosomas que se hallan unidos enla cara citosollca de la membrana del ER yen la membrana externa del nucleo,

Figura 12-10 Dlsposlcldn de los complajos de para nucleares en 18 envoltura nuclear. (A) Bsbozo que muestra una pequefia region de la envoltura nuclear. En una secci6n transversal el complejo deporo nuclear aparece campuesto de tres partes: (1) un componente columnar que formael grueso de la pared del para; (2) uncompanente anular, que extiende ., radios" hacia el centro del para; y (3) un componente luminal, que esta forrnado por una gran glucoprotefna transmembrane que se cree que partidpa en el ancla]e del complejo a la membrana nuclear. Ademas, existen' fibrillas que sobresalen desde la cara crtosnllca 0 desde la cara nuclear del complejo, En la parte nuclear las fibrillas convergsn forman do estructuras en forma. de jaula, las cuales se muestran en una fotograffa de microscopia electrcnica de la cara nuclear de Ia envolrura nuclear de un oocito (B), (B, de M.W. Goldberg y T .0, Allen. J. Cell Bioi, 119:1429-1440,199.2, conpermiso de copyright de The Rockefeller University Press.j

IB)

(AI

de diametro y 15 run de largo; este canal puede ocupar s610 una pequeiia fracci6n del volumen total del pora (Figura 12-12).

Dado que muchas prateinas celulares son demasiado grandes para pasar par difusi6n a traves de los poros nucleares, la envoltura nuclear permite que el compartimiento nuclear y el citosol mantengan diferentes conjuntos de proteinas. Par ejemplo, los ribosomas citoplasmaticos maduros tienen un diametro de 30 run, par 10 que no pueden difundlr a traves de los canales de 9 run; su exclusi6n del nucleo asegura que toda Ja sfntesis proteica estara Iimitada en eJ citosol. Pero, lc6mo Importa el micleo las grandes molecules que necesita, como las DNA y RNA polimerasas cuyas subunldades tienen pesos moleculares de entre 100 000 Y 200 000 daltons? Como explicaremos mas adelante, estas y muchas otras molecules de protefna y de RNA se unen a proteinas receptoras localizadas en los complejos de para y luego son transportadas activamente a rraves de la envoltura nuclear mediante los complejos de poro.

Unas setiales de localizaci6n nuclear dirigen las proteinas nucleares hacia el micleo"

En general, cuanto mas activa sea la transcripcion nuclear, mayor sera el mimeIO de complejos de POIO presentes en la envoltura nuclear. La envoltura nuclear

CITOSOL

•

SO nm

tamano de las protelnas que entre n en ,el nucleo per difuslon libre

tarnafio de las protelnas que entran en 81 nucleo mediante transports activo

El transports de molecules hacia dentro y bacia fuera del nucleo

Figura 12- J 1 Electrunmlcrograffa y reconstruccldn Informatica de complejos de poro nuclear. (A) y (13): diferentes perspectivas de complejos de poros nucleates liberados de la envoltura con detergents y contrastados por tinclon negativa. En (B) algunos cornplejos de poro pueden verse de lado. (C) Reoonstrucclones tridlmenslonales mediante ordenador que muestran vistas desde arriba, inelinada y de lado de complejos de poro. (De J.E. HinshawyR. Milligan, Cell 69:1133-1141. 1992. © Cell Press.)

Figura. 12-12 Posibles vias de difusion libre a traves del complejo de poro nuclear. El dibu]o muestra un hipotetico diafragma insertado en el interior del pore para restringir el tamano del poro del canal abiertn a

9 nm, que es el tamano de poro estimado a partir de medldas de dlfusi6n. Nueve nancmetros es un diametro menor que la abertura central observada en las Imagenes de

los complejos de poro nuclear '

obtenidas a partir de electronrnicrografias (0 a partir de medidas durante el transporte activo euando se dilata el poro para permltir el transporte de partfculas de hasta

26 nmde dlametro). Por 10 tanto es probable que algunos componentes del para se pierdan durante la preparacion de las rnuestras para microscopia electr6nica y que estos sean los que en condiciones norrnales Iimiren Ia libre difusion a traves de la abertura central. Estos componentes pueden torrnar un diafragma (0 un tapdn) que se abra 0 se cierre permitiendo el paso de grandes objetos durante e1 transporte activo, que esta mediado por una senal de claslflcacion (se expJica mas adelante). A pesar de que en algunas preparaciones pueden obssrvarse unos tapones, no esta claro si son componentes del complejo de para a material que esta siendo transportado a traves suyo. Las reconstrucciones mdlmenstonales par ordenador sugieren que los canales que permiten la libre difusi6n podrtan no estar locallzados en el centro del complejo de poro pero sf cerca del borde entre los componentes columnares (vease Figura 12-10A}i esto podrta significar que Ia difusion pasiva yel transporte activo tienen lugar a traves de diferentes partes del complejo de para.

601

(A) LOCALIZACION DEL ANrlGENO r QUE PRESENTA LA SEi\JAl DE IMPORTACION NUCLEAR DEL nro SALVAJE

(B) LOCALIZACION DEL ANTIGENO r QUE PRESENTA UNA SENAL DE IMPORTACION NUCLEAR MUTADA

de una celula tfpica de rnamifero contiene entre 3000 y 4000 complejos de poro. Si Ia celula estasintetizando DNA, necesita importer aproximadamente 106 moIeculas de histona desde el citoplasrna cada 3 minutos para poder empaquetar el DNA recien sintetizado en forma de cromatina, 10 cual significa que, par termino media, cada poro ha de transportaralrededor de 100 moleculas de histona par minute. Si la celula esta creciendo rapidamente, cada para tambien ha de transportar par termino media 6 subunidades ribosomicas maya res y menores recien ensambladas por minuto, desde el micleo, donde son producidas, hasta el citosol, donde son utilizadas, Y esto es s610 una muy pequefia parte del trafico total que pasa a traves de los pores nucleares.

Cuando las proteinas del nucleo son extrafdas experimentalmente y microinyectadas de nuevo en el citosol, incluso las mas grandes se vuelven a aeumular en el mlcIeo de una forma eficiente. La se1ectividad de esta importad6n nuclear reside en las sefiales de localizaci6n nuclear, que 5610 estan presentes en las proteinas nucleates. Estas sefiales se han definido con precision en muchas proteinas nucleares utilizando la tecnologta del DNA recornbinante, Pueden estar situadas en cualquier Iugar de la secuencia de amino add os y generalmente consisten en una secuencia corta (tfpicamente de entre cuatro y ocho aminoacidosl, que es diferente en diferentes protefnas nucleates pero que es rica en los aminoacidos cargados positivamente lisina y arginina, y generalmente presenta prolina, En muchas proteinas nucleares esta secuencia esta partida en dos bloques de dos a cuatro aminoacidos cada uno, con los bloques separados uno del otro por aproximadamente diez aminoacidos, Se cree que las sefiales forman bucles en la superficie de las protefnas,

Las sefiales de localizacion nuclear fueron identificadas en primer lugar en la protetna codlficada par el virus SV40 Ilamada antfgeno T, la cual es necesaria para la replicacion del DNA vfrico en el micleo de la celula huesped, Normalmente el antfgeno T se acumula en e1 nucleo poco tiempo despues de ser sintetizado en el citosoL No obstante, una rnutacion en un unico aminoacido imp ide el transporte a1 micleo (Figura 12-13). Asumiendo que esta rnutaclon se localiza en una secuencia senal de importad6n al micleo, se fusionaron cortas secuencias de DNA que codifican esta regi6n del anttgeno T normal, con un gen que codifica una proteina citos6lica. Se detenninaron las secuencias mas cortas que hacfan que la protetna de "fusion" result ante fuera importada al rnicleo, y asf se pudo demostrar que la senal de importaci6n nuclear del antigena T era una secuencia de ocho amtnoacidos contiguos localizados en una region intema de la cadena polipeptfdica (vease Figura 12-13). Experimentos posteriores demostraron que la secuencia senal tambien puede ser funcienal si es sintetizada como un pequefio peptide y unida 'qutmicamente a una lisinaseleccionada al azar de una protema, la cual, en caso de no reciblr este peptide, permanecerfa en el citoplasma, 10 cual sugiere que la localizaci6n precisa en la proteina de Ia serial de importacion al micleo, no es importante. De heche, muchas protefnas nucleares presentan mas de una sefial de localizacion nuclear.

602 Capitulo 12: Compartlmtentos intracelulares y clasificaci6n de proteinas

Figura 12,13 Lafunci6n de la serial de localizaci6n nuclear. Fotograffas de lnmurrofluorescencia que rnuestran la locaHzaci6n celular delantlgeno T del 8\140 contenlendo 0 no unpeptldo corte que actua como serial de loealizacinn nulear, La forma salvaje de la proteina del antfgeno T contiene Ja secuencia rica en Iisina que se indica y que es importada a su lugar de accirin en el nucleo, como se demuestramedtante una ttnctdn lnmunojluorescente con un anticuerpo contra el antfgeno T (A). SI el antigeno Tpresenta una sefial de localiiaci6n nuclear alterada (una treonina que reemplaza a una lisina) permanece en el citosol (8). (De D. Kalderon, B. Roberts, W. Richardson

y A. Smlth, Cell 39:499·509, 1984

© t~1l Press.)

oro coloidal

proteolisis limitada

•

_L_

I ·

cola *

cabaza

nucleoplasrnina

cabezas

colas

CAPTACION EN LOS NUCLEOS

NO CAPTACION

CAPTACION EN LOS NUCLEOS A TRAVES DE LOS POROS NUCLEARES

Las macromolecules son transportadas activamente hacia dentro y hacia fuera del mieleo a traves de los poros nucleares"

EI transporte activo de protefnas nucleares a traves de los poros nucleares puede ser visualizado directamente recubriendo particulas de oro can una protefna nuclear, inyectando estas particulas en el eitosol, y sigulendo su destino par electronmicroscopia (Figuras 12-14 y 12-15).

La interaecion iniclal de una protefua nuclear con el complejo de poro nuclear requiere una 0 mas proteinas citos6licas que se unen a las sefiales de locaIizacion nuclear y colaboran dirigiendo a la protefna nuclear hacia el complejo de para, donde parece que se une a las fibrillas que se proyectan a partir del ani- 110 del complejo. Entonces, la protefna nuclear se despJaza bacia el centro del complejo de poro, donde es aetivamente transportada a traves de la envoltura nuclear mediante un proceso que requiere la hidrolisis de ATP (Figura 12-16).

Figura 12-15 Visualizacl6n del proceso de importaci6n especffica de una protefna a traves de los pores nucleares, Blectronmrcrografta que muestra las esferas de oro coloidal revistiendo nucleoplasmina (vease Figura 12-14) entrando en el nucleo a traves de los poros nucleares (mdicados mediante corchetes rojos). Cuando las esferas de oro coloidal se recubren con.la region de la cola de moleculas de nucleoplasrnina se 0 btienen resultados simllares a estos. Estas particulas de oro tienen un diametro mayor que el canal de difusi6n del complejo de para, 10 cual impliea que, para permitir su paso, se ha inducido a abrirse un poro. Dado que las partfculas de oro se alinean en el cltosol antes de entrar en contacto y de entrar en el complejo de pow, se ha sugerido que las fibrillas que se extienden hacia el cltosol a partir del complejo de para (vease Figura 12-10Al gufan alas parnculas hacia su destino. (De C. Feldherr, E. Kallenbach y N. Schultz, f. Cell Bioi. 99:2216- 2222, 1984, con perrniso de copyright de The Rockefeller University Press.)

EI transporte de moleculas hacia dentro y hacia fuera del nucleo

Figura 12-14 Captaci6n de protemas nucleares a. traves de los complejos de para nucleares. La nucleoplasm ina. es una gran protefna pentamerica del micleo, que presents dominies diferentes en Ia cabeza y en la cola. Las cabezas pueden ser separadas de las colas mediante fragmentacion

pro teo lltica limitada. Cuando se inyectan rnoleculas intactas de nucleoplasmina en el citoplasma de un oocito de rana, se acumulan .rapklamente en el micleo a pesar de que al parecer son demasiado voluminosas como para poder difundir pasivamente a travss del complejo de poro nuclear. La senai necesaria para esta Importaclon nuclear reside en el dominie de la cola, ya que el nucleo capta rapidamente las colas de la protefna pew no las cabezas. EI papel de los poros nucleates en esta importacidn dirlgida por sefial se puede demostrar mediante electronmicroscopia utilizando colas de nucleoplasmina acopladas a esferas de oro coloidal, que son facilmente visuallzables debido a su elevada electrodensidad. - La union de las colas de nucleoplasmina dirigen la entrada de las parnculas de ora a traves de los poros nucleares (vease Figura 12-15).

603

protetna fsctores nuclear citos61icos

..

PASO 2

NUCLEO

I PASO 1 I UNI6N: NOSE REQUIERE ATP

TRANSPORTE:

SE REQUIERE ATP

Estudios reallzados con varios tamanos de partfculas de oro indican que durante el proceso de transporte la abertura se puede dilatar hasta alcanzar 26 run de diametro: parece que una estructura muy poco definida en el centro del complejo de poro aetna igual que un diafragma de apertura controlada (close-fitting), abriendose 10 necesario cuando es activado por una serial de una protetna de grandes dimensiones (vease Figura 12-12). La base molecular de este mecanisrna y el mecanismo a traves del que actua bornbeando macromoleculas hacia dentro ybacia fuera del nucleo todavia constituye un misterio,

Parece probable que la exportaci6n de nuevas subunidades ribosomales y de RNA mensajero a traves de los poros nucleares dependa de un sistema de transporte selectivo. Si se utilizan esferas de oro de 20 nm de diametro similares a las utilizadas en la Figura 12-15, se recubren con pequefias moleculas de RNA (tRNA 0 RNA 5S) de forma similar a como se realize en los experimentos de nucleop1asmina, y luego se inyectan en el mlcleo de un oocito de ran a, son rapidamente transportadas a traves de los poros hacia el citoplasma. Si, por otro lado, estas partteulas son inyectadas en el citoplasma del oocito, no son transportadas hacia e1 nucleo sino que permanecen en el citopJasma. Parece que, adernas de contener receptores que reconocen las senales de importaci6n nuclear, el para contiene uno 0 mas receptores que reconocen moleculas de RNA (0 las proteinas unidas a ellas) destinadas al citosoL Utilizando diferentes tamafios de partfculas de oro, unas cubiertas por RNA e inyectadas en el nucleo y otras recubiertas can sefiales proteicas de importacion nuclear, se puede observar que un mismo complejo de poro permlte e1 trafico en ambas direcciones,

El mecanisme de trans porte macromolecular a traves de Jos poros nucleates es fundamentalmente distinto a los mecanismos de transporte Implicados en la transferencia de protefnas a traves de las membranes de otros organulos, La principal diferencia radicaen el hecho que el transporte nuclear no tiene lugar a traves de un transportador proteico que atraviesa una 0 mas bicapacas lipfdicas sino a traves de un gran poro acuoso regulado. Parece que las protefnas nucleares son transportadas a traves de los poros, manteniendo dichas protefnas su conformacidn completamente plegada, como ocurre con una subunidad ribosomal que es transportada como una partfcula ensamblada; por el contrario, para ser transportadas a otros organulos, las protefnas tienen que desplegarse durante su transporte, como explicarernos mas adelante.

La envoltura nuclear se desorganiza durante la mitosis"

La lamina nuclear es una red de subunidades proteicas interconectadas denominadas lamininas nucleares. Son un tipo especial de filamentos intennedios (explicado en el Capitulo 16) que polimerizan formando una red bidimensional (Figura 12-17). Se cree que Ja lamina nuclear da forma y estabilidad la envoltura nuclear, ala cual se halla anclada por la union de los poros nucleares y La membrana nuclear lnterna. Tambien se cree que la cromatina interacciona directamente con la lamina nuclear, por Lo que Ia lamina proporciona un uni6n estructural entre el DNA y la envoltura nuclear.

60.4 Capitulo 12 : Compartimientos Intracelulares y clasificaci6n de protefnas

Figura 12-16 Representacl6n altamente esquematica del mecanismo de transporte activo a traves de los poros nucleares. Las protetnas y las estructuras implicadas en el praceso de transporte activo no son conocidas. Sin embargo, sabemos que para la uni6n inicial de Jas protefnas nucleares al complejo se necesitan una colecci6n diversa de protemas citos6licas relacionadas. Estas prateinas, llamadas nucleoporinas, contienen un azucar simple (la N-acetiJglucosamina) que ayuda a su ldentiflcacton mediante el usa de lectinas y de anticuerpos especfficos. No se muestran las Eibrillas que se proyectan a partir del complejo de pora y que se cree que ayudan a gular a las protefnas nucleares al centro delporo.

Figura 12-17 La lamtna nuelear, Electronmicragraffas de porciones de la lamina nuclear en un oocito de Xenopus preparado por sublimaci6n y sombre ado metalico. La lamina esta formada par una red regular de filamentos intermedios especlalizados. (Por cnrtesfa de Ueli Aebi.)

poro nuclear

\ DNA

membrana nuclear internal I I

membrana nuclear externaJ envo tura hue ear

FOSFORILACION DE LAS LAMININAS

~(p) vesicula de

~envoltura

~ (- J) r:.~","'"

:J ~ ~ II- crornosorna

~ if~ .. L lamininas 00 (P)

F/J p fosforiladas

TElOFASE TARDfA

FUSION DE LAS VEsfcULAS DE LA ENVOLTURA NUCLEAR

DESFOSFORILACION DE LAS LAMININAS

TELOFASE TEMPRANA

Cuando el micleo se desorganiza durante la mitosis, la lamina nuclear se despolimeriza, al menos parcialmente, como consecuencia de la fosforilacion de las lamininas nucleares en el Inicio de la mitosis. AI mismo tiempo, los poros nucleares se desorganizan en sus dlversos componentes. La despollmerizacion de la lamina nuclear es probablemente un requisite previo para que la envoltura nuclear se rornpa fonnando vesiculas de membrana las euales, con el contenido nuclear, se dispersan par to do el cltosol, La reorganizaci6n de Ja lamina nuclear tienen lugar cuando las lamininas nucleates son desfosforiladas y, como resultado de ello, repolimerizan en las superficie de los cromosomas; entonees, la lamina nuclear reorganizada une las vesiculas de la envoltura membranosa nuclear, las cuales se fusionan entre sf formando de nuevo una envoltura alrededor de eada cromosoma 0 grupo de cromosomas. Durante este proceso los complejos de poro nucleares tambien se reorganizan. Los cromosomas envueltos se agrupan y sus membranas se fusionan fonnando una sola envoltura nuclear, la cual importa activamente todas las protefnas que presentan senales de localizacion nuclear (Figura 12-18). Dado que la nueva envoltura nuclear esta situada muy cerca de la superficie de los cromosomas, excluye todas las protefnas de la celula excepto las que estan unidaS a los cromosomas mitoticos. Por Lo tanto, las proteinas grandes se mantienen fuera del rnicleo interfasico a menos que presenten sefiales de loealizaci6n nuclear.

Las sefiales de localizacion nuclear no son eliminadas despues del transporte hacia el nucleo, Sa supone que esto es ast porque las protetnas nucleares han de ser importadas al micleo varias veees, despues de cada divisi6n eelular. Por el contrario, cuando una molecula de protefna ha sido importada a cualquier otro organulo rodeado de membrana, se transmite de generacton a generaei6n en el interior del cornpartimiento y nunca ha de ser transloeada de nuevo. En este easo el peptide serial de estas moleculas es a menudo eliminado despues de Ia translocacion proteica,

El transporte entre el rnicleo yel citosol puede ser regulado evitando el acceso ala maquinaria transportadora II

Como se explica en el Capitulo 9, la actividad de aLgunas protefnas de regulaci6n genica esta controlada manteniendo estas protefnas fuera del compartimiento

E1 transporte de molecules hacla dentro y hacia fuera del mlcleo

PROFASE

Figura 12-18 Rotura ynueva formaeidn de la envoltura nuclear durante Iamltosts, Se cree que Ia fosforilaci6n de las larnininas ayuda a dlsparar el desensamblaje de la lamina nuclear, 10 cual a su vez causa la rotura en forma de vesiculas de la envoltura nuclear. Parece que la desfosfortlacion de la laminas ayuda a revertir eJ proceso.

605

envoltura nuclear r-I

senal de lccallzaclcn

I

CITOSOL

NUCLEO

'hormona

~.

~

tra nsc ri pc ion

dominio de union al DNA

COMPLEJO RECEPTOR INACTIVO EN EL CITOSOL

LA UNION DE LA HORMONA LIBERA LA I1.sp90 Y EXPONE LA SENAL DE LOCALIZACION NUCLEAR

UNION DEl RECEPTOR ACTIVO AL DNA ACTIVANDO LA TRANSCRIPCION

nuclear basta que son necesarias en dicho compartimiento. La senal de localizaci6n nuclear de estas proteinas puede ser inactivada por fosforilaci6n. Otras, se unen a proteinas citos6licas inhibidoras que 0 bien las re denen en el citosol-probablemente mediante interacciones can el citoesqueleto 0 can organulos especfficos- a bien enmascaran sus sefiales de localizacion nuclear. Cuando la celula reclbe el estfrnulo apropiado, la protefna es liberada de su anclaje citosolico 0 de sus sistema de enmascaramiento yes transportada bacia el ruicleo (Figura 12-19).

La exportacion de RNA desde el micleo puede estar controlada de una manera similar. Como la importacion activa hacia el nucleo, la exportaci6n tambien requiere una sefial: en el caso de la mayo ria de moleculas de RNA mensajero, esta senal la proporciona una modificaeirin caracterfstica, 1a estructura de caperuza (cap) en el extrema 5' del RNA (S8 explica en el Capitulo 8). Los RNA premensajeros procesados de forma incompleta tienen esta caperuza, pera estan unidos a la maquinaria nuclear de transcripcion y de maduraci6n, la cual s610 libera 1a molecula de RNA cuando se ha completado su procesamiento: esrudios geneticos realizados en levaduras han demostrado que las mutaciones que evitan que e1 RNA pre-mensajero se relacione correctamente can la maquinaria de maduracion provo can la exportaci6n de RNA no maduro. Otros RNA, como el RNA de transferencia 0 el RNA ribosomico, que no presentan la estructura en caperuza en el extrema 5', primero han de ensamblarse can protefnas y entonces son exportados como parte de estos complejos, Posiblemente las senales de exportacion nuclear se encuentran en las subunidades protelcas de estos cornplejos, y estas sefiales se activan despues del ensamblaje correcto con 10s componentes de RNA Sin embargo, no conocemos todavia la naturaleza.de estas sefiales.

Resumen

La enuoltusa nuclear estti formada par una membrana nuclear intema y otra extema. La membrana nuclear externa es continua con la membrana del ER, y el espacio entre esta y la membrana nuclear interna es continuo can el lumen del ER. Las moleculas de RNA, que sonfabricadas en d nudeo, y las subuntdades ribosomicas, que son ensambladas tambien. en et nacteo, son exportadas al citosol; mientras que todas las proteinas que SOn functonaies en el niicleo han sido sintetizad~ en el citosol e importadas. EI intercambio de matetiales entre el nucleo y el citosol tiene Ingar a travis de los paras nucleares que praporcionan. una ufa de paso a traves de la eltvo(tura nuclear.

Las proteinas que presentan seiiales de impo1,'tacion nuclear son transportadas activamente haciae! nucleo a trave~ de los paras, mientras que las moleculas de RNA y las subunidades ribosomales recien. fabricadas son transportadas acttuamente hacia afuera, a travis de los poros. Dado que este piptido sena; no es elimin(Uio, las proteinas nucieares pueden ser importadas uarias ueces, tal como se requiere cada uezque el nadeo se desorganiza en la mitosis. El transporte de las proteinas nucleares y de las moleculas de RNA a travis de los paras se puede regular euitando el acceso de estas moleculas a la maquinaria de transporte de los poros nucleares.

606 Capitulo 12: Compartimientos hitracelulares y clasiftcaci6n de proteinas

Figura l2-19 Laimportaci6nnuclear del receptor de glucocorticoides. EI receptor de glucocorticotdes es una protefna reguladora de genes que en las celulas no tratadas con hormonas se balta en el citosol unida a la

protein a chaperona hsp90. Cuando se activa por Ia uni6n de la hormona estero idea apropiada, la protefna hsp90 se libera y el receptor se dirige a1 nucleo gracias a una sefial de locallzacion nuclear: una vez se halla en el micleo, se une a secuencias esped6cas de DNA y regula la transcripci6n de una colecci6n de genes dlscreta. (Se explica en los Capftulos 9 y IS.)

HI transporte de protefnas aI interior de mitocondrias y de cloroplastos"

Tal como se explica en el Capitulo 14, las mitocondrias y los cloroplastos son organulos de doble membrana que se especializan en Ia sfntesis de ATP, utilizando la energfa producida mediante el transporte electronico y Ia fosforilaclon oxidativa en las mitocondrias y mediante la fosforilaci6n fotosintetica en los cloroplastos. A pesar de que ambos organulos contienen su propio DNA y su maquinaria para la sfntesis proteica, la mayorfa de sus protein as estan codificadas en el micleo celuJar y son importadas desde el citosol, Ademas, cada proteina importada ha de alcanzar el subcompartimiento determinado en el que es funcional, En las mitocondrias existen dos subcompartimientos: el espacio de la matriz y el espacio tntermembrana, Estos compartimientos estan definidos por las dos membranas mitocondriales: Ia membrana lnterna, que enciena el espacto de la matriz y 1a membrana externa que se halla en contacto can el citosol (Figura 12-20A). Enlos cloroplastos existen estes dos subcompartimientos mas otro adicional, el Hamado espacio tilacoidal, queesta delirnitado por Ia membrana tilacoidal (Figura 12-20B). Cada uno de estos subcompartimientos contiene una coleccion especifica de protetnas, Por 10 tanto, el crecimiento de las mitocondrias y de los cloroplastos mediante la importaci6n de protefnas citoplasmaticas constituye una proeza, que implica la traslocacion selectiva de estas protefnas a traves de varias mernbranas sucesivamente hasta alcanzar el lugar apropiado.

Las protefnas codificadas por los genomas de estos organulos, que SOn relativamente pocas, estrin Iocalizadas principalmente en Ia membrana interna de las mitocondrias y en la membrana tilacoidal de los cloroplastos. Generalmente los polipeptidos codificados por los organulos forman subunidades de complejos proteieos cuyas otras subunidades estan codificadas por genes nucleares y, por 10 tanto, son importadas desde el citosol. La formaci6n de estos complejos proteicos hibridos requlere una stntesis equlllbrada de los dos tipos de subunidades; el mecanisme a traves del cual esta coordinada Ia sfntesis proteica en dos tipos diferentes de ribosomas localizados en dos membranas separadas, constituye actualmente un rnisterio.

La translocaci6n hacia Ia matriz mitocondrial depende de una sefial tipica de la matriz"

Generalrnente, las proteinas irnportadas a la matriz mitocondrial son captadas desde el citosol uno 0 dos minutes despues de su liberacion desde los polirribosomas libres. Casi siempre estas protefnas precursoras mitocondriales poseen un peptide senal (de entre 20 y 80 residuos de arninoacidos) en su extremo ami-

(A) MITOCONDRIA

IBI CLOROPlASTO

membrana extema

espscto de la matrlz es pac io entre rnembranas

/

,

,

membrana interna

membrana tllacoidal

espaclc tilacoldal

membrana lnterna

esoa c i 0 entre rnernbranes

espaclo de la matriz (estrorna)

EI transporte de prntefnas al interior de mttocondrias y de cloroplastos

607

'--------------------------, ....

Figura L2-20 Los subcompartlmientos de la mitocondrla y del c1ocoplasto. La topologfa del cloroplasto puede derivarse de la topologfa de la mltocondria de una forma sendlla: pellizcando las invaginaciones de la membrana rmtoeondrial intern a para dar lugar a vesiculas, se puede generar un compartimiento que es topologicamente equivalence al de las vesiculas. del tilacoide de los cloroplastos, Las vesfculas del tilacoide podrian haber evolucionado de este modo.

Figura 12·21 Un peptido sefial para la importaci6n de pretefnas a la mitocondria. La citocrorno oxidasa es un gran complejo multiproteico localizado en la membrana mitocondrial intema, donde aetna como Ia enzima terminal de la cadena de transporte electr6nico (se explica en el Caprtulo 14). (Al Los 12 primeros amtnoacidos del precursor de la subunidad IV de esta enzima son suflcientes como peptido sefial para dirigir el

trans porte de esta subunidad ala mltocondria. (B) Cuando el peptide sefial se pliega en forma de helke ex de 3,6 residues par vuelta, y se observa desde arriba de la helice, se observa que los residues de aminoacidos cargados positivamente (en mjo) se agrupan en una cara de la helice mientras que IQS residues de aminoacidos no pol ares (en verde) se hallan agrupados en la cara opuesta. Todas Ias secuencias de 1.08 pepddos senal mitocondriales pueden potencialmente formar una helice anfipatica como esta, Se cree que una helice de este tipo es reconocida por protemas receptoras espeefflcas de Ia superficie rnltocondrial.

no. Cuando las protefnas han sido importadas, el peptido serial es nipidamente eliminado por una proteasa especffica (una peptidasa de serial) de Ia matriz rnitocondrial y probablernente degradado hasta aminoacidos en la matriz. El peptido sefial puede ser extraordinariamente sencillo. Experimentos de genetica molecular en los que se utiliza un peptide senal de longitud progresivamente menor, han demostrado que para sefializar Ia importaci6n mitocondrial solo son necesarios 12 arninoacidos en su extreme amino terminal La unionexperimental de estes 12 residuosa cualquier protefna citoplasmatica hace que la proteina resultants sea dirigida a la matriz mitocondnal. Estudios de la ffsica de peptidos serial completes sugieren que estos peptidos senal pueden formar estrucruras anflpaticas de helice o, en las que todos los restos cargados posittvamente se localizan en un lado de la helice y todos los restos hidrof6bicos se distribuyen' en ellado opuesto (Figura 12-21). Se cree que esta configuracion es reconocida par protefnas receptoras especfficas de la superficie mitocondrial,

La translocacion hacia la matriz mitocondrial depende

del gradiente electroquimico a traves de la membrana tnterna

y de la hidr6lisis de ATpl4 .

Casi todo 10 que conocemos acerca de los mecanismos moleculares de la importacion proteica a las mitocondrias 10 hemos aprendido del analisis de sistemas de trans porte reconstituidos en sistemas libres de celulas. En primer Iugar, se purifican mitocondrias por centrifugaci6ri diferencial a partir de un homogeneizado de celulas, A continuacion, estas mitocondrias se incuban con protefnas precursoras mitocondriales marcadas radiactivamente. Generalmente las proteinas precursoras purificadas son transportadas hacia el interior de estas mitocondrias de forma rapida y eficiente durante una breve incubacion in vitro. Cambiando las condiciones de estos experimentos in vitro, es poslble establecer los requerirnientos bloqufmicos del transporte de protefnas hacia el interior de

las mitocondrias. .

Todas las formas de transporte y de desplazamiento vectorial requieren energfa. En muchos sistemas biologicos la energfa esta suministrada por la hidr6lisis de ATP. No obstante! en el caso de Ia importaci6n mitocondrial tambien se requiere un gradiente electroquimico a traves de la membrana mitocondriaJ

[

interna. Este gradients se mantiene por el bombeo "pe H+ desde la matriz al es-

pacio intermembrana durante el transporte electrdnico, impulsado por los procesos de transporte electr6nico en la membrana interna, La membrana mitocondrial extema a1 lgual que las bacterias gram negativas (vease Figura 11-14J, presentan grandes cantidades de una protetna formadora de poros Hamada porina, par que son libremente permeables a los iones organicos y aIos rnetabolitos (aunque no a la mayorfa de protetnas) de modo que no es necesario mantener ningt1n gradiente a su craves. La energfa del gradiente electroquimico a

608 Capitulo 12 : Cnmpartlmlentos lntracelulares y clasificaci6n de protefnas

NH/

IBI

traves de la membrana intema se utiliza como una baterfa para Impulsar la blosintests de la mayor parte del ATP de la celula, pero tarnbien se utiliza para ayudar a impulsar la importaci6n de protefnas dotadas del peptide serial de importaci6n mitocondrial, que esta cargado posittvamente: cuando se afiaden ion6foros que dtsipan el potencial de membrana mitoeondrial, se bloquea la importacion de proteinas a la mitocondria, Todavfa no conocemos de que forma el gradiente electroqutmico colabora impulsando Ia translocacion proteica. La funci6n de la hidrolisls del ATP se conoce rnucho mejor, como verernos mas adelante,

Las protefnas mitocondriales son importadas hacla la matriz mediante un proceso de dos etapas, a traves de lugares de contacto que unen las membranas externa e. interna"

Como primer paso en la importaci6n mitocondrial, las protemas precursoras mitocondriaIes tienen que unirse a protemas receptoras que seencuentran en la membrana mitocondrial externa y reconocen los peptidos senal mitocondriales, La etapa siguiente es el proceso de translocacion en S1 mismo.

La protefna puede alcanzar la matriz mitocondrial cruzando las dos mem-

. branas una por una, 0 pasando a traves de ambas membranas a la vez, Para distinguir entre estas dos posibilidades, un sistema de importacidn libre de celulas se enfrfa hasta temperaturas bajas, atrapando las proteinas en algun paso intermedio del proceso de translocaci6n .. Las protefnas que sa detectan en este paso tienen su extreme amino terminal en el espacio de la matriz (como 10 indica el heche de que su peptide setial ya haya side eliminados por la proteasa de matriz), pero la mayor parte de Ia protefna todavfa puede ser atacada desde el exterior de la mitocondria por enzimas proteoliticas afiadidas externamente (Figura 12-22). Este resultado demuestra que para entrar en la matriz las proteinas precursoras pasan a traves de ambas membranas mitocondriales a la vez, Se cree que existen dos protefnas transportadoras, una en Ia membrana extema y la otra en la interna, y que sus funciones habitualmente se hallan acopladas permitiendo el transporte a traves de ambas membranas al mismo tiempo. Los electromnicroseopistas han detsctado numerosos puntos de contacto en los cuales parece que se unen las membranas mitocondriales extema e lntema, 10 eual sugiere que los procesos de translocacion se producen en 0 cerca deestos puntos.

Aunque las protetnas precursoras son transportadas atraves de ambas membtanas a la vez, esta claro a partir de los experimentos descritos en la Figura 12.-2.2 que el proceso de irnportaci6n tiene lugar en dos etapas distintas y que s610 Ia segunda S8 bloquea por temperaturas bajas, De ambas, la penetraci6n inicial, que no se afecta par las bajas temperaturas, es Ia que requiere el potencial de membrana: cuando una preparaci6n enfriada de mitocondrias que contienen intermediaries parcialmente translocados, sa vuelven a calentar, el pro-

sa neceslta sl potencial de membrana

sa nscestta Ia hidr61isis de ATP

Figura 12-22 Las prntefnas que son transportadas a la matriz mitocondrial atraviesan de forma transitoria tanto la membrana enema como la Interna de la mitocondria .. Cuando se incuban mitocondrias aisladas a 5 =C con un precursor de una protefna, el precursor s610 se translnca parciaImente. En Ia matriz mltocondtial S8 €llimina el peptido senal amino terminal (en raja); la mayor parte de la cadena polipeptfdica permanece fuera de la mitocondria donde es acceslble a enzlmas proteoliticas. Al volver a cal en tar Is preparacion a 25 oC, el proceso de translocacion se completa. Una vez se halla en el interior de la mitocondria, la cadena polipepndlca esta protegida de las enzimas proteoIfticas anadidas desde el exterior a rnenos que tarnbien se afiada un detergents para romper las membranes mitocondriales,!o que permite la digesti6n de las proreinas importadas.

5'C

25'C

Il j + protessa

, -1

El transports de protefnas al interior de mirocondrlas y de cloroplastos

609

! + protease

+ protease

+ dete rg ente

INSERCION EN LA MEMI3RANA, IMPULSADA paR EL GRADIENTE ELECTRoaufMICO

membrana mitocondrial extsrna

precursor de la protelne _ peptide senal

fUlL' ---

RECONOCIMIE NTO

membrana mitocondrial lntsma

ClTOSOL

ROTURA MEDIANTE MATRIZ

lu;gar de <, 8i_NA PEPTIDAS&

ccntacto .. en!re___ D. E SEjl;JAL

las membranes ~

LA TRANSLOCACI6N \ proteina mitocondrial

A LA MATRIZ '" rnadura

REQUIERE ATP !-

psptldo senal eliminado

protetna receptora

ceso de tmportaclon se completa rapidarnente (Figura 12"22), incluso aunque el potencial de membrana a traves de la membrana interna se haya disipado. Sin embargo, esta segunda etapa del proceso de transporte requiere ATP. Por 10 tanto la primera etapa, que implica la insereion del peptide serial y de las secuencias adyacente en el interior de ambas membranas mitocondriales, es impulsada par el gradients electroqutmico, y La segunda fase, en la eual el resto de cadena polipeptidica se desplaza hacia la rnatriz, requiere tanto hidt6lisis de ATP como una temperatura fisiol6gica (Figura 12-23)..

Las protefnas son Importadas hacia el interior de Ia matriz mltoeondrial, en un estado desplegado"

EI transporte de las protetnas precursoras mitocondriales a traves de los puntos de contacto de las membranas mitocondriales esta guiado par los miembros de la familia de las protefnas chaperones, las cuales se explican en el Capitulo 5. Es diffcil de imaginar como una proteina plegada soluble en agua puede pasar a traves de dos (0 inc1uso a traves de una) bicapas liptdicas mientras mantiene su conformaclcn tridimensional nativa, Se sabe que las protetnas citosollcas de tipo chaperone (llamadas chaperoninas; pertenecientes a Ia familia de las hsp70, ademas de asegurarel correctoplegamiento de protefnas citosolicas, tlenen una funcion importante en la Importacion de protefnas tanto hacia el interior de las mitocondrias como bacia el ER, mediante su union a los precursores en su estado desplegado durante la translocacion. Como se explicaen el Capitulo ~, la liberaci6n de los polipeptidos recien sintetizados de la familia de protemas chaperonas hsp70 requiere Ia hidrolisis de ATP, 10 cual supone parcialmente Ia dependencia del ATP de las ultimas fases de la importacion mitocondrial,

Las primeras evidencias sObre Ia funcion esencial de las protelnas chaperonas en la translocaci6n a traves de las membranes celulares internas se obtuvieron en estudios geneticos de levaduras .. Cuando se inactivan los genes que codifican ciertos rnlernbros de la familia psp70 de las protein as chaperonas, los precursoresrnitocondriales no son importados hacia las mitocondrias y se acumulan en el citosol, Se cree que los precursores recien sintetizados, a medida que son liberados de los polirribosomas en el citosol, se unen a las protefnas hsp70, las cuales evitan la agregacion 0 el plegamiento espontaneo de las proteinas precursoras antes de que se unan a los translocadores proteieos de larnembrana de destine. La energfa liberada por la hidrolisis de ATP se utiliza para liberar a las proteinas hsp70 unidas a rnedida que las protefnas translocadas pasan a traves de la membrana. Experimentalmente, la necesidad de hsp70 y de ATP en el citosol puedeevitarse si las protefnas se mantienen desplegadas artificialmente, par ejemplo, mediante un paso de desnaturalizacion en una solucion concentrada de urea.

610 Capitulo 12 : Compartimientos lntracelulares y clasfficacian de proteinas

--.~

Figura 12·23 Importaci6n de protemas par la mitocondria. EI peptide sefial amino terminal del precursor proteico es reconocido par receptores que al parecer existen en Ia membrana extern a de la mitocondria. Se cree que la protema es translocada a traves de ambas membranes mitocondriaies, a traves de lugares especiales de contaeto 0 muy cerca de ellos, Bste transports esta impulsado inlcialmente por e1 gradiente electroquimico existente a traves de Ia membrana intema, y despues por la htdroltsts de ATP. En la matriz rnltocondrial, el peptide senal es eliminado por una peptidasa de sefial, forman dose la protefna madura, El peptide sefiallibre es riipidamente degradado.

membrana mitocondrial externa

~nembrana mittmondrial~ .....

tnterna /..w

hsp70 rnltoccndrial

MATR.lZ

La uni6n secuencial de las protefnas importadas a las proteinas mitocondriales hsp70 y hsp60 impulsa su translocaci6n y ayuda el plegamiento protelco-?

Las protemas importadas no s610 son dirigidas a las rnitocondrias por las proteinas chaperonas: una vez han side liberadas en eI interior, son recibidas en la matriz par protefnas estrechamente relacionadas con las hsp70. La hsp?O mitocondrial es crucial en procesos de importacion ya que las mitocondrias que contienen forrnas mutantes de la protefna no son capaces de importar ptotefnas precursoras. Al igual que su pariente citosolico, Ia hsp70mitocondrial tiene una alta afinidad para las cadenas polipeptfdicas no plegadas, y se unefuertemente a las protemas importadas a medida que emergen de los translocadores. A continuacton la hsp70 libera la proteina mediante una reaccion dependiente de ATP. Este ciclo de union y posterior liberaci6n dependiente de energia puede proporcionar ta fuerza impulsora para Ia importacion proteica despues de que la protefna se haya insertado lnicialmente en 131 translocador (Figura 12-24):la union secuencial de muchas hsp70 mitocondriales puede empujar la protetna desplegada a traves del canal transmembrana hacia la matriz,

Despues de la interaccion inicial con 1a hsp70 mitocondrial, muchas proteinas importadas son transferidas a otra protefna chaperone, la hsp60 mitocondrial; Tal como se explica en el Capitulo 5, la hsp60 se pega a las cadenas pollpepttdlcas no plegadas facilitando su plegamiento mediante una reacci6n dependiente de ATP. La mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre la funciorr de la hsp60 como proteina facilitadora del plegarniento deriva de estudios sobre 1a importaci6n de proteinas en las mitocondrias.

El transporte de proteinas al espacio intermembrana mitocondrial requiere dOB sefiales18. '

,

Muchas de las funciones de las mitooondrias requieren proteinas que estan integradas en 1a membrana rnitocondrial interna 0 bien que actuan en el espacio intermembrana. Estas protefnas son transportadas desde el citosol mediante los misrnos mecanlsmos que transport an proteinas hacia la matriz, pero mediante varies sistemas se evita que finalicen su viaje en Ia matriz. En rtluchos casus las protefnas precursoras son inlcialmente 'transferidas bacia Ia matriz, tal como se ilustra en 1a Figura 12-23. No obstante, estas proteinas presentan una secuencia de aminoacidos muy hi drofobic a, situada muy estrategicamente despues del peptide sefial amino terminal que inicia la importaci6n. Una vezel peptide sefial ha sido eliminado por Ia proteasa de la matriz, la secuencia hidrofobica acnia como un peptide sefial para volver a translocar la protein a de nuevo desde la matriz all-aves de Ia membrana interna, Posiblementeel paso final de esta ruta tmplica un mecanismo similar al utilizado para dirigir protemas codificadas por las mitocondrias a traves de 1a membrana interna (Figura 12-25A). Mas adelante veremos que un mecanisme parecido se utiliza para translocar protefnas hacia 0

El transporte de protefnas al interior de mltocondrtas y de claroplastos

FIgura 12·24 La importacl6n de protemas hacia Ia matriz mitocondrial requlere protefnas hsp70 en ambos lados de Ia doble membrana mitocondrial. Despues de Ia inserclon inicial del pdptido serial y de las porciones adyacentes de la cadena polipepttdica, Iacadena desplegada se desllza a traves de un canal que atraviesa ambas membranas. La hsp70 citosolica unlda 8e lib era de la protetna par media de una reaccion que depends de la hidrrillsts de ATP. De forma concomitanta, la hsp70 mitocondrial se une a regiones de la cadena pollpepudica que se hallan expuestas en la matnz, esrlrando asf la protetna bacia el interior de la mitocondria.

611

rotura por proteins del espacio

protease intermembrana

\

proteins de la membrana interne

CITOSOL

, r:

a traves de 1a membrana del ER y de la membrana.plasmatica procariota, donde

ha side estudiado mas intensamente. .

Una ruta altemativa hacia la membrana interna puede evitar la excursion hacia la matriz, EI translocador en la membrana intema se une ala secuencia hidrof6bica que sigue al pepttdo senal amino terminal que inicia la importaci6n y evita transjccaciones posteriores a traves de la membrana interna. Los dos translocadores en las membranas externa e intema se desacoplan, 10 cual provoca que el resto de la protefna sea empujada hacia el espacio intermembrana (Figura 12-25B). Diferentes protetnas pueden utilizar una u otra de estas dos rutas hacia la membrana interna 0 hacia el espacio intermembrana, No esta claro cual de ellas es Ia mas utilizada.

Despues de que las protefnas destinadas a la membrana intema hayan sido insertadas en la membrana, una proteasa intermembrana las fracciona, liberando la cadena polipeptfdica madura como una protefna soluble (Figura 12-25C). Pinalmente, muchas de estas protefnas se encuentran unidas, como protefnas de membranas perifericas, ala superficie externa de Ia membrana mitocondrial interna, donde forman subunidades de complejos proteicos que 'tambien contienen proteinas transmembrana.

Para dirigir el transporte de protefnas a la membrana tilacoidal de los cloroplastos se necesitala participaci6n de dos peptldos sefial'"

EI transporte de proteinas hacia el interior de los clorop1astos se parece en muchos aspectos al transporte hacia el interior de las mltocondrias: ambos transportes se producen de manera post-transcripcional, ambos requieren energfa, y ambos utilizan peptidos senal hldrof6bicos amino terminales que se elirninan despues de haber sido utilizados. Si embargo, existe al menos una diferencia importante: las mitocondrias utilizan el gradiente electroqufrntco a traves de su membrana interna para ayudar a impulsar el transporte, rnientras que los cloroplastos, que tienen un gradiente e1ectroquimico a traves de sus tilacoides pero no de su membrana intern a, parece que s610 utilizan la hidrolisis de ATP como aporte energetic a para la lmportacion a traves de su envoltura extema de doble membrana.

A pesar de que los peptidos senal para el transporte al interior de los cloroplastos son semejantes a los descritos anteriorrnente para el transporte a mitocondrias, en las celulas vegetales se hallan presentee tanto mitocondrias como cloroplastos, y las protefnas han de escoger de manera adecuada entre ellos, En plantas, par ejemplo, si una enzirna bacteriana se une experimentalrnente a una secuencia amino terminal de una protefna mitocondrial, es dirigida especfficamente a las mitocondrias mientras que si se une experimentalmente a una secuencia amino terminal de una proteina de cloroplasto, penetra en los cloroplastos. Por 10 tanto, probablemente los receptores de importaci6n de cada organulo pueden reconocer las diferentes secuencias serial.

Los c1oroplastos tienen un compartirrtiento extra rodeado de membrana, el tilacoide. Muchas protefnas de los cloroplastos, entre las que se encuentran las suburridades proteicas del sistema fotosintetico y de Ia ATP sintasa, son trans-

612 Capitulo 12: Comparttmlentos lntracelulares y clasificaci6n de protefnas

Figura 12-25 La Importacldn de protefnas desde el citosol al espacio Intermembrana 0 a la membrana Interna de la mitocondrla. (A) Se cree algunas protemas, para desplazarse desde el cttosol a la membrana

interna, siguen una ruta que requiere la participaci6n de dos peptldos sefial y de dos fen6menos de translocaci6n. En primer lugar, la protefna es transportada al espacio de la matriz, como muestra la Figura 12-23. Sin embargo, la eliminaci6n del peptide sefial (en rojo) utilizado para este transporte tnicial desenmascara un peptide sefial hidrofnbico (en naranja) adyacente situado en el nuevo extrema amino. Esta serial hace que la protefna se inserte en la membrana intema mediante el mismo sistema par el que se insertan en esta membrana las protefnas codificadas por el genoma mitocondrial. (B) Seg1in un mecantsmo altemativo, la sscuencia hidrof6bica que sigue ala serial que dirige hacia la matriz se une a un translocador y detlene La translocaclon a traves de 1a membrana intema .. Entonces el resto de la proteina es empujada hacia el espacio lntermembrana y la secuencia hidrof6bica se libera en el interior de la membrana interna. Este mecanisme se denomina la ruta de pare de transferencia y se explica en detalle mas adelante. (C) A1gunas prntefnas solubles del espacio intermembrana pueden utilizar tambien las rutas rnostradas en (Al yen (Bl antes de ser liberadas a1 espacio intermembrana por una segunda peptidasa de sefial: (con su lugar activo en el espacio lntermembrana), 1a cuaJ elimina el peptide senal.hidrofchico.

peptide senal de ctorcptasto

CITOSOL

, proteins

I ./ precursors

i pe tilacoide

f rece pt 0 r cuva ex lsten c I a se

propene

membrana

externa

portadas desdeel citQSOI hasta la membrana tilacoidal. Como en el caso de algunos precursores mitocondriales, estas protefnas son transportadasa su destine final a traves de un proceso en dos pas os. Primero pasan a traves de la envoitura de doble membrana hacia el espacio de la matriz del cloroplasto (llarnado e1 estrums) y luego son translocadas hacia la membrana tilacoidal (0 a traves de esta membrana hacia el espacio tilacoidal). Los precursores de estas proteinas henen, a continuacion del p~ptido senal amino terminal del cloroplasto, un peptido sefial hidrof6bico del tilacoide, Despues de que el peptide serial amino terminal haya side utilizado para importar a la protefna al estroma, es eliminado par una proteasa sefral del estroma (analoga ala proteasa sefial de la matriz mitocondrial). Esta hidrdlisis desenmascara el peptido sefial del tilacoide, el cual entonces inicia el transporte a traves de Ia membrana tilacoidal (Figura 12-26)., Igual que en e1 caso de las rnitocondrias, el segundo paso as la via utilizada para insertar las protefnas codificadas POt el c1oroplasto en la membrana tilacoidal; probablemente el translocador proteico que se utiliza es originario del antecesor bacteriano de los cloroplastos.

Resumen

A. pesar de que las mitooondrias y los cloroplastos tienen sus propios sistemas gent#icos, solo producen una pequefiQ proporcion de sus propias protefnas. De heeho, ambos organulos importan desde el citosol la mayorta de sus proteinas, utilizando en ambos casas, mecanismos similares. Los procesos de transporte han sido

, I

may estudiados en qnitocondrias, especialmente en leuaduras. Una protelna es

translocada al espac,o de la matrix mitocondrial mediante el paso a traces de lugares de. adhesion entre las membranas extema e interna, llamados lugares de contacto. La translooocion en las mitocondrias estd impulsada por In hidr6l.isisde ATP y porel grD,diente eleetroqu(mico a traves de In membrana interna, mientras que la transiocacuin. en los cloroplastos soloestti impulsada par la hidr61isis del ATP. La protetna transportada atraviesa las membranas de las mitocondrias y de los doroplastos en-estado desplegado. Las proteinas chaperonas de lafamilia de las hsp70 citos6lieas mantienen las proteinas preoursoras en un estado desplegado competente con fa transtocacion: La hsp70 mitocondrial se une a Ia cadena polipetid.ica que estti llegllndo ala matrizy parece que In impulsa haeia el interior. Una vez que la protetna se halla en la matriz, otra prote(na de esttes, la hsp60, ayndaal plegamiento de la proteina; Solo las protetnas que contienen. un peptido seiial espedfiC(J son translocadtts hacia el interior de las mitocondrias y los cloroplastos, El peptido seiia.l se h'alla,generalmente en el extremo amino terminal y es eiimtnado despues de Ia importacion. EI transporte a fa membrana interna puede tenet lugar como un segundo paso si en In protetna. importada se kalla presente un pep-

EI transporte de prntefnas al interior de mitocondrias y de cloroplastos

Fi~ 12-26 La translocacl6n al espacioillacoidaJ. de los cloroplastos. La cadena polipeptfdica precursora contiene un peptide sefial amino terminal-de cloroplasto (en raja), seguido irrmediatamente por un peptide serial de tilacoide (en

naranjaj. El peptido serial de c1oroplasto inicla la translecacicn al estrorna a traves de un Ingar de contacto entre mernbranas, mediante un mecanlsrno similar al utillzado para la translocad6n a la matriz mttocondrlal. Entonces, este peptidn serial es elirnlnado, dessnmascarando el peptide senal de tllacolde, el eual inicia la translocaci6n a traves de la membrana del tilacoide.

613

tido selial hidrof6bico; este segundo peptido selial es desenmascarado cuando se elimina el primer peptido selial. De igual forma. en el.caso de los cloroplastos La importaci6n tkstk et estroma hasta el tilacoide requiere un segundo peptido selial.

Peroxisomas"

Los peroxisomas se diferencian de las mitocondrias y de los cloroplastos en muchos aspectos, entre los que cabe destacar que estos organulos estan rodeados par una unica membrana, y no presentan ni DNA ni ribosomas. A pesar de estas diferencias, se cree que los peroxisomas estan formados por un proceso similar de Importacion especffica de protetnas (y de llpidos) del citosol. No obstante, dado que los peroxisomas no poseen genoma, todas sus protetnas han de proceder del citosol. Pot ello, los peroxisomas se parecen al ER en que son organulos autorreplicantes, delimitados par una membrana unitaria y que existen sin ge-

noma propio. I

Dado que no volveremos a tratar de los peroxisomas en otro lugar de este libro, vamos ahora a detenernos a considerar las funciones de esta familia dlversa de organulos, antes de hab1ar de su biosfntesis. Los peroxisomas se encuentran en todas las celulas eucariotas. Presentan enzimas oxidativas, como la catalasa y la urato oxidasa, a tan altas concentraciones que en algunas celulas los peroxisomas se reconocen en electronmicrograffas pOI la presencia de WI nucleoide cristalino, prtncipalmente compuesto de urato oxidasa (Figura 12-27).

Como en el caso de las mitocondrias, los peroxis=ruas son los principales lugares de utilizaci6n de oxfgeno. Una hipotesis es que los peroxisomas son un vestigio de tUI organulo antigun, que en los antecesores prlmitivos de las celulas eucariotas reallzaba todo el metabolismo del oxfgeno. Cuando el oxigeno producido par las bacterias fotosinteticas empez6 a acumularse en Ia atmosfera podrta haber resultado altamente texico para la mayorfa de las celulas, Los peroxisomas pudieron haber contribuido a disminuir 1a concentraci6n de oxigeno en estas celulas, ala vez que permitian utilizar su reactividad quimica para realizar reacclones oxidativas utiles, De acuerdo con este punto de vista, el desarrollo posterior de las mitocondrias hizo que los peroxisomas se volvieran altamente obsoletos, dado que muchas de las reacciones que ellos realizaban sin producir energfa fueron acopladas a la formacion de ATP par medio de la fosforilaci6n oxidativa. Par 10 tanto, las reacciones oxidativas que realizan actualmente los peroxisomas podrfan ser las que siguen siendo utiles a pesar de la presencia de las mitocondrias,

Los peroxisomas utilizan el oxfgeno molecular y el per6xido de hidr6geno para realizar reacciones oxidatlvas"

Los peroxisomas se denominan as! porque generalmente contienen una 0 mas enzimas que utilizan oxigeno molecular para eliminar atomos de hldrogeno a partir de substratos organicos especfficos (aqul designados como R) a traves de una reaccton oxidativa que produce per6xido de hidrogeno (Hpz):

RHz + O2 ~ R+ HPz

La catalasa utiliza el Hz02 generado por otras enzimas del organulo para oxidar diversas substancias -corno fenoles, acido formico, formaldehfdo, y alcohol- mediante una reaccirin de "peroxidacion": HPz + R'H2 ----v R' + 2Hp. Este tipo de, reaccion oxidativa es particularmente importante en el hfgado y en las celulas de rlnon, cuyos peroxisomas destoxifican una gran variedad de moleculas t6xicas que entran en la circulacion. Casi la mitad del etanol que bebemos es oxidado a acetaldehfdo de esta manera, Ademas, cuando se acumula un exceso de HP2 en 1a celula, Ia catalasa transforraa HPz a H20 (2~Oz ~ 2H20 + O2),

Una de las funciones principales de las reacciones oxidativas realizadas en los peroxisornas es Ia hidrolisis de las moleculas de acidos grasos. En un proceso

614 Capitulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasiflcaclon de protefnas

L____j 200 nm

Pigura 12-27 Electronmlcrograffa de ires peroxisomas de una celula de bfgado de rata. Las inclusiones paracrlstalinas electro dens as corresponden a la enzirna urato oxidasa. (Par cortesfa de Daniel S. Friend.)

Figura 12-28 ElectronmJcrograffas de dos tipos de peroxisomas encontrados en celulas vegetales. (A) Peroxisoma de las hojas, can un micleo paracristalino, de una celula del mes6filo de una hoja de tabaco. Se cree que la estrecha asociaci6n del peroxisoma can el cloroplasto facilita el intercambio de materiales entre estos organulos durantela fotorrespiraclon. (B) Peroxisomas de una celula de un cotiledon almacenadora de lipidos, de una sernilla de tomate, 4 dfas despues de germlnar, En este caso, los peroxisomas (glioxisomas) estan asociados can los cuerpos lipfdicos en los que S8 alrnacenan los ltpidos, 10 cual retleja el papel central de estes glioxisomas en la movilizaci6n de los Jfpidos y en su utilizaci6n para gluconeogenesis durante la germinacion de Ja sernilla. (A por cortesia de P.J. Gruber y E.H. Newcomb; B, por cortesfa de S.E. Frederick y E.H. Newcomb.)

Hamada p oxidacion, las cadenas alquilo de los acidos grasos son acortadas secuencialrnente en bloques de dos a,tomos de carbona que son convertidos en aeetil eoA y exportados desde los peroxisornas al citosol para su reutilizaci6n en reacciones biosintettcas. La S oxidad6n en celulas de mamffero tiene lugar tanto en mitocondrias como en peroxisomas, sin embargo en levaduras y celulas vegetales esta importante reacci6n se encuentra exclusivamente en los peroxisomas.

Los peroxisomas son organulos extraordinariamente diversos: en distintas celulas de un mlsmo organismo pueden contener incluso muy distintos tipos de enzimas, Tambien pueden adaptarse de manera rernarcable a condiciones cambiantes. Par ejemplo, las celulas de levadura que crecen con azucar tienen peroxisomas pequenos, pero cuando crecen en rnetanol desarrollan grandes peroxisomas cap aces de degradar actdos grasos basta acetil eoA per-medic de Ia S oxidacicn.

En las plantas, los peroxisomas tienen funciones lmportantes, Se han estudiado intensamente dos tip os muy diferentes. Un tipo de peroxisomas esta presente en las hojas, donde cataliza la oxidaci6n de un produeto colateral de la reaccidn crucial que transforma el CO2 en carbohidratos (Eigura 12-28A). Este proceso se denomina [otorrespiracion porque utiliza 0" y libera CO2, El otro tipo de peroxisomas se halla presente en las semillas en germinacion, donde desem-

615

Peroxlsomas

penan una funci6n esencial transformando los acidos grasos almacenados en los lipidos de las semillas en azucares necesarios para el crecimiento de la planta joven. Dado que esta conversi6n de grasas en azucares se realiza a traves de una serie de reacciones conocidas como e1 ciclo del glioxilato, estos peroxisomas son tambien denominados glioxisomas (Figura 12-28B). En e1 cieJo del glioxilato, dos molecules de acetil eoA producidas por la degradaci6n de un acido graso en el peroxisoma, son utilizadas para fabricar acido succfnico, el cual sale del peroxisoma y es transform ado en glucosa, E1 ciclo del glioxilato no tiene lugar en la celulas animates, y par ella los animales son incapaces de transformar los acidos grasos en carbohidratos.

Una corta secuencia sefial dirige la importaci6n de protefnas hacia los peroxisomas=

Una secuencia especifica de tres arninoacidos localizada eerea del extrema carboxilo de muchas proteinas peroxisomales aetna como sefial de importacion (vease Tabla 12-3). Si esta secuencia se une experimentalmente a una protefna citos6lica, la protefna es impartada a los peroxisamas. La irnportancia de este proceso de importaci6n y de los peroxisomas se pone dramaticamente de manifiesta en la enfermedad hereditaria humana Ilamada el sindrome Zellweger, en el que un defecto en las protefnas de impottaci6n a los peroxisomas conduce a una deficiencia peroxisomal grave. Estos individuos, cuyas celulas presentan peroxisomas vacfos, tienen severas anomalfas en el cerebro, hfgado, y rifiones, y mueren pronto despues del nacimiento. Se ha demostrado que una forma de esta enfermedad es debida a una mutaci6n en el gen que codifica una proteCna integral de 1a membrana de los peroxisomas, Hamada factor-I de ensambla]e de peroxisomas.

Probable mente los peroxisornas tienen al menos una protefna expuesta en su cara citos6liea, que acnia como receptor que reconoce la sefial de las proteinas que se irnportan al organulo, Anteriormente se pens6 que la "cubierta" membranosa del peroxisoma se fonnaba por gemad6n desde el ER, mientras que el "contenido" era importado desde el citosol. No obstante, actualmente existen evidencias que sugieren que los peroxisomas siempre se forman a partir de otros peroxisomas preexistentes mediante el crecimiento y la fisi6n del organulo, tal como se ha descrito previamente para las mitocondrias y plastos y para elpropio ER (Figura 12-29).

Reswnen

Los peroxisomas estdn espeeializados en fa realizaci6n de reacciones oxidativas que Iltilimn oxigeno molecular. Generan. per6xido de hidr6geno, que es utilizado COli flnes oxidativos, y destruyen el exceso de peroxido de hidrogeno par media de la catalasa que contienen. Como en ei caso de las mitocondrias y de los cloropiastos, los peroxisomas son orgdnulos autorreplicantes. Dado que no presentan. ni DNA ni ribosomas, fienen que importar todas sus proteinas desde el citosol: Ulla secueneia especlflca de tres ammodcidos situada cerca del extrema carboxilo de muohas de estas protetnas aeMu como una seiial de importaci6n peroxisomal.

perpxisoma protelna raceptore ~

as pecffi ca, que cata I iZB Ui," '. '.

la importaci6n de ;q:~.. :

protelnas '

. ~';/~

I

CRECIMIENTO POR CAPTACION DE PROTEINAS CITOSOLICAS

ESPECfFICAS "

Figura 12-29 Modelo del proceso a traves del cual se ensarnblan los peroxisomas. La membrana de los peroxisomas contiene protefnas

receptoras de importaci6n. Todas las protefnas peroxisomales, incluyendo las nuevas copias del propio receptor de irnportaci6n, estan sintetizadas por los ribosomas citos6licos y despues son transportadas hasta el organulo. As! pues, "",_

los peroxisomas se.forman 11nicamente a partir de otros peroxisomas ya \_

formados, mediante un proceso de cracimiento y fisi6n. Probablemente los -\'

I1pidos necesartos para formar Jas nuevas membranes peroxlsomales tamblsn

son Importados, Mas adelante expltcaremos c6mo los Jfpidos fabricados en el

EE. pueden ser transportados a traves del citosol hasta los organulos,

peroxtsomaa hljos

616 Capitulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificaci6n de protefnas

EI retfculo endoplasmatico-'

Todas las celulas eucariotas tienen un retfculo endoplasrnatico (ER de Endoplasmic Reticulum). Su membrana constituye normalmente mas de la mitad del total de la membrana de la celula (vease Tabla 12-2). Bsta organizado en forma de una red laberintica de tubules ramificados y de saculos aplanados que se extiende por todo el citoplasma (Figura 12-30). Se cree que los tubules y saculos estan interconectados, de modo que La membrana del ER forma una lamina continua que define un unico espacio interne. Este espacio, altamente intrincado. se denomina ellumen del ER 0 tambien el espacio de las vesiculas del ER. y a menudo ocupa mas del 10% del volumen celular total (vease Tabla 12-1). La membrana del ER separa el lurnen del ER del citosol, y media la transferencia selectiva de determinados compuestos entre estes dos compartimientos.

El ER juega un papel central en la biosfntesis celular. Su membrana es el lugar de produccion de todas las proteinas transmembrana y lipidos de La mayoria de los organulos celulares, incluyendo el propio ER. el complejo de Golgi, los lisosornas.Ios endosomas, las vesiculas secretoras y la membrana plasmatica. La membrana del ER tambien contribuye de forma Importante ala formacion de las mernbranas de las mitocondrias y de los peroxisomas, ya que produce los Ifpidos de estos organulos, Adernas, todas las proteinas que seran secretadas al exterior celular -y tambien las que acabaran en ellumen del RE, en el complejo de Golgi 0 en los lisosornas- son inicialmente transpottadas allumen del ER.

Los ribosomas adheridos a las membranas definen el ER rugoso'" El ER extrae determinadas protetnas desde el citosol a medida que son sintetizadas. Estas proteinas son de dos tipos: (l) proteinas trans membrana, que solo son pardalmente translocadas a traves de la membrana del ER y que, por tanto, se mantienen incluidas en ella. y (2) proteinas solubles en agua, que son completamente translocadas a traves de la membrana del ER y llberadas allurnen. Algunas de las protefnas transmembrana se mantienen en el ER, pero muchas otras estan destinadas a residir en la membrana plasmatica 0 en Ia membrana de otro organulo, mientras que las protefnas solubles en agua estan destinadas al lumen de un organulo 0 a ser segregadas. Todas est as proteinas, independientemente de su destine posterior, son dirigidas a la membrana del ER par el mismo tipo de peptido sefial y translocadas a traves de la membrana mediante el mismo mecanisme.

En las celulas de marnifero la importacion de protefnas al ER empieza antes de que La cadena poUpeptidica se haya acabado de sintetizar -es decir, tiene lugar a nivel cotraduccional. Este hecho diferencia este proceso del de la importaci6n a Las mitocondrias, a los cloroplastos, al micleo, y a los peroxisomas, en los cuales la importaci6n es post-traduccional y requiere dlferentes tipos de peptidos sefial. Dado que habitualmente un extremo de la protefna esta translocado en el interior del ER mientras el resto de la cadena polipeptidicase esta fabricando, la

EI reticula endoplasmatlco

617

Figura 12-30 EI retfculo endoplasmatleo, Micrograffa fluorescente de una celula cuJtivada de mamffero, tefilda can un anticuerpo que se une a una protefna retenida en el ER EI ER se extiende como una red par todo £11 cltoplasma de la celula, de forma que todas las regiones del citosol se hallan cercanas a alguna porcidn de La membrana del ER. (Po'r cortesfa de Hugh Pelham.)

protefna nunca es liberada al citosol y por constguiente no existe el peligro de que se pliegue antes de alcanzar el translocador de la membrana. Contrariamente al caso de importaci6n post-traduccional de protefnas hacia el interior de las mitocondrias y de los cloroplastos, en el caso de la importaci6n de protetnas al ER las chaperoninas citos6licas no son necesarias para mantener a la proteina despJegada. El ribosorna que esta sintetizando la protefna esta unldo directamente a la membrana del ER. Estos ribosomas unidos a membrana recubren la superficie de'la membrana del ER, dan do lugar a las regiones Jlamadas retfeulo endoplasmaticc rugose (Figura 12 -31).

Por 10 tanto, en el citosol existen dos poblaciones de ribosornas, separadas espacialmente, Los ribosomas unidos a membrana, unidos a la eara citos6lica de la membrana del ER, se dedican a la slntesis de protefnas que simultaneamente se translocan al interior del ER. Los ribosomas llbres, no unidos a ninguna membrana, fabrican todas las demas proteinas codiflcadas pOI el genoma nuclear. Los ribosomas unidos a membrana y los ribosornas libres son estructural y funcionalmente identicos, Difieren s610 en las protefnas que estan fabricando en un momento dado. Cuando un ribosoma empieza a fabricar una protefna con un peptide serial para el ER, Ia propia serial dirige al ribosoma a la membrana del ER. Dado que muchos ribosornas pueden unirse simultaneamente a una rnisma molecule de mRNA, normalmente se forma un polirribosoma, el eual se une a la membrana de ER a craves de multiples cadenas polipeptfdicas en crecimiento (Figura 12-32). Cada uno de los ribosomas asociadas can una molecule de m'RNA de este tipo puede volver al citosol en cuanto termina la traduccion, cerca del extremo 3' de la molecule de mRNA. No obstante. el mRNA por sf mismo tiende a permanecer unido a la membrana del ER debido a la interaccion de una poblad6n cambiante de ribosomas que se mantienen unidos a la membrana mediante un receptor ribosomico que los ayudan a mantenerse allt, Par el contrario, si una molecula de mRNA codifica una protema que no tiene el peptide serial para el ER, el polimbosoma que forma permaneee libre en el citosol y la protefna producto de esta sfntesis es liberada en elpropio cltosol, Por 10 tanto, solo se unen a las membranas rugosas del ER las moleculas de mRNA que codifican proteinas que tienen un peptide seftal para el ER; las moleculas de mRNA que codifican todas la demas protemas, pennanecen libres en el citosol. Se cree que cada riboserna individual se mueve al azar entre estas dos poblaciones de rnoleculas de mRNAsegregadas (Figura 12-33).

El ER lisa es abundante en algunas celulas especlallzadas-"

Las regiones del ER que carecen de ribosomas unidos se denominan retfeulo endoplasmatico liso, 0 ER liso. En una gran mayorfa de celulas estas regiones son escasas, y s6lo existe una pequefia region del ER que es parcialmente lisa y par-

618 Capftulo 12 : Compartimientos Intracelulares y clasiflcacldn de protefnas

FIgura 12-3l El ER rugosa. Electromnicrograffa que muestra I'll ER rugosa, el cual recibe su nombra de los ribosomas que se hallan en la superficie citosolica, (Cortesfa de L. oren

Figura 12-32 Polirribosomas. E1ectronmicrograffa de una secci6n ultrafina de polirribosomas unidos a la membrana del ER. En algunos Iugares el plano de la secci6n corta a traves del ER en paralelo a la membrana, dando una vision del patr6n en roseta de los polirrtbosomas, (Por cortesta de George Palade.)

los mRNA que codlflcan una

orotefna citosollca oerrnanecen polirribosorna libra

..." en el cltosol

libres en el 01to$01 \

5'& 3'_5'",,!t3'

c_ .. " ...... ' ~

i •••• '

rvo cornun de SU,bunidade~ e ribosoma, en el citosol

5' ... ~ __ ,--- 3' - 5' 3'

cialmente rugosa. Esta region se denomina elementos transicionales porque de ella emergen las vesiculas que transportan protefnas y ltpidos recien sinretizados hacla el complejo de Golgi. No obstante" en deterrninadas oelulas especializadas el ER Iiso es abundante y tiene otras funciones. Concretamente, es particularmente predominante en celulas especializadas en el metabolismo lipidico. Por ejernplo, las celulas que sintetizan hormonas esteroideas a partir del colesterol tienen un ER lisa rnuy amplio que contiene las enzimas necesarias para fabricar colesterol y para modificarlo dando Iugar a las honnonas (vease Figura 12-34).

El principal tipo celular del hfgado, el hepatocito, nos proporciona otto ejemplo. Es el principal lugar de produccion de parnculas lipoproteicas para la exportacion: estas particulas transportan los hpidos par la corriente-sangufnea a otros lugares del organismo. Lasenzimas que slntetizan los componentes lipfdicos de las lipoproteinas estan localizadas en la membrana del ER liso, la cual tambien contiene enzirnas que catalizan una serie de reacciones que destoxifican las drogas liposolubles y compuestos producidos por el metabolismo que resultan perjudlciales. Las reacciones de destoxificacion mas estudiadas estan catalizadas por la familia de enzimas de Ia familia de Ia citocromo P450, las cuales catalizan una serie de reacciones sabre drogas solubles en lfpidos a sabre metabolitos que de otto modo podnan acumularse a niveles t6xicos en las membranas celulares, y las convierren en moleculas suficientemente hidrosolubles como para abandonar la celula y ser secretadas por Ia orina, Puesto que el ER rugoso no puede albergar por sf mismo un numero suficlentemente elevado de estas y de otras enzimas necesarias para estos procesos, una proporcion importante de la membrana del hepatocito consiste normalmente en ER lisa (Figura 12 -.35 Y vease Tabla 12-2),

0/ ),

El reticulo endoplasmatteo

FigUra 1.2·33 Rihosomas Iibres y unidos a membrana, Tanto para stntetizar las protefnas que permaneceran en el citosol como para stntetizar las que seran transportadas al ER, se utillza el misma acervo de rfbosomea La que clirige al ribosoma correspondlente a la membrana del ER es Ia presencia del peptide serial para ER en la cadena p.oiipeptfdica que se esta sintetizando. La molecule de mRNA puede permanecer unida al ER, formandc pane de un pollrnbosoraa, mientras que los ribosomas que se van desplazando sabre ella son reciclados: al final de cada ciclo de sfntesls.de proteina, las subunidades del ribosoma se liberan volviendcse a incorporar al acervo coman del citosol;

Flguea 12·34 Abundante -ER lise en una celula secretora de hormonas esteroldeas, Bsta electronrnlcregrafla esde una celula de Leydig secretora de testosterona de los testfculos humanos,

619

Cuando la circnlacion recibe grandes cantidades de ciertos compuestos, tales como la droga fenobarbital, el hfgado sintetiza en cantidades extraordinariamente elevadas las enzimas de destoxificacion, y en unos cuantos dias el ER lisa duplica su area superficial. Tras La eliminaci6n de la droga, el exceso de rnembranas del ER lisa parece eliminarse especfficamente a traves de un proceso de" pendiente de Usosomas Hamado autofagocitosis (expticado en el Capitulo 13). Se desconoce c6mo se regulan estos espectaculares cambios,

Otra funci6n del ER en la mayo ria de celulas eucariotas es .la de secuestrar Ca2+ deJ citosol. La liberacion de Ca2+ en el citosol a partir del ER, y su posterior reeaptura, median muchas respuestas rapidas a Jas senales extracelulares, como se explicaen el Capitulo 15. EI almacenamiento de Ca2+ en el lumen del ER esta faeilitado por las altas concentraciones de protelnas de union a Ca2+ presentee en el ER. En algunos tipos celulares, quizas en la mayorfa de ellos, existen regienes especfficas del ER especializadas en el almacenamiento de Ca"+. Por ejernplo, las celulas musculares tienen una abundante regi6n especializada del ER liso, lIamada reticula sarcoplasmatico, la eual secuestra Ca2+ del eitoso1 por medio de una ATPasa de Caz+ q!le bombea Ca2+; Ia liberaci6n de Ca2+ y la posterior recaptaci6n del Ca2+ por el reticulo sarcoplasmarico median la contracci6n rapida y la relajaci6n de 1a miofibrillas durante cada ciclo de contraccion muscular (explicado en el Capitulo 16).

A continua cion explicaremos las dos funeiones mas import antes del Ell: la sfntesis y modificaci6n de protemas, y La sintesis de lipidos.

Las regiones lis as del E~ pueden separarse de las rugosas

mediante centrlfugacion'" '

Para estudiar las fundones y las caractensticas bioqufmicas del retfculo endoplasmatico, es necesario aislar su membrana. A primera vista, 8StO puede parecer una tarea Imposible ya que el ER esta extraordinariamente entremezclado con otros componentes del citoplasma. Afortunadamente, cuando se rompen par homogeneizaci6n los tejidos 0 celulas, el ER se fragmenta en numerosas vesiculas pequefias y cerradas C~lOO nm de diametro), denominadas microsomas, que resultan reIativamente faciles de puriflcar, Los microsotnas derivados del ER rugosa estan tapizados de ribosomas, y reciben el nombre de microsomas rugo- 50S. Los ribosomas se encuentran siempre en la superficie exterior de dichos O1icrosomas, siendo su interior btoquimtcamenteequlvalente a! espacio luminal del ER (Figura 12-.36). Dado que pueden ser purificados en su forma funcional, los microsomas rugesos son especlalmente utiles para el estudio de muchos procesos que realiza el ER rugosa. Para el btoqufmico representan autenticas pequefias versiones del ER rugoso, todavfa capaces de sintetizar protetnas, glucosilar protemas y sintetizar lipidos.

620 Capitulo 12 : Compartl:rnjentos intracelulares y clasificad6n de protefnas

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"l -,

Figura 12-35 Reconstrucci6n tridimensional del ER rugosa y Uso de una celula hepatica. El ER rugoso forma ordenados montones de cistsmas planas, cada una de las cuales tiene un espacio luminal de ente 20 y 30 nm de ancho, La membrana del ER lisoesta conectada a estas cisternas y forma una.flna red de tubules de entre 30 y 60 om de dlametre. (De R.V. Krstic, Ultrastructure of the Mammalian Cell. New York: Springer-Verlag, 1979.)

l________j 200 nm

l________j 200 nm

(8)

(AI

Figura 12-36 Electmnmlerograflas de rfbosomas, Cuando se rompen celulas par homogeneizacidn, las clsternas del ER rugosa CA) se fragmentan formando pequeiias vesiculas cerradas, denominadas microsomas rugosos (B). De forma similar, el ER lisa se ftagmenta formando pequenas vesiculas que carecen de ribosomas, y que se denomlnan microsomas lisos. (A, cortesta de Daniel S. Friend; S, cortesfa de George PaJade.)

En estos homogenados tambien se encuentran much as vesiculas de tamafio similar al de los microsomas rugosos, pero sin ribosomas unidos a ellas. Estos microsomas lisos derivan en parte de porciones lisas del ER y en parte de fragmentos vesiculados de la membrana plasmatica, del complejo de Golgi, de los endosomas y de las mitocondrias (la proporci6n depende del tipo de tejldo de que se trate): Por consiguiente, mientras que los microsornas rugosos pueden SeI equiparados a porciones rugosas del ER, los ortgenes de los microsomas lisos no resultan faciles de determinar, Una excepcion importante la constituye el higado. Debido a las enormes cantidades de ER liso existentes en el hepatocito, la mayor parte de los microsomas lisos de los homogenados hepaticos derivan del ERliso.

Como los ribosomas contienen grandes cantidades de RNA, los microsomas rugosos son mas densos que los microsomas lisos, Par consiguiente, los microsomas rugosos pueden separarse de los demas mediante una centrifugaci6n en

'equilibrio (Figura 12-37). Cuando se comparan propiedades tales como la actividad enzimatica 0 la composicion polipeptfdica de los microsomas rugosos con las de los lis as obtenidos de un tejido como el hfgado, se observa que son notablemente similares, aunque no identicas: aparentemente Ia mayoria de los componentes de la membrana del ER pueden difundir libremente entre las regiones rugosa y lisa de la membrana, tal como cabrla esperar de un sistema de fluja continuo de membrana. No obstante, los microsomas rugosos presentan mas de 20 protefnas que no estan presentes en los microsomas lis as, demostrando que debe de existir algiin mecanismo restrictive para un conjunto de protemas de la

FIgura 12-37 Procedbniento de atslamlento utilizado para purlflcar mtcrosomas rugosos y lisos a partir del ER. Cuando los dos tip os de rnlcrosomas se sedimentan hasta el equilibria a traves de un gradiente de sacarosa, se separaran uno de otro en base a sus diferentes densidades.

000 0°0'"

a "

oOO~

0°00

~?O

microsomas llsos

y mlcrosomas

los microsomas lisos

Q tienen menor densldad, por 10 que dejan de sedlmentar y flotan a con centrac io n es menores de sacarcse

mezcla

centrifugacion

los microsomas rugosos tiensn una elevada densidad, por 10 que dejan de sedimentar y

fl ota n a co ncentra cion as de saearosa elevadas

, ,

rugosos

tubo con un gradiente de concentraciones

creclentes de sacarcsa " l

621

EI retfculo endoplasmatico

membrana del ER. Algunas de las protefnas de este conjunto ayudan a mantener unidos los ribosomas al ER rugoso, mientras que otras posiblemente producen la forma aplanada de esta parte del ER (vease Figura 12-35). No esta claro S1 estas protefnas de membrana son retenidas formando gran des agregados bidimensionales en la bicapa lipfdica 0 por el contrario son mantenidas en su lugar mediante interacciones con una red de protemas estructurales en una u otra cara de la membrana del ER.

Los peptidos serial fueron descubiertos por primera vez en protefuas importadas al ER27

Los peptidos senal (y can ellos la estrategia basada en la utilizaci6n de un peptido serial para dirigir el transporte de protefnas) fueron descubiertos par primera vez, a principles de los afios 70, en protefnas de secreci6n que son translocadas a traves de la membrana del ER como primer paso hacia su final descarga de la celula, En el experimento clave el mRNA codificante de una protefna de secreci6n fue traducido mediante 'ribosornas in vitro. Cuando de este sistema Iibre de celulas se omitlan los microsomas, la protelna sintetizada era ligeramente mayor que la protefna normal secretada; esta longitud extra era debida a la presencia de un peptido lider amino terminal. No obstante, en presencia de microsomas derivados del renculo endoplasmatico rugosa se producia una proteina de tamano correcto. Estos resultados fueron explicados mediante la hip6tesis de La sefial, la cual postulaba que la secuencia Ifder acttia de pepttdo seiial dirigiendo la protefna de secreci6n hacia la membrana del ER; una vez en ella y antes de que la cadena polipeptidica este completa, el peptide es hidrolizado por una peptidasa de serial de la membrana del ER (Figura 12-38).

De.acuerdo con la hip6tesis de la serial, la protefna secretada ha de ser empujada allumen del microsoma durante su sfntesis in vitro. Esto puede ser demostrado mediante un tratamiento can proteasas: una proteina recien sintetizada fabricada en ausencia de microsomas es degradada al anadir una proteasa, mientras que la rnisma protefna pero fabricada en presencia de microsornas permanece intacta, a consecuencia de la protecci6n que Ie proporciona la membrana microsomal. Cuando en un sistema in vitro similar a este se traducen protefnas que carecen de peptide serial, estas protefnas no, son importadas a los microsomas y par 10 tanto permanecen susceptibles al tratarniento con proteasas.

La hipotesis de la serial ha sido comprobada cuidadosamente mediante experimentos geneticos y bioqufmlcos, y puede aplicarse tanto a celulas vegetales

622 Capitulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificaci6n de protefnas

Figura 12-38 La hipdtesls selial original. Vision simplificada de 1a translocaclcn de una protefna a traves de la membrana del ER, tal como se propuso originalmente. Cuando el peptide sefial emerge del ribosorna, dirige al ribosoma bacia un receptor proteico de la membrana del ER,. SI'! postula que a medlda que va siendo sintetizado, el polipeptido se va translocando a traves de la.membrana del ER rugosa, atravesando un poro proteico asociado con el receptor. El peptide serial es eliminado durante el proceso de traducclon y Ia proteina madura es liberada allumen del ER inmediatamente despues de ser sintetizada, En la actualidad sabemos que en terminus generales la hip6tesis es correeta, peto adernas de los componentes que se muestran en esta figura, son necesarios otros. Par ejernplo, la peptidasa de sefial es un complejo formado por cinco diferentes eadenas polipepndicas unidas ala membrana, con un complejo aparentemente asociado can cada porn de translocaci6n.

como animales, a translocaciones protelcas a traves de membranas plasmatic as de procariotas y, como hemos visto, a las membranas de mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas, Ademas, los peptidos Iider amino terminales gufan no s610 Jas protefnas de secreci6n sino tam bien los precursores de todas las proteinas fabricadas en el ER, incluyendo las protefnas solubles y las protefnas de membrana. La fund6n de senalizacion de estos peptidos lfder hasido demostrada directamente mediante Ja utilizacion de tecnicas de DNA recombinante, uniendo secuencias senal a proteinas que normalmente no las presentan; las proteinas de fusion resultantes son dirigidas al ER.

Los sistemas lib res de celulas en los que se produce transports de proteinas han proporcionado poderosos procedirnientos de ensayo para identificar, purificar y estudiar los diversos componentes de la maquinaria molecular responsable del proceso de importaci6n de protefnas al ER.

Una particula de reconocimiento de sefial (SRP) dirige los peptidos sefial para el ER a un receptor especffico de la membrana del ER26

El peptide serial es dirigido a la membrana del ER par 10 menos mediante dos componentes: una particula de recanoc1miento de la sefial (SRP, de Signal-Recognition Particle"), que se nne al peptide sefial y viaja de forma cfclica entre Ia membrana del ER y el citosol, y un receptor de SRP, tambien conocido como proteina desembarcadero (docking), presente en la membrana del ER. La SRP fue descubierta al observarse que lavando rnicrosomas con solucion salina se eliminaba su capacidad de importar protefnas de secreci6n. Esta capacidad de importaci6n puede restablecerse afiadiendo ala preparaci6n de mlcrosornas el sobrenadante que eontiene el extracto salino. A partir de este extracto se purific6 el "factor de translocacion" y se determin6 que era una partfcula compleja formada pOI seis cadenas polipepndicas unidas a una pequefia molecula de RNA (Figura 12-39). La SRP y el receptor de SRP estan presentes en todas las celulas eucariotas y tambien posiblemente en las celulas procariotas.

A medida que el peptide va emergiendo del ribosoma, la SRP se va uniendo al peptide senal, Esto provoca una pausa en la sfntesis proteica, lo que posiblemente da al ribosoma tiempo suficiente para unirse a la membrana del ER antes de que se complete la sfntesis de la cadena polipeptfdlca, asegurando asf que 1a proteina no se liberara al citosol. Esto puede proporcionar un mecanisme de seguridad ya que muchas protefnas de secreci6n y protetnas lisosomales son hidrolasas que pueden provocar estragos en el citosol. Las celulas que secretan grandes cantidades de hidrolasas taman la preeauci6n anadida de disponer de altas concentraciones de inhibidores de hidrolasas en su citosol.

Una vez formado, el complejo ribosoma-SRP se une al receptor de SRP, el cual es una protefna integral de membrana expuesta en la superficie citos6liea de la membrana del ER rugoso. Entonces Ia SRP es liberada, y un aparato de translocaci6n todavia poco caracterizado transfiere la cadena poLipeptfdica naciente a traves de Ia membrana (Figura 12-40). Dado que una de las protefnas SRP y ambas cadenas del receptor de SRP contienen dominios de uni6n a GTP, se cree'que los carnbios conformacionales que tienen lugar durante los cielos de uni6n de GTP e hldr6lisis (explicado en el Capitulo 5) aseguran que la liberaclon de la SRP tenga Iugar s610 despues de que el ribosoma se haya acoplado correctamente can el aparato de translocaci6n en Ia membrana del ER.

La translocaci6n a traves de la membrana del ER no siempre requiere que se este produciendo el crecimiento de la cadena polipeptidica 29

Como hemos visto, 1a translocaci6n de protefnas al interior de las mitocondrias, de los cloroplastos y de los peroxisomas es post-traduccional, es decir que se produce despues de que La proteina haya sido sintetizada completamente y se haya liberado al citosol, mientras que normalmente la translocaci6n a traves de

El reticula endoplasmatico

dominic de reeonoei miento del peptide senal

1IlIlfIBS~~~~~ ~

SAP RNA

lugar de union S R P·recepto r

25 nm

Figura 12-39 Dibujo muy esquematico de Ia partfcula de reconocimiento de la sefial (SRP). UnaSRP es un complejo alargado que contiene seis subunidades proteicas y una molecula de RNA (SRP RNA). Un extrema de la SRP se une a un peptide sefral de la cadena poJipeptidica en crecimiento, mientras que el otro extrema se une al ribosoma y frena la traducci6n. El RNA de la partfcula puede interactuar can el RNA ribos6mica. (Adaptado de V. Siegel y P. Walter, Nature 320:82-84, 1986.)

623

partfcula de reconocimlento de la senal (SRP)

SRP OESPLAZADA Y RECICLADA

peptide senal en la cadena polipeptldica naciente

protein a receptora de la SRP en Ie membrana

del ER rugosa .

Figura 12-40 De que forma los peptidos sefial y Is SRP dirigen los ribosomas a Is membrana del ER. Se cree que Ia SRP y eJ receptor de SRP actuan de forma concertada, La SRP se une aL peptide sefial que se halla expussto y aJ ribosoma, inducisndo una pausa en la traducci on. El receptor de SRP de Ia membrana del ER, que esta formado par dos cadenas polipeptidicas, une el complejo SRP-ribosoma. A traves de una eompleja reaccion todavia muy poco eonocida que implica multiples protetnas de uni6n a GTP, la SRP es Iiberada dejando al ribosoma sobre la membrana del ER. Entonces un aparato de translocaci6n de la membrana de) ER formado par varias subunidades proteicas lnserta la cadena pollpeptidica en la membrana y la transfiere a traves de 1a bicapa llpfdlca,

la membrana del ER sucede durante la traducci6n (es decir, es cotraduccionals. Esto explica por que los ribosornas se unen a la membrana de) ER pera no a Ia cara citoplasmatica de otros organulos. Un ribosorna unido al ER rugoso puede utilizar La energia de la smtesis proteica para forzar a la cadena polipeptidica en crecimiento a traves del canal formado por el translocador en la membrana del ER. Noobstante, estudios recientes de translocaci6n in vitro en el ER han demostrado que una pequeiia rninorfa de determinados precursores proteicos pueden ser importados al interior del ER despues de que se haya terminado su sfntesis, demostrando asf que la translocacion no siempre requiere de la traducci6n continua. La translocacion prateica post-traduccional puede tener lugar incluso de modo mas frecuente a traves de la membrana del ER en celulas de levaduras y a traves de Ia membrana plasmatlca bacteriana (la cual se cree esta evolutivamente relacionada con el ER; vease Figura 12-5). En ambos casos la translocacidn requiere hidr6lisis de ATP, yen bacterias tam bien es necesario un gradiente electroqufmico, A partir de componentes bacterianos se ha reconstituido un aparato de translocaci6n; uno de estos componentes es una ATPasa que se cree que ayuda a ensartar la proteina en la membrana (Figura 12-41). Dado que las proteinas que urillzan una ruta de translocaci6n post-traducctonal son liberadas primero en el citosol, su plegamiento se evita mediante su uni6n a protefnas chaperonas citos6licas, tal como hemos visto que sucede en la importaci6n post- traduccional hacia el interlor de mitocondrias y cloroplastos.

La cadena pollpeptfdica pasa a traves de un poro acuoso en el aparato de translocacion'"

Durante mucho tiempo se ha discutido si las cadenas polipeptfdicas son transferidas a craves de la membrana del ER, en contacto directo con la bicapa lipfdica o a traves de un poro de un' translocador proteico. En Ia actualidad exlsten fuertes evidencias de la existencia de un translocador proteieo. Normalmente, el

( , .. "'\
, --.z~ j
I 624 Capitulo 12 : Compartlmtentos Intracelulares y clasificaci6n de protefnas

complejo de' Ira nslocaclcn lmpulsado per

energla

poro del translocador esta tapado can la cadena polipeptidica que esta en transito a traves de la membrana. Sin embargo, cuando experimentalments las cadenas nacientes se liberan de los ribosomas mediante la droga puromicina, los poros pueden ser detectados mediante corrientes ionicas que fluyen a traves suyo. A pesar de que los poros son 10 suficientemente grandes para permitir el paso de una cadena polipeptidica desplegada, se eierran cuando el ribosoma es eliminado de la membrana (Figura 12-42). Por 10 tanto el para parece ser una estructura dinamlca, abriendose euando un ribosorna can una cadena polipeptidica naciente se une a la membrana y cerrandose cuando el ribosoma se libera despues de que la sfntesis de 1a protefna haya finalizado,

Elpeptldo senal del ER es eliminado de la mayorfa de protefnas solubles despues de la translocackirr"

Hemos visto que en los cloroplastos y en las mitocondrias los peptidos senal son eliminados de las protetnas precursoras despues de cruzar Ia membrana. De modo parecido, los peptidos amino tenninales serial para el ER son eliminados mediante una peptidasa senal situ ada en la cara luminal de la membrana del ER. Sin embargo, el peptide por sf mismo no es suficiente para que se produzca la hidrolisis de la sefial par la peptidase: se requiere un punto de hidr6lisis adyacente que es reconocido por la peptidasa, Mas adelante veremos que los peptidos senal del ER no se encuentran en el extreme amino terminal sino en el interior de la cadena polipeptfdica, no presentan estos puntas de reconocimiento y .nunea son eliminados. POI el contrario, sirven para retener protefnas transmembrana en la bicapa Ilpldica despues de que se ha terminado el proceso de translocaci6n.

El peptide amino terminal serial para el ER de una prateina soluble tiene por sf mismo dos funciones de sefializacion: ademas de dirigir la proteina ala membrana del ER, se cree que actua como senal de initio de trensferencia, perrnaneciendo unido al aparato de translocacion, mierrtras que el resto de.la pro-

CONTROL

lOS 10NES NO PUEDe PASAR A TRAV~S DEL TRANSLOCADOR PROTEICO

EXPERIMENTAL

lOS 10NES PASAN UBREMEt-lTE A TRAV~S DEL TRANSLOCADOR PROTEICQ

la purornlclna llbera la cadsna pclipeptldica del: rlbosorna

, /'

El renculo endoplasmattco

Figura 12·41 Translocacl6n de una protefna a traves de la membrana _plasmatica bacteriana. En este modele esquematico, despues de que un receptor del aparato de translocaci6n se haya unido al peptido senal amino terminal de una protefna, un translocador proteico Impulsado por energfa ernpuja Ia protefna iii. traves de la membrana, desplegando la cadena polipeptfdlea durante el proceso. La energfa es proporcionada pOI la hidrolisls de ATP y par un gradiente electroquimico iii. traves

de la membrana.

Figura 12-42 Demostracldn de la existencia de pores aeuosos de translocac16n protelca en la membrana del ER. El disefio experimental es similar al mostrado en la Figura 10-5, cop una bicapa llpfdica que separa dos compartlmientcs acuosos. Cuando se afiaden microsomas ragosos,a uno de los compartimientos, ocasionalmente se fuslonan con la bicapa lipfdica incorporando una porci6n de la membrana del ER (con ribosomas) ala bicapa Cuando se afiade la droga puromiclna (en azul oscuro) a este rnlsmo compartimiento, se une covalenternente al extreme carboxilo terminal de la cadena polipeptfdlca y la lib era del ribosome: en estas condiciones se pueden detectar pores de tatnafio untforme debido a tnerementos puntuales en la conductancia electrica a traves de la membrana tel Ilujo touico responsable del incremento en la conductancia electrtca se indica con laflecha amarilla). SIlos rfbosomas se ellminan de la membrana mediante Iavadoscon soluclones de ooncentraclon elevada de una sill, los poros no se detsctan, 10 cual indica que la union de los ribosomas son necesarios para abrlr (0 ensamblar) el poro (no se muesrra).

625

III ..

• ..

.. ..

translocador proteico inactivo

protei co activo

COOH

LA PEPTIDASA DE SEiilAL LIBERA LA PROTEfNA MADURA AL INTERIOR DEL LUMEN DEL ER

teina va atravesando la membrana y formando un gran bucle en el lumen del ER. Una vez que el extremo carboxilo ha pasado a traves de la membrana, el peptide serial es liberado del POIO de translocaci6n, hidrolizado por la peptidasa de sefial, y rapidamente degradado hasta aminoacidos mediante otras proteasas del ER, mientras que la proteina es liberada al interior del lumen del ER (Figura 12-43).

En las proteinas transmembrana de un solo paso, un peptide sefial interno permanece en la bicapa lipfdica como

una hence a que atraviesa Ia membrana'"

El proceso de translocaci6n de las protefnas destinadas a permanecer en la membrana es mas complejo que el de las protetnas solubles, ya que algunas zonas de la cadena polipepttdioa son translocadas a traves de la bicapa lipfdica mientras que otras no 10 son. Sin embargo, todos los tipos de inserci6n de las protein as de membrana pueden ser consideradas como variantes de la secuencia de fen6menos que acabamos de describir para la transferencia de proteinas solubles en la luz del ER. Empezaremos describiendo las tres vias a traves de las cuales las protefnas transmembrana de paso Unlco (vease Figura 10-13) son insertadas en el ER.

En el caso mas simple, un peptldo setial amino terminal inicia la translocacion igual que para eJ caso de una proteina soluble, pero un segmento adicional hidrof6bico de la cadena polipeptfdica frena el proceso de transferencia antes de que toda la cadena polipeptfdica se haya translocado. Este pepttdo de paro de transferenela ancla la protefna en la membrana despues de que el peptido sefial del ER (iniciador de transferencia) sea liberado del translocador y eliminado (Figura 12-44). El peptide de para de transferencia forma un solo segmento a helicoidal que atraviesa la membrana, con e1 extremo amino terminal de la proteina en la cara luminal de la membrana y el extrema carboxilo en la cara citos6lica.

En los otros dos casos el peptide sefial no se hallara en el extremo amino terminal de la protefna sino que es interno. AI igual que los peptidos sefial amino terminales, e1 peptide sefial interno es reconocido por la SRP, la cual sirve de puente entre el ribosoma que fabric a la proteina y la membrana del ER y actua como serial de inicio de transferencia que empieza la translocaclon de la proteina. Despues de liberarse del translocador, el peptide interno de inicio de trans-

. ,

626 Capitulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasificacldn de protefnas

Figura 12-43 Translecacien de una protetna soluble a naves de la membrana del ER. En este modelo hipotetico se postula que e1 rranslocador proteico de la membrana puede estar en dos estados alternativos -activo e inactlvo. Cuando se une un peptide serial para el ER (que aetna como iniciador de la transferencia) el translocador adopta un estado activo y comienza a transferir la cadena polipeptfdica a traves de La membrana lipfdica, como un bucle, Es este estado forma un poro acuoso a traves de la membrana que puede ser detectado electrofisiol6gicamente si la cadena polipeptfdica es liberada (vease Figura 12-4.2). Cuando la protein a ha side translocada completamente, el translocador revierte a una conformacton inactiva que ya no puede conducir iones a traves de la membrana, pero que esta abierto a la bicapa lipfdica, permitlendo que el peptido serial hidrof6bico difunda hacia el exterior de La bicapa, donde es rapidamente degradado. Para mayor claridad, en esta yen las dos figuras siguientes los ribosomas se han omitido del dibu]o.

• •

CITOSOL

lugsr de uni6n del peptide hidrof6bieo de paro de

I transferencta

luqar de union del peptide hidrof6bico de inieio de transterencla

LUMEN

protelna translocadcra

ferencia permanece en la bicapa lipfdica como una helice a que atraviesa la membrana. Sin embargo los peptidos internos de inicio de transferencia se pueden unir al aparato de translocacion en cualquiera de las dos direcciones, y la orientaci6n del peptide de inicio de transferencia insertado deterrnina, a su vez, que segmento proteico (el que precede 0 el que sigue al peptide de inicio de transferencia) se desplazara a traves de la membrana hacia ellumen del ER. En un caso la proteina de membrana resultante tendra su extreme carboxilo enia cara luminal (Figura 12-45A) mientras que en el otro en ellado luminal estara su extreme amino (Figura 12-45B). La orientaci6n del peptide de inicio de transferencia depende de la clistribuci6n de los aminoacidos cargados vecinos, tal como se describe en el pie de 1a figura.

Combinadones de sefiales de inicio y de paro de transferencia determinan Ia topologia de las proteinas trans membrana

de multipaso'"

En las protefnas transmembrana de multi paso la cadena polipeptfdica atraviesa repetidamente, de una parte a otra, Ia bicapa lipidica (vease Figura 10-13). Se cree que en estas protefnas un peptide sefial interne acnla como senal de inicio de transferencia iniciando la translocaci6n, la cual continua hasta que se alcanza un peptide de paro de transferencia. En las protefnas de doble paso, por ejemplo, el polipeptido se libera de la bicapa en este estadio (Figura 12-46). Las protelnas multipaso mas complejas, en las cuales existen muchas helices 0: hidrof6bicas que atraviesan La bicapa, un segundo peptide de inicio de transferencia reinicia la translocacion de la cadena, 1a cual se produce basta que se alcanza el siguiente peptide de final de transferencia, y asf sucesivamente para posteriores peptidos de inicio y de paro de transferencia (Figura 12-47).

Una secuencia sefial hidrof6bica determinada actuara como un peptide de inicio 0 de paro dependiendo de su localizaci6n en la cadena polipepttdiea, ya que se puede carnbiar su funci6n si se modifica su localizaci6n en la protefna utilizando tecnicas de DNA recombinante. As! la distinci6n entre peptidos de inicio y de paro de transferencia depende, fundamentalmente, del orden en el que se suceden en la cadena polipeptidica naciente. Parece que Ia SRP empieza buscando los segmentos hidrofobicos de la cadena poUpeptidica desplegada empezando por su extrema amino terminal, y va progresando bacia el extrema carboxilo terminal. en la misma direcci6n en 1a que se sintetiza la proteJ'na. La SRP reeonoce el primer segmento apropiado y par 10 tanto fija la "pauta de Iectura": si se ha iniciado la translocacion, el pr6ximo segmento hidrof6bico adecua-

El reticulo endoplasmatlco

Figura 12-44 Como se integra en la membranadell3R una protefna transmembrana de un solo paso con un peptido senal cortado. En este modelo hipotetico el proceso de translocaci6n cotranslocaci6n se Inicia por un peptide senal amino terminal de ER (raja) que aetna como una sefial de inicio de trarrsferencia, como en Ia Figura 12·43. Sin embargo. ademas del peptide de iniciO de transferencia Ia protetna contiene un peptide de para de transferencia (naranja). Cuando el peptide sefial de paro de transferencia entra en el translocador e Interacnia can un lugar de union determinado, el translocador pasa a su estado Inactivo y descarga Ia proteina lateralmente en la bicapa lipidica.

627

IA)

protefna rnadura en la membrana del ER

•

III ..

la secuencia senalse Inserta en direcci6n opuesta

18)

protelna madura en la membrana del ER

do sera reconocido como un peptldo de para de transferencia, ]0 cual originara que la regi6n de la cadena polipeptldica comprendida entre ambos segmentos hidrof6bicos resulte ensartada a traves de la membrana. Un proceso similar de busqueda continua hasta que todas las regiones hidrof6bicas de la protema se insertan en la membrana.

Puesto que las protefnas de membrana siempre son insertadas a partir de la cara citosolica del ER y siguiendo este sistema programado, todas las copias de la misma cadena polipeptidica tendran la misma orientaci6n general en 1a bicapa. Esto genera una membrana del ER asirnetrica en la que los dominios de protefna expuestos en una cara son diferentes de los que estan expuestos en la otra. Esta asirnetrfa se mantiene durante los divers as procesos de gemaci6n y fusi6n de membrana que se produeen at transportar las proteinas fabricadas en el ER a otras membranas eelulares (explicado en el Capitulo 13). Por 10 tanto la via por la cual una protema recien sintetizada es insertada en la membrana del ER determina la orientaci6n de la protefna tambien en otras membranas.

Cuando en el laboratorio se disocian protefnas de una membrana y se reconstituyen en vestculas lipfdicas artiflciales, generalmente se obtiene una mezcla al azar de orientaciones dentro-fuera de las proteinas, Par ella, parece que la asimetna de las proteinas que se observa en las membranas celulares no es debida a las propiedades inherentes de la proteina sino que es el resultado del proceso par el que las proteinas son insertadas en la membrana del ER desde el citosol.

628 Capitulo 12 : Compartimtentos intracelulares y claslflcacidn de protefnas

Figura 12-45 C6mo una protefna transmembrana de un solo paso con un peptide seiiallntemo se Integra en la membrana del ER. En este modelo hipotetico un peptido senal ER interne que actua como serial de inicio de transferencia se une al translocador de tal forma que su extreme cargado mas positivamente perrnanece en el citosol. Si enla cadena existen mas amtnoactdcs cargados positivamente inmediatamente antes del nuclen hidrof6bico del peptide de inicio de transferencia de los que hay despues de Ell, en el extreme carboxilo terminal, el pepttdo de lnlcio de transferencia se inserta en eJ translocador en la orientaci6n mostrada en (Al y el braze carboxilo terminal del bude insertado se desliza a traves de la membrana. Sin embargo, si existen mas aminoacidos cargados positivamente inmediatamente despues del nucleo hidrofoblco del peptide de inicio de transferencia de los que hay antes de el, en su extreme amino terminal, el peptide de inlcio de transferencia se inserta en e1 translocador en la orientaci6n mostrada en (Bl, y sera el brazo amino terminal del bucle Insertado el que Sf! deslfzara a traves

de la membrana, Debido a que la translocaci6n no puede iniciarse antes de que salga del ribosome una secuencia de inicio de translocaci6n, la translocaci6n de la porcion amino terminal de la protefna mostrada en (B) solamente puede ocurrir despuss de que se haya sintetizado completamente esta secuencia. N6tese que existen dos caminos para insertar UDa protefna transmemhrana de un solo paso cuyos amlnoacidos amino terminales se Iocallcen en ellumen

del ER: el que se muestra en la Figura 12-44 y el que se muestra aquf.

proteins rnacura de doble paso a traves de Iii membrana

Las cadenas polipeptidicas translocadas se pliegan y se ensamblan enelIumen del ER rugoso'"

Muchas de las protefnas presentes el lumen del ER solamente estan en transite, en rota hacia otros destines: sin embrago, otras residen normalmente en el ER y se hallan en elevadas concentraclones, Estas proteinas residentes del ER presentan en su extremo carboxilo terminal una sefial de retenci6n del ER, de cuatro aminoacidos, que es responsable de que la protema quede retenida en el ER (vease Tabla 12·3). Algunas de estas protefnas acnian como catalizadores que ayudan a otras muchas protetnas que son translocadas al ER a plegarse ya ensamblarse de forma correcta, Una de estas protefnas residentes del ER es Ia protetna disu,lfuro isomerasa (pDI), la coal cataliza la oxidaci.6n de los grupos sulfhidrilo libres (SH) formando enlaces disulfuro (S~S). La mayoda de los residues cistefna de los dominios proteicos expuestos al espacio extracelular a al lumen de los organulos estan unidos per puentes disulfuro. Sin embargo, los enlaces disulfuro no se fonnan en los dominios expuestos al citosol debido al ambiente reductor de este ambiente.

caOH

100

200

numero da arntnoacldos

(C)

IA)

j

m reticule endoplasmatico

Figura 12-46 C6mo se Integra en Ia membrana del ER una protefna de doble paso con una secuenela senal fnterna, En este modele hipotetlco un peptide senal para el ER interno aetua como una seiial de inicio de transferencla (como en la Figura 12- 45)e lniela 1a transferencla del braze carboxilo terminal de 1a cadena polipeptfdica. Cuando entra en el translocador un peptide senal de para de transferencia, descarga lataralrnente la proteIna en 1a membrana.

Figura 12-47 Insercldn de la protefna multipas9 de membrana rodopsina. en Ia membrana del ER. La rodopsina es la protefna sensible a la luz de los fotorreceptores de las celulas en bast6n de la retina de los mamfferos, (A) Un grafico de hidrofobicidad identifica siete cortas regiones hidrof6bicas en la rodopslna, (B) La region amino terminal aouia como peptide de inicio de transfsreneia, responsabls de que Ia regi6namino terminal anterior atraviese la membrana del ER. Los pepttdos hidrofobicos siguientes actuaran alternativamente de iniclo de transferenciay de paro de transferencia. eC) La rudopsina madura, una vez integrada, tiene su extreme amino terrninal lncalizado en el lumen del ER y su extremo amino terminallocalizado en el cltosol. Los hexagonos azules representan ollgosacaridns unidos covalentemente,

629

Otra proteina residente del ER es una proteina cbaperona conocida como protefna de union (HiP, de binding protein), que estructuralmente esta relacionada con las proteinas hsp70, y como elIas reconoce protefnas pJegadas incorrectamente, y tarnbien subunidades proteicas que no han sido ensambladas en sus complejos oligornericos finales. Se cree que BiP, aligual que otras protefnas chaperonas, se une a secuencias de amlnoacidos expuestos que normalroente estan escondidos en el interior de las cadenas polipepttdicas que estan correctamente plegadas 0 ensambladas, Cuando BiP se ha unldo evita 1a agregacton de las proteinas y ayuda a mantener las protefnas en el ER (Y por tanto fuera del complejo de Golgi y de otras etapas posteriores de la ruta S8 secreci6n); tambien ayuda a que las proteinas se plieguen correctamente, Como en el caso de las proteinas de la familia hsp70, las cuales unen protefnas no plegadas en el citosol y facilitan su importacion hacia las mitocondrias y bacia los cloroplastos, la protefna BiP hiclrolizaATP para obtener la energfa necesaria para p1egar las protefnas.

Como hemos visto anteriormente para la bsp70 mitocondrial (vease Figura 12-24). la union de BiP a una cadena polipeptfdica que esta emergiendo en el lumen del ER puede ayudar a estirar la proteina bacia el interior del ER. Este proceso puede ser particularrnente importante en proteinas que entran en e1 ER tras su traducci6n. ya que en este caso no existen ribosomas unidos a la membrana que empujen ala protefna naciente a traves del translocador durante su sfntesis,

La mayo ria de protefnas sintetizadas en el ER rugosa son glucosiladas por la adici6n de un N-oligosacarido comnn'"

La adici6n covalente de azucares a las protefnas es una de las principales funciones biosinteticas del ER. La mayona de las protefnas solubles y unidas a la membrana que son fabricadas en eJ lumen del ER. incluyendo las destinadas a ser transportadas al complejo de Golgi, a los lisosomas, ala membrana plasmatica 0 al espado extracelular, son glucoproteinas. Par el contrario, muy pocas protelnas del dtosol estan glucosiladas, y las que 10 estan contienen una modificad6n de aziicares muy simple: la adici6n de un grupo N-acetilglucosamina a un residuo serina 0 treonina de la proteina.

Un avance importante en la comprensi6n del proceso de glucosilacidn proteica fue el descubrimiento de que en el"ER se transfiere en bloque a las proteinas un oligosacarido preformado (compuesto de N-acetilglucosamina, manosa y glucosa y conteniendo un total de 14 residues de azucar), Dado que este oligosacarido siempre es transferido al grupo NHz de la cadena lateral de un residuo de asp aragina, se le denomina N-oligosacdrido (N-linked) o unido a asparagina (Figura 12-48). La transferencia esta catalizada por una enzima, una transferasa de oligosacdrida que se halla unida a la membrana, y cuyo lugar activo esta expuesto a Ia superficie luminal de 1a membrana del ER. 10 cual explica par que las protetnas citosolicas no son glucosiladas de esta manera. El oligosacarido precursor se mantiene en la membrana del ER mediante una molecule lipfdica especial llamada dolicol yes transferido ala asparagina diana a traves de una sola etapa enzimatica inmediatamente despues de que este aminoacido aparezca en ellumen del ER durante la translocacion de la proteina (Figura 12-49). Dado que muchas proteinas son importadas al ER de forma cotraduccional, casi siempre los N-oligosacaridos son-afiadidos durante la sfntesis proteica.

EI oligosacarido precursor unido a lipido se une al dolicol mediante un enlace fosfato de alta energta, el eual proporciona la energta de activad6n necesaria para Ia reacci6n de glucosilaci6n ilustrada en la Figura 12-49. EI oligosacarido se va construyendo antes de ser transferido a la protefna, azucar a azucar, unido a esta molecula de lipido que, a su vez, esta unido a la membrana. Los azucares son activados primero en el citosol mediante la formacion de intermediarios azucar-nucleotido, que ceden su azucar (directa 0 indirectamente) al lipido, siguiendo una secuencia ordenada. En parte a traves de este proceso, el oligosacaride unido al lipido es translocado desde la cara citos6lica a 1a luminal de la membrana del ER (Figura 12-50).

630 Capftulo 12 : Compartimientos intracehilares y dasificaci6n de protetnas

H 0 I n

- c - c __ ·txJ·.J Ser

I I I llhr

Hj CH2

caderra late,ral t =0 de asparagine I

NH

glucosa ~ rnanosa » • N-3cetil glucosamina - 0

Figura 12-48 Estructura del oUgosac8rido unido a asparagina (unIdo a N) que es aiiadido ala mayoda de las protefnas en la membrana del ER rugoso. Los cinco residues de azucar mostrados en el recuadro gris forman la "region central" de este oligosacarido. En el complejo de Golgi se produce una profunda reordenacidn y recorte de los azucares y en muchas protefnas unicamente sobreviven a este proceso estos cinco residues. Solamente se glucosilan las asparaginas que se halJan en la secuenciaAsn-X-SeroAsnX - Thr, siendo X cualquier aminoacido que 'no sea la prollna, Estas dos secuencias sepresentan en frecuencias mucho menores en gJucoprotefnas que en protefnas citos6licas no glucosiladas; evidentemente ha habido una presion selectlva en contra de estas secuenclas durante Ia evoluci6n de las prntefnas, probablemente porque la glucosilacion en demasiados restduos podrla interferir con el plegamiento de la protefna.

blcapa lipldlca de la membrana del ER

LUMEN

CITOSOL

"SAL TO" (" FLIP-FLOP" I EN LA MEMBRANA

(G IcNAch(Mani5

dador de rnanosa, construldo a partir de dollcol fosfato y de GDP-manosa

dador de glucosa construido a partir de dolicol fosfato y UDP-glucosa

(Glc)3(Man)g(GlcNAc)l

El reticulo endoplasmatico

Figura 12-49 Glucosi1a.cI6n de una protefna en el ER. Casi inmediatamente despues de que Ia cadena polipeptfdica entre en el lumen, se glucosila sobre los residues de asparaguina diana. El ollgosacarido que se muestra en La Figura 12-48 se transfiere ala asparagulna como una unidad intacta, a traves de una reacci6n catalizada por la oUgosacaril transferasa, una enzima unida a membrana. Existe una copia de esta enzlma asociada con cada translocador proteico de la membrana del ER.

Figura 12-50 Sfntesis del precursor del oUgosaclirido unldo a Upldo de la de la membrana del ER rugoso. EI ollgosacarido se va construyendo azucar a azucar, sobre ellipido transportadcr dolicol (un politsoprenolde, vease Panel 2-4). El doli col es largo y muy hidrof6bico: sus 22 unidades de cinco carbonos pueden atravesar e1 grosor de la btcapa Hptdica mas de tres veces, de forma que e1 oligosacarido que se une al el queda firmemente anclado a La membrana. EI primer gmpo de azucar se une al dolicol a traves de un enlace pirofosfato. Este enlace de alta energfa activa el oligosacarido para su transferencia desde ellfpido hasta una cadena lateral de la asparagina de un polipeptido naciente sobre La eara luminal del ER rugoso. La sfntesls del oligonucle6tido comienza en la cara citos6lica de la membrana del ER, y continua sobre la cara luminal, despues de que el lfpido intermedlario (Man), {GIcNAc}z haya sido transferido (por flip-flop) a traves de la membrana. Todas las reacclones posteriores de transferencia de glucosllos que se producen en Ia cara luminal del ER se producen a partir de dolfcol-Pcglucosa y de dcllcol- Pmanosa;estos monosecandos, untdos a llpidos, que se hallan activados, se sintetizan a partir de doli col fosfato y de UDP-glucosa 0 GDP·manosa sobre la cara citos6lica del En. y posteriormente, segnn parece, son transportados (por flip-flop) a naves de 1a membrana del ER. Abreviaturas:

GJcNAc = N-acetilglucosamina; Man = manosa; Glc '" glucosa,

631

Toda Ia diversidad de estructuras de N-oligosacandos que se presentan en las glucoprotetnas maduras se produce por modificaci6n posterior de la estructura de oligosacarido precursora. Todavia en el ER, se eliminan de los oligosacaridos de muchas glucoprotefnas tres residuos de glucosa y uno de manosa (vease Figura 12-48). Estos "recortes" 0 "procesamlento" del oligosacarido contimlan en el complejo de GoIgi, y se explican en el Capitulo 13.

Los N-oligosacciridos son, con gran diferencia, los oltgosacartdos mas cornunes de los que se encuentran en las glucoprotefnas. Menos frecuentemente, los oligosacarrdos estan unidos al grupo hidroxilo de la cadena lateral de un residue de serina, de treonina 0 de hidroxilisina. Estos O-oJigosacdridos se forman en el complejo de Golgi a traves de vias que aun no son conocidas completarnente (se disc ute en el Capitulo 13).

Algunas protefnas de membrana, poco despues de entrar en el ER, intercambian una cola transmembrana carboxilo terminal por un glucosilfosfatidilinositol (GPI) unido de forma covalente'"

Como hemos explicado en el Capitulo 10, algunas enzimas citos6licas catalizan Ia adici6n covalente de un acido graso a determinadas protefnas, colaborando en la direccionalidad de estas protefnas hacia las membranas celulares. En el ER rugosa se produce un proceso catalizado par enzimas relacionado can este: el extreme carboxilo de algunas protein as de membrana destinadas a la membrana plasmatica se unen de forma covalente a un residuo de aziicar de un glucolfpido. Esta union se forma en ellumen del ER a traves del mecanisme ilustrado en Ia Figura 12-51, y anade ala proteina un anclaje de glucosilfosfatidllinositol (GPI, de glycosylphosphatidiltnositoll que contiene dos acidos grasos. En el mismo proceso se elimina el segmento transmembrana de las protetnas, Cada vez es mayor el mimero de protefnas conocidas de la membrana plasmatica que son modificadas de esta manera. Dado que estas protefnas estan unidas al exterior de la membrana plasmatica exclusivamente a traves de su anclaje GPI, en principio pueden ser liberadas de las celulas en forma soluble en respuesta a setiales que activen una fosfolipasa de Ia membrana plasmatica, Por ejemplo, los parasitos tripanosoma utilizan este mecanismo para liberar su cubierta de protefnas unidas a GPI si son atacados por e1 sistema inmunitarlo.

La. mayoria de las bicapas lipfdicas de membrana son ensambladas en el ER37

La membrana del ER produce casi todos los lfpidos de membrana necesartos para la elahoracion de nuevas membranas celulares, incluyendo los fosfohpidos y el cole sterol. El principal fosfolipido fabricado es la fosfatidilcolina (tambien

eOOH glucosil fosfatidili nositol

protelna unida covalentemente s un IIpldo que laancla a Ie membrana

632 Capitulo 12 : Compartlmientos intracelulares y clasificaci6n de protefnas

Figura 12-51 Union a un andaje de glucosllfosfatidilinositol. En cuanto la stntesls de la proteina ha finalizado, la proteina precursora permanece unida a le membrana del ER a traves de una secuencia hidrofoblca carboxilo terminal de entre 15 y 20 residuos de amtnoactdo, de forma que el resto de la protefna q ueda en ellumen del ER. En menos de un minuto, una enztma del ER corta la protema, liberandola de su extremo carboxflo terminal, que la unfa a la membrana, Y simultaneamente une el nuevo extrema carboxilo terminal a un grupo amino de un intermediario glucosilfosfatidilinositol preformado, La serial que especifica esta modificaci6n se halla contenida en la secuencla hldrofd biea carboxilo terminaJ y en algunos aminoactdos adyacentes a ella sobre la cara luminal de la membrana del ER; sl esta sefial es afiadida a otras protefnas, estas tambien son modlficadas de esta forma. Debido a este anclaje lipidico al que se une de forma covalente, la protetna permanece unida a la membrana; todos sus restos de aminoacido se hallan expuestos ala cara luminal del ER y, por Io tanto, sobresaldran hacia el exterior celular si la proteina es transportada a la membrana plasmatica,

cr

CH2-CH-CH2

.. I I

OH OH

glicerol 3·fosfato

COP-colina

sell graso CoA

CMP

CITOSOL

OH

I

CH2-CH-CH2

I I

o 0

biceps lipldlca del ER

LUMEN

llamado lecitina), que puede formarse en tres etapas a partir de dos acldos gra- 50S, glicerofosfato y colina. Cada etapa esta catalizada por enzimas de la membrana del ER que tienen sus lugares activos dispuestos hacia el citosol, donde se encuentran los metabolitos necesarios. Por 10 tanto las sfntesls de fosfolfpidos tiene lugar exclusivamente en la mitad citos6lica de la bicapa Iipfdica, Ella primera etapa, las acil transferasas aiiaden consecutivamente dos acidos grasos al glicerofosfato produciendo acido fosfatidico, un compuesto que es suficientemente insoluble en agua como para permanecer en la bicapa lipidica despues de ser sintetizado. Esta etapa es la que hace crecer la bicapa lipfdica. Las otras etapas posteriores determinan el grupo de cabeza de la rnolecula lipidica reclen sintetizada, y por 10 tanto la naturaleza qufmica de la bieapa, pero no suponen un crecimiento neto de la membrana (Figura 12-52). Los otros dos fosfolfpidos mayoritarios de membrana -la fosfatidiletanolamina (PE) y la fosfatidilserina (PS)- al igual que el fosfolfpido minoritario fosfatidilinositol (PD, son slntetizados de esta man era.

Como la sfntesis de fosfolfpidos tiene lugaren la mitad eitos6lica de la bicapa lipfdica, ha de existir un mecanisme que transfiera alguna de las molecules de fosfolfpido recien sintetizados hacia la otra mitad de la bicapa. En bicapas lipfdicas stnteticas, los lipidos no son capaces de "saltar" ("flip", de flip-flop) de esta manera. En el ER, sin embargo, los fosfolipidos se equilibran a traves de la membrana en cuesti6n de minutos, 10 eual es al menos unas 100 000 veces mas rapido de 10 que puede representar el flip-flop espontaneo, Se cree que este movimiento rapido transbicapa esta rnediado por translocadores de fosfolipidos especfficos de grupos de eabeza. Concretamente, parece que la membrana del ER eontiene un translocador (una "jlipasa") que transfiere, entre la cara citoplasmatica

Figura 12-52 Sfnte!jois de fosfatldilcollna. Este fosfolfpido es sintetizado a partir de acil coenzima A (acil graso CoAl, glicerol3-fosfatoy citidfn -btsfosfocolina (CDP-colinaj.

El retfculo endoplasmatlco

633

y 1a cara luminal, fosfohpidos que contengan celina -pero no etanolamina-, serina, 0 fosfolipidos que contengan inositol. Esto signiflca que la fosfatidilcolina alcanza la cara luminal mucho mas rapldamente que los otros fosfolipidos. De esta forma el translocador mantiene la bicapa y es responsable de la distribuci6n asimetrica de los lipidos en la bicapa (Figura 12·53).

El ER tamhien produce colesterol y ceramida. La ceramida es fabricada por condensaci6n del aminoacido serina con un acido graso hasta forma el amino alcohol esfingosina; .luego SEl afiade un segundo acido graso, formandose la ceramida. La ceramida es exportada al complejo de Golgi, donde aetna como precursor de 1a sfntesis de dos tipos de Hpidos: se afiaden cadenas de oligosacarldos formando los giucoesfingoltpidos (glucoltpidos), y se transfieren los grupos de cabeza de la fosfocolina des de la fosfatidilcolina a otras molecules de ceramida, formando esfingomielina. Ast, ambos glucollpidos y la esfingomielina son producidos relativamente tarde en el proceso de sfntesis de membrana. Dado que son producidos por enzimas expuestas allumen del complejo de Golgi, S8 encuentran exclusivamente en la mitad no citosrilica de las bicapas lipfdicas que los presentan.

Las proteinas de intercambio de fosfolipidos pueden transportar fosfolfpidos des de el ER a las mitocondrias y a los peroxisomas"

Como se discute en el Capitulo 13, la membrana plasmatic a y las membranas del complejo de GoIgi, de los lisosomas y de Los endosomas forman parte de lUl sistema de membranas que se comunica con e1 ER por medio de vesiculas de trans porte que transfieren tanto las protefnas como los Iipidos. Las mitocondrias, los pJastos y los peroxisomas no forman parte de este sistema, par 10 que requieren mecanismos diferentes para la importaci6n de protefnas y de lfpldos necesaria para su crecimiento, Ya hemos visto que la mayorfa de las proteinas de mitocondrias y plastos y todas las de los peroxisornas son importadas post-traduccionalmente desde el citosol. Aunque las mitocondrias modifican algunos de los lfpidos que importan, no sintetizan lfpidos de novo; en cambio, tienen que obtener estos ltpidos por transferencia desde e1 ER, donde son sintetizados, 0 tienen que obtenerlos de forma menos directa desde el ER por medio de otras membranas celulares, En cualquier caso son necesarios mecanismos especiales para que se produzca la transferencia.

En experimentos in vitro se ha demostrado que unas protefnas de transporte solubles en agua -Ilamadas protefnas de intercambio de fosfolfpidos (0 proteinas detransferencia de fosfolipidos)- tienen 1a capacidad de transferir rnoleculas incUviduaies de fosfeltpidos entre membranes. Cada protefna de intercambio reconoce solo determinados tipos especfficos de fosfolipido. La transferencia entre bicapas lipidicas se produce cuando la protefna "extrae" una molecule de fosfolfpido de una membrana y luego difunde pOI la celula con ellfpido "enterrado" en su lugar de union. Cuando encuentra otra membrana, la pro teina de tntercambio tiende a descargar Ia rnolecula de fosfolfpido en la nueva bicapa (Figura 12·54). Se ha propuesto que la fosfatidilserina es importada a la mitocondria de esta manera, siendo Iuego descarboxilada para recuperar 1a fosfatidiletanolamina, mientras que 1a fosfatidilcolina es importada Intacta,

Las protefnas de intercambio actuan distribuyendo fosfolfpidos al azar entre

. todas las membranas de 1a celula, En principio, de este proceso de intercambio al azar puede resultar un transporte neto de lfpidos desde una membrana rica en determinados lipidos a otra pobre en ellos, permitiendo que las molecules de fosfatidilcolina y fosfattdilserina, por ejemp\o, sean transferidas desde el ER, donde son sintetizadas, hasta la membrana mitocondrial 0 hasta la membrana peroxisomal. Puede ser que las mitocondrias y los peroxisomas sean los unicos organulos "pobres en lfpidos" del citop1asma y que un intercambio de este tipo sea suficiente, aunque pueden existir otros mecanismos mas especfficos que transporten fosfolipidos a estos organulos.

634 Capitulo 12 : Compartimientos Intracelulares y clasificaci6n de protemas

.~.~". } btcapa lipidica

gn l~ )I}~\ aslmetrtca del

~J "I reticula

o 0 endaplasmatico

010' l LA SiNTESIS DE LfPIDOS AI'ilADE IIJI !\II· FOSFOLlplDOS A LA MITAD CITOSOLICA DE LA BICAPA

~~~ftrl'~

j UNA PROTEiNA ESPECiFICA CATALIZA EL ~SALTO" ("FLIP") DE DETERMINADAS MOL~CULAS DE FOSFOLlplDO DESDE LA MITAD CITOSQLlCA A LA MITAD

[~f~~ LUMINAL

~H~l~U } :~~:~~~::.

rom;;; J:E'ER

Figura 12·53 Papel de los translocadores Jipidico!l en la biosintesis de la bicapa lipidica. Las nuevas molecules lipfdicas se van afiadiendo exc1usivamente ala mitad citos6Uea de la bicapa y no pueden "saltar" (flip) de forma espontanea de una monocapa lipidica a la otra, Por ello, para que se produzca la transferencia de determinadas rnoleculas a la mitad luminal y asi la membrana pueda creeer como una bicapa, se haee necesaria Ia participacion de proteinas translocadoras de fosfolfpidos ("flipasas"). Debido a que la flipasa de la membrana del Ell. reconoce preferentemente y transfiere grupos de cabeza que contengan colina, se genera una membrana asimetrica con la monocapa luminal (la cual produce la mitad exterior de la bicapa de la membrana plasmatica) altamente enriquecida en fosfatidilcolina.

FIgura 12-54 Protefnas intercambiadoras de fosfoUpidos. Debido a que los fosfolfpidos son insolubles en agua, su transferencia entre membranas requiere la participacidn de una protefna transportadora. Las protefnas de lnterearnbio de fosfolfpidos son moleeulas htdrosolubles que transportan una sola molecula de fosfolfpldo ala vez: pueden tornar una molecule lipidica de una membrana y llberarla en otra membrana, redistribuyendo asf

'los fosfolfpidos entre los compartimientos rodeados de membrana. La transferencla de fosfatidiJ.colina (PC) desde el ER hacia la mitocondria puede ocurrir, en princlpio, sin aporte exterior de energfa debido a que la concentracion de PC-es alta en la membrana del ER (donde se sintetiza) y baja en la membrana mltocondnal estema, Puede predecirse que debe existir una £1ipasa en [a membrana mitocondrial enema que equilibre las enneentracinues de Ifpidos entre las dos rnitades de la mernbranas enema, y un mecanismo de transferencia de llpidos entre la membrana.mitocondrlal extema y la Interna. Sin embargo, estos procesos todavfa no se han descubierto.

Resumen

La extensa red del ER actaa de fObrica de producci6" de cast todos los Upidos ceiulares. Ademds, la mayor pa;rte de La s(ntesis proteica celular tiene lugar en La superjicie citos6Uca del ER: todas las protetnas destintJdas a la secreci6n y todas las proteinas destinadas al propio ER,,,l compltUo de Golgi, a los lisosomas, a los endosoma« y a la membtal.la plasmdtit;a, primero son import~ al interior del ER desde el cttosol:

En eIlllmen del ER las ptorefnas se. pliegan y oligolf1erlzan, se forman los enlaces disUlfuro y seafiaden los N -oligosataridos.

S6loson tmportadas al interior del ER las proteinas que presentan un peptido senal hidrof6bico. EI piptido senates reeonoeido por una. part£cula de reconocimiento de selial (SRP, de Signal Recognition Particle) que se une a la cadena polipeptfdtca naciente y al ribosoma y dirige todo el con junto a una protefna receptofa de fa superj'icie de La membrana del BR. Bsta uni6na fa membrana inicia un proceso de n-anslocact6n que arrastra un buck de La cadena polipeptldica a. traves de la memarana del ER a traves de un poro hidroftlioo de una protetna translocadora;

Las proteinas soluble» destinadas al lumen del ER, a ser secretadas a a ser transferidas a.llumen de otros organulos, primero paean completamente al interior del lumen del ER. Las proteinas transmembrana destinadas al ER 0 a otras membranas de la citula, son translocadas a trav~ de la membrana del ER pero no son liberadas al interior del lumen sino que permanecen aneladas a fa bicapa a traves de una 0 mas regiones de su cadena polipeptfdtca, o.-heljcoidaks, que atrauiesan fa membrana. Bstas porcione« hidrofObicas de la proteina pueden actuar durante el proceso de translocaci6n,bten como peptido de inicto de trans!ere,u:ia 0 bien como seiial de paro de transfere.ncia. Cuando un polipeptido contiene varios peptidos de inicio de transferenCia y de paro de transferencia; atralJesara machos voces fa hicapa.

La. asimetria de la sintesis de lfpidos, inserci6n proteica y glucosilaci6n en el ER estableee la polaridad de las membranas de todos los demds organulos que son abastecidos con lfpidos y protefnas de membrana por el ER.

El retfculo endoplasmatlco

membrana mitocondrial

cltos 0 I exte rn a

membrana del ER ~'-~~~------~r~~~

grupo de cabeza de la fosfatldllcollna

protelna lntercarnbladcra de fosfol fpidos

635

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