REMEDIACION

FITOBACTORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS POR
DERRAMES DE CRUDO
MILTON FAJARDO MANTILLA

miltonfajardom@gmail.com
939-358-1722 Puerto Rico
OLGA LUCIA SANMIGUEL ARISMENDY
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOLOGÍA
BUCARAMANGA, 2.001
FITOBACTORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS POR
DERRAMES DE CRUDO
MILTON FAJARDO MANTILLA
OLGA LUCIA SANMIGUEL ARISMENDY
Trabajo de investigación para optar el título de biólogo
Directora
Dra. GRACIELA CHÁLELA MSc. Dr. Rer. Nat
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOLOGÍA
BUCARAMANGA, 2.001
Nota de aceptación
______________________
______________________
______________________
______________________
Presidente del Jurado
______________________
Jurado
______________________
Jurado
Bucaramanga, Febrero del 2.001

AGRADECIMIENTOS
Doctora Graciela Chálela Álvarez, MSc. Dr. Rer. Nat. Directora del Centro de
Innovación en Biotecnología Industrial (CINBIN) UIS Directora de la investigación.
Al equipo de trabajo del Centro de Innovación en Biotecnología Industrial (CINBIN).
Ramiro Álvarez Sierra, profesor de la escuela de Biología.
Ingeniero Gilberto Moreno. Administrador Sede UIS Guatiguará.
Gonzalo Calderón Caballero y al equipo de trabajo de la Granja Guatiguará.
Ingeniero Libardo Ochoa. Empresa Colombiana de Petróleos – Gerencia Complejo de
Barrancabermeja.
Dra. Rosa María Higuera Directora del Laboratorio de suelos y aguas de la Corporación
Autónoma Regional para la Defensa de la Meseta de Bucaramanga (CDMB).
Ing. Milagro León Escobar Munera, Subdirección Administración de Recursos Naturales de
La Corporación Regional para la Defensa de la Meseta de Bucaramanga (CDMB).

Amador y Víctor Hugo Serrano, profesores de la escuela de Biología.
A todas las personas que de una u otra forma hicieron posible el desarrollo de esta
investigación.
CONTENIDO
INTRODUCCION
1. FUNDAMENTO TEORICO 6
1.1 SUELOS 6
1.1.1 Tipos de organismos del suelo. 7
1.1.1.1 Tipos de organismos según la fuente de energía . 7
1.1.1.2 Tipos de organismos según el tamaño 8
1.1.2 Componentes del sistema suelo 8
1.2 PLANTAS 10
1.2.1 Características fisiológicas 10
1.2.2 Principales procesos fisiológicos 11
1.2.3 Exigencias y factores de crecimiento 12
1.2.4 Sistema radicular 13
1.2.4.1 Funciones 13
1.2.4.2 Rizosfera 14
1.2.4.2.1 Microbiota de la rizosfera 14
1.2.4.2.2 Productos de excreción del macroorganismo 16
1.2.4.2.2.1 Exudados 16
1.2.4.2.2.2 Tejidos muertos 17
1.2.4.2.2.3 Detritus 17
1.2.4.2.2.4 Secreciones 17
1.2.4.2.2.5 Mucigeles 17
1.2.4.2.2.6 Lisatos 17
1.3 DINAMICA DEL SISTEMA SUELO – PLANTA 18
1.4 BACTERIAS 19
1.4.1 Características generales 19
1.4.2 Crecimiento microbiano 19
1.4.3 Condiciones del suelo que afectan al crecimiento de las bacterias 20
1.5 RELACIONES ENTRE PLANTAS Y BACTERIAS 21
1.5.1 Acciones de las plantas sobre los microorganismos 21
1.5.2 Acciones de los microorganismos sobre las plantas 22
1.6 RELACIONES ENTRE SUELO – PLANTA – BACTERIAS 23
1.7 CONTAMINACION DE LOS SUELOS 25
1.7.1 Criterios para evaluar la contaminación 26
1.7.2 Efectos del contaminante en el suelo 26
1.7.3 Tipos de contaminación 27
1.8 DEPURACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS 28
1.8.1 Factores relevantes en la limpieza de sitios contaminados con hidrocarburos 28
1.8.1.1 Características del contaminante que influyen en su persistencia 28
1.8.1.1.1 Tipos de contaminantes 28
1.8.1.1.2 Concentración inicial de los contaminantes 28
1.8.1.1.3 Estado físico del contaminante 28
1.8.1.1.4 Propiedades físico – químicas del contaminante 29
1.8.1.1.4.1 Solubilidad del material 29
1.8.1.1.4.2 Relación entre la estructura física de productos del petróleo y su 29
biodegradación
1.8.1.1.4.3 Relación entre la estructura química de productos del petróleo y su 29
biodegradación.
1.8.1.2 Características del suelo que influyen en la persistencia del hidrocarburo. 34
1.8.1.2.1Factores físicos – químicos del suelo y persistencia de las sustancias tóxicas 34
1.8.1.3 Historia del sitio contaminado 36
1.8.2 Técnicas de limpieza por tratamiento ex – situ 37
1.8.2.1 Extracción / Clasificación usando agentes extractores acuosos 37
1.8.2.2 Tratamiento térmico 38
1.8.2.3 Biodegradación 38
1.8.2.3.1 Landfarming 38
1.8.2.3.2 Las técnicas de biorreactor 38
1.8.3 Tecnologías de biodegradación “On situ” 39
1.8.4 Tecnologías de biodegradación “In situ” 39
1.8.4.1 Extracción in-situ 39
1.8.4.2 Ventilación del suelo (extracción vaporosa del suelo) 39
1.8.4.3 Biorrestauración 39
1.8.4.3.1 Bioestimulación 40
1.8.4.3.2 Bioaumentación 40
1.8.4.3.2.1 Biorreactores para crecimiento microbiano 43
1.8.4.4 Fitorremediación 45
1.8.4.4.1 Fitoestabilización 46
1.8.4.4.1.1 Procesos naturales que involucran la fitoestabilización 47
1.8.4.4.1.1.1 Humificación 47
1.8.4.4.1.1.2 Lignificación 47
1.8.4.4.1.1.3 Ligamento irreversible (envejecimiento) 47
1.8.4.4.1.2 Procesos de las plantas que benefician la estabilización 47
1.8.4.4.1.3 Procesos del suelo que benefician la estabilización 47
1.8.4.4.2 Fitodescontaminación 48
1.8.4.4.2.1 Procesos naturales que involucran la fitodescontaminación 48
1.8.4.4.2.1.1 Fitoextracción 48
1.8.4.4.2.1.2 Fitovolatilización 49
1.8.4.4.2.1.3 Bombeo orgánico 50
1.8.4.4.2.1.4 Fitodegradación 50
1.8.4.4.2.1.5 Biodegradación intensificada de la rizosfera Rizos(fera)degradación 51
1.8.4.4.2.2 Procesos de las plantas que benefician la destrucción del contaminante 52
y/o extracción.
1.8.4.4.2.3 Procesos del suelo que benefician la destrucción del contaminante y / o 52
extracción
1.8.4.4.3 Ventajas y desventajas de la Fitorremediación 53
1.8.4.4.3.1 Ventajas 53
1.8.4.4.3.2 Desventajas 54
1.8.4.4.4 Requisitos para iniciar una fitorremediación 55
1.8.4.4.5 Requerimientos para todo proceso de biodegradación y fitodegradación 56
1.8.4.4.5.1 Requerimientos de Oxigeno 57
1.8.4.4.5.2 Aceptor de electrones 57
1.8.4.4.5.3 Requerimiento de nutrientes 57
1.8.4.4.5.4 pH 58
1.8.4.4.5.5 Temperatura 58
1.8.4.4.5.6 Humedad 58
1.8.4.4.5.7 Anhídrido carbónico 59
1.8.4.4.5.8 Luz 59
1.8.4.4.6 Las plantas como estructuras de remediación contra contaminantes 60
orgánicos
1.8.4.4.5.9 Captación de los contaminantes en la raíz 60
1.8.4.4.5.9.1 Fase vapor 60
1.8.4.4.5.9.2 Fase liquida 60
1.8.4.4.5.9.3 Fase sólida 61
1.8.4.4.6 Aplicación xenobiotica en un sistema planta 61
1.8.4.4.6.1 Transporte dentro de la planta 61
1.8.4.4.6.2 Metabolismo dentro de la planta 63
1.8.4.4.6.2.1 Efectos enzimáticos en el interior de la planta 63
1.8.4.4.7.2.2 Efectos enzimáticos en el exterior de la planta a nivel de suelos y 65
sedimentos
2. METODOLOGIA 68
2.1 ESQUEMA GENERAL DE TRABAJO 68
2.2 SUELO 70
2.2.1 Área de estudio 70
2.2.2 Ensayos preliminares 71
2.2.2.1 Caracterización físico – química 71
2.2.2.1 pH 71
2.2.2.1.2 Textura 71
2.2.2.1.3 Composición 71
2.2.2.2 Caracterización microbiológica 71
2.2.2.2.1 Recuento y caracterización de bacterias presentes en el suelo 71
2.2.2.2.2 Aislamiento de bacterias presentes en el suelo 73
2.3 CRUDO 73
2.3.1 Caracterización físico - química 73
2.3.1.1 Tipo de crudo 74
2.3.1.2 Propiedades físicas 74
2.3.1.3 Rendimiento y composición química del crudo 74
2.3.2 Ensayo de penetrabilidad 74
2.3.3 Ensayo de evaporación 75
2.3.4 Caracterización microbiológica 75
2.4 PLANTAS 75
2.4.1 Selección de plantas para las pruebas de biodegradación 75
2.4.1.1 Factores que se tuvieron en cuenta en el momento de la selección de especies 76
vegetales.
2.4.2 Selección de plantas resistentes a la contaminación con crudo cusiana 79
2.4.2.1 Pruebas de germinación al nivel de laboratorio en un medio nutritivo 79
hidropónico de Jensen y medio de Jensen modificado con crudo

2.4.2.1.1 Medio de Jensen 80
2.4.2.2 Pruebas de germinación al nivel de campo en un sustrato de arena y sustrato 81
de arena modificada con crudo al 10% y 30 %.

2.4.2.3 Pruebas de crecimiento 81
2.4.2.3.1 Pruebas de crecimiento a semillas sexuales resistentes a la contaminación 81
en un sustrato de arena y sustrato de arena modificado con crudo al 10% y 30 %.

2.4.2.3.2 Pruebas de crecimiento a semillas vegetativas “Estacas” de Gliricidia 81
sepium en un suelo sin crudo y un suelo con crudo al 10% y 30 %.

2.4.2.3.3 Pruebas de crecimiento a semillas vegetativas “cepas” en un suelo con 82
crudo y un suelo sin crudo al 10% y 30 %.

2.5 BACTERIAS 82
2.5.1 Medios de cultivo para el aislamiento y mantenimiento de las bacterias 82
2.5.1.1 Medios sólidos 82
2.5.1.1.1 Agar nutritivo modificado (ANM) 83
2.5.1.1.2 Agar de recuento “ plate counts” (Merck) 83
2.5.1.1.3 Agar avena con crudo (AAC) 83
2.5.1.2 Medios líquidos 84
2.5.1.2.1 Medio nutritivo A 84
2.5.1.2.2 Medio nutritivo B. 85
2.5.1.2.3 Medio de sales A. 85
2.5.1.2.4 Medio de sales B. 85
2.5.1.2.6 Medio de sales D. 85
2.5.1.2.5 Medio de sales C. (según Ercoli et al)

2.5.1.2.5.1 Micronutrientes C. 86
2.5.2 Selección de bacterias para el proceso de biorremediación in situ' por 86
bioaumentación
2.5.2.1 Aclimatación de los microorganismos aislados para la bioaumentación en 86
agar nutritivo y agar nutritivo modificado con crudo Cusiana.

2.5.2.2 Aclimatación de los microorganismos para la bioaumentación en medio de 87
sales.
2.5.3 Identificación de bacterias para el proceso de biodegradación 'in situ' 88
2.5.4 Optimización de la biodegradación dentro de las condiciones de laboratorio 88
2.5.4.1 Determinación del porcentaje de biodegradación 88
2.5.4.2 Crecimiento y recuento de las cepas bacterianas bioaumentadas en agar 91
nutritivo y agar nutritivo modificado con crudo Cusiana.

2.5.4.3 Crecimiento y recuento de cepas bacterianas aclimatadas en medio de sales y 93
medio de sales modificado con crudo Cusiana.

2.5.5 Mantenimiento de los microorganismos seleccionados para el biorreactor 93
2.5.5.1 Medio. 93
2.5.5.2 Preparación del inóculo 94
2.5.5.3 Producción de los microorganismos a gran escala 94
2.5.5.4 Condiciones de operación 97
2.5.5.5 Descarga del inóculo microbiano. 97
2.6 INTERRELACION PLANTA - BACTERIA - CRUDO. 97
2.6.1 Distribución del terreno 97
2.6.2 Aplicación de la biorremediación, fitorremediación y Fito - Bacto - 99
rremediacion 'In situ'

2.6.2.1 Fase de fertilización 99
2.6.2.2 Tratamientos 'In situ' para determinar la interrelación entre crudo- plantas - 101
bacterias.
2.6.2.2.1 Efecto de las plantas en el crecimiento poblacional de las bacterias nativas 102
bioaumentadas presentes en las diferentes eras con suelos contaminados con crudo
Cusiana.
presentes en las diferentes eras con suelos contaminados con crudo Cusiana.
2.6.2.2.3 Efecto de la biodegradación, fitodegradación, fito-bacto-degradación y 104
degradación natural del crudo Cusiana contenido en cada una de las eras
2.6.2.2.4 Efecto del crudo en el desarrollo de las plantas en cada una de las eras. 105
2.6.2.2.5 Efecto de la población bacteriana en el desarrollo de las plantas cultivadas 108
en las diferentes eras con suelos contaminados con crudo Cusiana.

2.7 ANALISIS ESTADISTICO 109
2.8 ANALISIS ECONOMICO 110
3. RESULTADOS Y DISCUSION 107
3.1 SUELO 107
3.1.1. Características físico - químicas 107
3.1.1.1 Condiciones físicas 107
3.1.1.2 Condiciones químicas del suelo 108
3.1.1.2.1 Materia orgánica 108
3.1.1.2.2 Reacción del suelo (pH). 109
3.1.1.2.3 Nutrientes 109
3.1.2 Caracterización microbiológica. 110
3.1.2.1 Recuento y caracterización de bacterias presentes en el suelo. 110
3.2 CRUDO 111
3.2.1 Ensayo de evaporación 111
3.2.2 Caracterización físico – química. 111
3.2.2.1 Composición típica del crudo Cusiana 111
3.2.2.2 Rendimiento del crudo Cusiana 112
3.2.2.3 Propiedades físicas 112
3.2.3 Ensayo de penetrabilidad 113
3.2.4 Caracterización microbiológica 113
3.3 PLANTAS 114
3.3.1 Selección de plantas resistentes a la contaminación con crudo Cusiana 114
3.3.1.1 Pruebas de germinación al nivel de laboratorio en un medio nutritivo 114
hidropónico de Jensen y medio de Jensen modificado con crudo.

3.3.1.2 Pruebas de germinación al nivel de campo en un sustrato de arena y sustrato 116
de arena modificada con crudo al 10% y 30

3.3.1.3 Pruebas de crecimiento 119
3.3.1.3.1 Pruebas de crecimiento de Helianthus annuus y semillas vegetativas 119
'Estacas' de Gliricidia sepium en suelo y suelo contaminado con crudo al 10% y
30%.
3.3.1.3.2 Pruebas de crecimiento para semillas vegetativas 'Cepas' en suelo y suelo 120
contaminado con crudo al 10% y 30%. En el cuadro 10, figura 26 y 27 se observan
los
3.4 BACTERIAS 125
3.4.1 Selección de bacterias para el proceso de biorremediación in situ' por 125
bioaumentación
3.4.1.1 Aclimatación de los microorganismos aislados para la bioaumentación en 126
agar nutritivo y agar nutritivo modificado con crudo Cusiana.

sales.
3.4.2. Identificación de bacterias para el proceso de biodegradación 'in situ' 127
3.4.3 Optimización de la biodegradación y aclimatación dentro de las condiciones 141
de laboratorio
3.4.3.1 Determinación del porcentaje de biodegradación. 141
3.4.3.1.1. Influencia del surfactante y del medio de sales en la Biodegradación. 142
3.4.3.1.1.1 Influencia del surfactante en la Biodegradación utilizando el medio de 142
sales C.
3.4.3.1.1.2 Influencia del surfactante en la Biodegradación utilizando medio de sales 143
D
3.4.3.1.1.3 Análisis de la influencia del medio de sales en la biodegradación 146

3.4.3.2 Crecimiento y recuento de las cepas bacterianas bioaumentadas en agar 147
nutritivo y agar nutritivo modificado con crudo Cusiana.

3.4.3.2.1 Comportamiento de los Bacilos en el medio nutritivo y medio nutritivo 147
modificado.
3.4.3.2.1.1. Influencia del medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 147
10%. en el crecimiento de los Bacilos seleccionados.

3.4.3.2.1.2 Variación del pH como consecuencia del crecimiento de Bacilos en 151
medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10%.

3.4.3.2.2 Comportamiento del consorcio Cocobacilos y Cocos en medio nutritivo y 151
medio nutritivo modificado con crudo al 10%.

3.4.3.2.2.1 Influencia del medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 152
10%. en el crecimiento de los Cocobacilos y Cocos seleccionados.

3.4.3.2.2.2 Variación del pH como consecuencia del crecimiento del consorcio 154
bacteriano en medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10%.

sales.
3.4.3.3.1 Influencia del medio de sales D y medio de sales D modificado con crudo 157
al 10% en el crecimiento celular.

3.4.3.3.2 Variación del pH como consecuencia del crecimiento del consorcio 161
bacteriano en el medio de sales D y medio de sales D modificado con crudo al 10%.

3.4.4 Montaje de biorreactores para la producción de biomasa microbiana 162
3.4.4.1 Medio 162

3.4.4.2 Condiciones de Operación 162
3.4.4.2.1 Presión. 162
3.4.4.2.2 Temperatura. 162
3.4.4.2.3 pH 162
3.4.4.1.4 Aireación 163
3.4.4.2.5 Agitación 163
3.4.4.2.6 Resistencia a la corrosión 163
3.4.4.3 Elementos del biorreactor. 163
3.4.4.3.1 Cuerpo del biorreactor 163
3.4.4.3.2 Bafles Deflectores 165
3.4.4.3.3 Dispersor 165
3.4.4.3.4 Tubería y accesorios de flujo 165
3.4.4.3.5 Compresor 166
3.4.4.3.5.1 Funcionamiento 166
3.4.4.4 Condiciones de escalado 166
3.4.4.5 Concentración del inoculo microbiano y adición del mismo 'In situ' 167
3.4.4.5.1 Consorcio Bacilos 167
3.4.4.5.2 Consorcio Cocobacilos y Cocos. 169
3.4.4.5.3 Consorcio Bacilos, Cocobacilos y Cocos. 171
3.5 INTERRELACION PLANTA - BACTERIA - CRUDO 173
3.5.1 Aplicación de la biorremediación, fitorremediación y Fito- Bacto- 173
Remediación 'In situ'
3.5.1.1 Tratamientos 'In situ' para determinar la interrelación entre crudo- plantas - 174
bacterias.
3.5.1.1.1 Efecto de las plantas y bacterias en la biodegradación del crudo cusiana en 174
cada una de las eras.

bioaumentadas presentes en las diferentes eras con suelos contaminados con crudo
presentes en las diferentes eras con suelos contaminados con crudo Cusiana.
3.5.1.1.4. Efecto del crudo en el desarrollo de las plantas 188
3.5.1.1.4.1 Efecto del crudo en el desarrollo Brachiaria sp 188
3.5.1.1.5 Efecto de la población bacteriana en el desarrollo de las plantas cultivadas 197
en las diferentes eras con suelos contaminados con crudo Cusiana.

3.5.1.1.5.1 Efecto de la población bacteriana en el desarrollo de Brachiaria sp Las 197
variables estudiadas se indican en el cuadro 41 y 42.

3.5.1.1.5.2 Efecto de la población bacteriana en el desarrollo de Swinglea glutinosa 204
3.5.1.2 Influencia de las precipitaciones en el proceso de biodegradación 210
3.6 ANALISIS ESTADISTICO. 214
3.6.1 Porcentaje de biodegradación en medio de sales C y D con surfactante y sin el 214

LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Curva de crecimiento de los organismos 11

Figura 2. La rizosfera 14
Figura 3. Raíz secundaria “La rizosfera” 15
Figura 4. Dinámica del sistema suelo - planta 18
Figura 5. Degradación de alcanos mediante microorganismos oxigenicos y 31
anoxigenicos.
Figura 6. Degradación general de compuestos aromáticos bajo condiciones oxigenicas 33
Figura 7. Diferentes tipos de adsorción sobre una partícula de suelo 35
Figura 8. Configuración de un reactor “Air lift” 45
Figura 9 Procesos generales de la fitorremediación 46
Figura 10. Captación de metales (níquel) por fitoextracción. 48
Figura 11. Destrucción de contaminantes orgánicos por fitodegradación 51
Figura 12. Propuesta para la degradación de TNT por la nitroreductasa y lactasa 66
encontradas en las plantas (los hongos también son una fuente de lactosa).
Figura. 13 Diagrama del esquema general del trabajo de investigación 68
Figura. 14 Esquema operativo del proceso de producción de biomasa microbiana 95
Figura. 15 Vista general de los biorreactores utilizados para el cultivo de los diferentes 96
tipos microbianos.
Figura. 16 Vista general de los semilleros usados para la fito – bacto - remediación 98
Figura. 17 Vista general del suelo homogenizado manualmente con crudo cusiana al 99
30 % P/P
Figura. 18 Esquema general del trabajo de fito – bacto - remediación 111
Figura 19. Estructura aterronada y compacta del suelo con el hidrocarburo 108
Figura 20. Bacterias aisladas del crudo 113
Figura 21. Resultados obtenidos del porcentaje de germinación en un medio de Jensen 115
y un medio de jensen modificado con crudo al 3 %, 1 % y 15 %.

Figura 22 Porcentaje de germinación de las especies vegetales en un sustrato de arena 116
y sustrato de arena más crudo Cusiana al 10% y 30%.

Figura 23 Pruebas de germinación al nivel de campo en un sustrato de arena y 118
sustrato de arena modificada con crudo al 10% y 30%

Figura 24 Porcentaje de mortalidad de las especies vegetales Gliricidia sepium y 119
Helianthus annuus en un sustrato de suelo y sustrato de suelo más crudo Cusiana al
10% y 30%
Figura 25 Prueba de crecimiento de Gliricidia sepium en un sustrato con crudo al 120
30%
Figura 26 Resultados de los porcentajes de Mortalidad y cobertura de las especies 121
vegetales en estudio con tres réplicas en suelo y suelo contaminado con crudo al 10%
y 30%.
Figura 27 Crecimiento de semillas vegetativas 'Cepas' en suelo y suelo contaminado 122
con crudo.
Figura 28 Seguimiento del cultivo de Brachiaria decumbens y Brachiaria brizantha 123
en un sustrato con crudo al 30%

Figura 29 Muestra de raíces de Brachiaria decumbens y Brachiaria brizantha en un 124
sustrato con crudo al 30% un mes después de su cultivo

Figura 30 Pruebas de crecimiento de semillas vegetativas ‘Braquipara sp’ en un suelo 124
contaminado con crudo al 10% y 30% un mes después de su cultivo.
Figura 31 Pruebas de crecimiento de plántulas Swinglea glutinosa en un suelo 125
contaminado con crudo al 10% y 30% un mes después de su cultivo.
Figura 32 Caracterización macroscópica y microscópica de Edwarsiella spp 128

129
Figura 33 Características macroscópicas y microscópicas de Hafnia spp
Figura 34 Características macroscópicas y microscópicas de Enterobacter spp. 130
Figura 35 Características macroscópicas y microscópicas de Micrococcus spp. 131
Figura 36 Características macroscópicas y microscópicas de Streptococcus spp. 132
Figura 37 Características macroscópicas de Pseudomonas putida 133
Figura 38 Caracterización macroscópica y microscópica de Bacillus polymixa 134
Figura 39 Características macroscópicas y microscópicas de Bacillus subtilis 135
Figura 40 Características macroscópicas y microscópicas de Bacillus circulans 136
Figura 41 Características macroscópicas y microscópicas de corynebacterium spp. 137
Figura 42 Características macroscópicas y microscópicas de Corynebacterium 138
glutamicum
Figura 43 Características macroscópicas y microscópicas de Nocardia spp. 139
Figura 44 Características macroscópicas y microscópicas del consorcio uno. 140
Figura 45 Características macroscópicas y microscópicas del consorcio dos 140
Figura 46 Características macroscópicas y microscópicas del consorcio tres 140
Figura 47 Características macroscópicas y microscópicas del consorcio cuatro. 141
Figura 48 Curva comparativa de la biodegradación en un medio de sales C con 142
surfactante y un medio de sales C sin surfactante.
Figura 49 Curva comparativa de biodegradación en medio de sales D con surfactante 144
y medio de sales D sin surfactante.

Figura 50 Montajes para determinar el porcentaje de degradación del crudo Cusiana 145
Figura 51 Curva comparativa de biodegradación del medio de sales C y D 146
Figura 52. Curva de recuento de Bacilos para medio nutritivo y medio nutritivo 148
modificado con crudo al 10%

Figura 53. Figura comparativa del crecimiento poblacional del consorcio ‘Bacilos’ en 150
un medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10%
Figura 54 Montajes para el recuento de Bacilos en medio nutritivo y medio nutritivo 150

Figura 55. Curva de recuento del consorcio Cocobacilos y Cocos en medio nutritivo y 152
medio nutritivo modificado con crudo al 10%

Figura 56. Figura comparativa del recuento del consorcio Cocobacilos y Cocos en 153
medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10%.
Figura 57 Montajes para el recuento de Cocobacilos y Cocos en medio nutritivo y 154

Figura 58 Comparativo de la variación del pH como consecuencia del crecimiento del 155
consorcio Cocos y Cocobacilos en medio nutritivo y medio nutritivo modificado con
crudo al 10%
Figura 59. Representación del recuento del consorcio Bacilos, Cocos y Cocobacilos 157
para medio de sales D y medio sales D modificado con crudo al 10%

Figura 60. Figura comparativa del recuento del consorcio Bacilos, Cocos y 160
Cocobacilos en medio de sales D y medio de sales D modificado con crudo al 10%.
Figura 61 Montajes para el recuento del consorcio Bacilos, Cocos y Cocobacilos en 160
medio sales D y medio de sales D modificado con crudo al 10%.
Figura 62. Gráfica comparativa de la variación del pH como consecuencia del 161
crecimiento del consorcio del consorcio Bacilos, Cocos y Cocobacilos en medio de
sales D y medio de sales D modificado con crudo al 10%.
Figura 63 Biorreactores para el desarrollo de los diferentes tipos de consorcios 164
microbianos utilizados en el bioproceso.

Figura 64 Concentración de los Bacilos y variación del pH en el biorreactor 169
Figura 65 Concentración del consorcio Cocobacilos y Cocos y variación del pH en el 171
biorreactor
Figura 66 Concentración del consorcio y variación del pH en el biorreactor 171
Figura 67 Vista general de los semilleros

Figura 68 Porcentajes de degradación logrados por Biodegradación, Fitodegradación, 175
Fito-bactodegradación, realizados por un mes en un sustrato con crudo al 30%

Figura 69 Figura comparativa de los Porcentajes de biodegradación logrados por 177
biorremediación
Figura 70 Figura comparativa de los Porcentajes de degradación logrados por 178
fitorremediación
Figura 71 Figura comparativa de los Porcentajes de degradación logrados por 179
rizos(fera)rremediación.
Figura 72 Gráfica comparativa de los Porcentajes de biodegradación logrados por fito 180
– bacto – rremediación, biorremediación, fitorremediación e intemperismo.
Figura 73 Crecimiento de los inóculos bacterianos bioaumentados presentes en las 184
diferentes eras.
Figura 74 Gráfica comparativa del crecimiento de los consorcios bacterianos 185
bioaumentados en las diferentes eras de tratamiento.
Figura 75 Gracia comparativa de las variaciones del pH en las diferentes eras de los 186
consorcios bacterianos bioaumentados.
Figura 76 Crecimiento de los consorcios bacterianos nativos presentes en las 188
diferentes eras contaminadas

Figura 77 Crecimiento del tallo de Brachiaria sp en un sustrato con crudo y otro sin 191
crudo (Representación del índice de tolerancia).

Figura 78 Tratamientos en campo de los diferentes semilleros que visualizan los 191
efectos del crudo en el desarrollo de Brachiaria sp.

Figura 79 Crecimiento del tallo de Swinglea glutinosa en un sustrato con crudo y otro 195
sin crudo (Representación del índice de tolerancia).

Figura 80 Tratamientos en campo de los diferentes semilleros que visualizan los 196
efectos del crudo en el desarrollo de Swinglea glutinosa.

Figura 81. Tratamientos en campo de los diferentes semilleros que visualizan los 203
efectos de los inóculos bacterianos en el desarrollo fisiológico de Brachiaria sp.

efectos de los inóculos bacterianos en el desarrollo fisiológico de Swinglea glutinosa.

Figura 83. Precipitaciones en el período de experimentación. 210
efectos de los inóculos bacterianos en la biodegradación.

LISTA DE CUADROS
Pág.
Cuadro 1.a Efectos de los organismos sobre el suelo 23

Cuadro 1.b Efectos de los organismos sobre el suelo 24
Cuadro 2.a Plantas seleccionadas para las pruebas de fito – bacto - remediación. 77
Cuadro 2.b Plantas seleccionadas para las pruebas de fito – bacto – remediación 78
Cuadro 3. Tratamientos aplicados a los efectos de las plantas en el crecimiento 102
poblacional de las bacterias inoculadas a cada una de las eras en un suelo
contaminado con crudo cusiana.

Cuadro 4. Tratamientos aplicados a los efectos de las plantas, de las bacterias y de las 104
plantas junto a las bacterias en la biodegradación del crudo cusiana.

Cuadro 5. Tratamientos aplicados al efecto del crudo en el desarrollo de las plantas 106
Cuadro 6. Tratamientos aplicados al efecto de la población bacteriana en el 108
desarrollo de las plantas cultivadas en suelos contaminados con crudo cusiana

Cuadro 7. Resultados de las pruebas de germinación contra replicas al nivel de 114
laboratorio en el medio de Jensen, medio de Jendsen modificado con crudo al 3 %, 7
% y 15%.
Cuadro 8. Resultados de las pruebas de germinación con tres replicas al nivel de 117
campo en sustratos de arena y sustratos de arena modificados con crudo al 10% y
30%.
Cuadro 9 Resultados de los porcentajes de mortalidad de Helianthus annuus y de las 119
semillas vegetativas (Estacas) Gliricidia sepium, con tres réplicas en suelo y suelo
contaminado con crudo al 10% y 30%.

Cuadro 10 Resultados de los porcentajes de mortalidad de semillas vegetativas 121
Cuadro 11 Géneros y especies de bacterias seleccionas para la bioaumentación 126
en agar nutritivo y agar nutritivo modificado con crudo Cusiana.
Cuadro 12 Géneros y especies de bacterias seleccionas para la bioaumentación en 127
medio de sales y medio de sales modificado con crudo Cusiana.
Cuadro 13 Análisis bioquímico de Edwardsiella 128

Cuadro 14 Análisis Bioquímico Hafnia. 129
Cuadro 15 Análisis Bioquímico Enterobacter 130
Cuadro 16 Análisis Bioquímico Micrococcus. 131
Cuadro 17 Análisis Bioquímico Streptococcus. 132
Cuadro 18 Análisis Bioquímico Pseudomonas putida. 133
Cuadro 19 Análisis Bioquímico Bacillus polymyxa. 134
Cuadro 20 Análisis Bioquímico Bacillus subtilis 135
Cuadro 21 Análisis Bioquímico Bacilos circulans. 136
Cuadro 22 Análisis Bioquímico Corynebacterium 137
Cuadro 23 Análisis Bioquímico Corynebacterium glutamicum 138
Cuadro 24 Análisis Bioquímico Nocardia. 139
Cuadro 25 Porcentaje de Biodegradación en medio de sales C sin/con surfactante 142
Cuadro 26. Porcentaje de Biodegradación en medio de sales D, sin surfactante y con 143
surfactantes
Cuadro 27. Recuento de Bacilos (UFC / ml). en medio nutritivo y medio nutritivo 148
Cuadro 28. Recuento de Cocos y Cocobacilos (UFC / ml). en medio nutritivo y 152

Cuadro 29. Recuento del consorcio bacteriano Cocobacilos, Cocos, Bacilos (UFC / 158
ml).en medio de sales D y medio de sales D modificado con crudo al 10%.
Cuadro 30. Recuento de Bacilos y medición del pH en el biorreactor 168

Cuadro 31. Recuento del consorcio Cocobacilos y Cocos y medición del pH en el 170
biorreactor.
Cuadro 32. Recuento del consorcio Cocobacilos, Cocos y Bacilos y medición del pH 172
en el biorreactor.
Cuadro 33 Resultados de los porcentajes de degradación logrados por 176
Biodegradación, Fitodegradación, Fito-bactodegradación, realizados durante un mes
en sustrato con crudo al 30%.
Cuadro 34 Recuento de los inoculos bacterianas bioaumentados en las diferentes 183
eras durante el período de tratamiento ''In situ'.

Cuadro 35 Variación del pH del suelo como consecuencia del crecimiento de las 186
cepas bacterianas bioaumentadas en las diferentes eras durante el período de
tratamiento ''In situ'.

Cuadro 36 Recuento de consorcios bacterianas nativos presentes en las diferentes 187
eras durante el período de tratamiento ''In situ'.
Cuadro 37. Resultados agronómicos de altura y diámetro del vástago, cobertura y 190
biomasa de las plantas, densidad, biomasa, y longitud de la raíz logrados en plantas
de Brachiaria sp y Swinglea glutinosa crecidas durante un mes en dos sustratos

Cuadro 38 Variación del pH como consecuencia del crecimiento de Brachiaria spp, 193
y Swinglea glutinosa en un suelo contaminado / sin contaminar.
Cuadro 39 Resultado análisis foliar para elementos mayores y menores en 193
Brachiaria sp para cada tratamiento.

Cuadro 40 Resultado análisis foliar para elementos mayores y menores en de 197
Swinglea glutinosa para cada tratamiento.

Cuadro 41 Efectos de los inoculos en la altura del vástago, cobertura, diámetro del 199
tallo, densidad de la raíz y biomasa en Brachiaria sp crecidas durante un mes en un
sustrato experimental de suelo - crudo.

Cuadro 42 Resultado del análisis foliar para elementos mayores y menores en 200
Brachiaria sp para cada tratamiento.
Cuadro 43 Observaciones de las variables estudiadas para Brachiaria sp en cada 200

tratamiento.
Cuadro 44 Resultado del análisis foliar para elementos mayores y menores en 204
Swinglea glutinosa para cada tratamiento.

Cuadro 45 Efectos de los inoculos en la altura del vástago, cobertura, diámetro del 205
tallo, densidad de la raíz y biomasa en Swinglea glutinosa crecidas durante un mes en
un sustrato experimental de suelo - crudo.

Cuadro 46 Observaciones de las variables estudiadas para Swinglea glutinosa en 206
cada tratamiento.
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Métodos analíticos utilizados para obtener la composición inicial del suelo 72
objeto de estudio
Tabla 2. Métodos utilizados para la determinación de las propiedades físicas del 74
crudo suministrado como sustrato contaminante (crudo cusiana)

Tabla 3. Caracterización fisico química del suelo objeto de estudio
Tabla 4. Características del suelo franco arenoso 108
Tabla 5. Estimativa conceptual de la materia organica en los suelos 108
Tabla 6. Recuento inicial de microorganismos totales en cada tratamiento al inicio 110
del ensayo.
Tabla 7. Composición del crudo cusiana. 111
Tabla 8. Rendimiento del crudo cusiana. 112
Tabla 9. Propiedades físicas del crudo cusiana suministrado como sustrato 112
contaminante.
Tabla 10. Dimensiones de operación de los biorreactores para el crecimiento de la 164
biomasa microbiana
Tabla 11 Precipitaciones en el período de experimentación 212
Tabla 12 Análisis de varianza del porcentaje de biodegradación bajo dos efectos 1 – 215
Medio C y/o D, 2 – Surfactante.

INTRODUCCION
Cada día se hacen más evidentes los problemas de contaminación en el ambiente como
resultado de la actividad industrial. Uno de los medios que resultan más impactados por el
uso excesivo de agroquímicos y a la liberación incontrolada de hidrocarburos, es el suelo,
el cual por su tiempo de formación cercano a 1 cm de espesor en 100 o más años, se le debe
considerar como recurso natural no renovable.
El suelo es un medio receptivo por excelencia, puesto que interacciona químicamente con
la litosfera, hidrosfera y la atmósfera, y sobretodo, recibe el impacto de los seres vivos que,
directa o indirectamente pueden romper el equilibrio químico establecido en su seno
produciendo extensas y dañinas repercusiones en todo el mundo.
El problema de la contaminación ambiental es una de las principales preocupaciones del
hombre de cara al siglo XXI. En particular, el petróleo constituye una de las principales
fuentes de contaminación del medio ambiente, ya que la mayor parte de sus componentes
son recalcitrantes a la biodegradación.

En la actualidad se han implementado tecnologías de saneamiento que incluyen
tratamientos físico - químicos tales como la solidificación, la inmovilización, la
incineración y la desorción térmica. Algunas de estas técnicas solo se dan para soluciones
puntuales o para trasladar el problema sin beneficiar al ecosistema, y si de algún modo se
encontrara la estrategia más efectiva de limpieza, esta solo removería una parte del aceite
derramado. Sin embargo, la biodegradación ha sido reconocida como una de las mejores
tecnologías para el tratamiento de desechos orgánicos, caracterizada por el uso de un
numeroso grupo de microorganismos heterótrofos capaces de utilizar los hidrocarburos
como una fuente de Carbono y de energía para su crecimiento, produciendo bióxido de
carbono, agua, biomasa y otros productos parcialmente oxidados no tóxicos.
Para tal fin, el suelo posee una microbiota autóctona con capacidades degradativas que, con
la ayuda de biorreactores a nivel experimental, dichos microorganismos aumentan la
actividad y el crecimiento en un 99 %, al suministrarse las condiciones apropiadas de
nutrientes, aireación, mezcla, pH, temperatura, humedad y dilución del lodo.
A nivel de campo los costos aumentan y el porcentaje de biodegradación baja al 20% o al
30%, debido a la pérdida de los nutrientes por fijación o por lixiviación en el suelo, a la
dificultad de proveer agentes “in Situ” para la biorremediación microbiana (nutrientes
aceptores de electrones como el Oxigeno, peróxido de Hidrogeno, metano, nitrato), a la
competencia de microorganismos adaptados y nativos, a la baja resistencia frente a la
depredación de protozoarios, y finalmente, al no encontrar las condiciones apropiadas para
su desarrollo, haciendo de ésta un proceso más costoso que la Fitorremediación.

La tecnificación de los mecanismos naturales de autopurificación (Biodegradación natural)
que se vienen llevando a cabo desde el inicio de la vida en el planeta, es una salida
económica de bajo costo y con un impacto regenerativo que busca explotar las
interacciones del ecosistema, aumentando las plantas y los microorganismos existentes
(Fitorremediación y Bioaumentación) o brindando a los microorganismos facultados para la
biodegradación condiciones ambientales y físico - químicas adecuadas, adicionando
nutrientes (Bioestimulación) o incorporando exudados aportados por un biorreactor natural
'Rizosfera' (Fitobactorremediación) necesarias para que los microorganismos activen su
metabolismo.
A menudo, se piensa en las plantas como una fuente de madera, de alimentos, de fibra y de
medicina; en segundo lugar se puede considerar su presencia por razones estéticas así como
por la necesidad de proporcionar un hábitat altruista para otras especies. Sin embargo, hoy
en día, juegan un papel importante en el mantenimiento de la calidad de vida, al
incrementarse su valor como un contrapeso de una recuperación medioambiental
económica.
Las plantas emplean la energía solar disponible y los procesos biológicos, químicos y
físicos emanados de ellas, como son la absorción, la transformación, la acumulación, la
extracción y la reserva de ciertos compuestos orgánicos e inorgánicos; las plantas también
han evolucionado y han metabolizado una amplia gama de toxinas naturales y se han
apoyado en las comunidades microbianas rizosféricas para aumentar la biodegradación,
todo esto como un esfuerzo por sobrevivir en un ambiente hostil.

La finalidad de esta investigación fue examinar cual bioproceso (Biodegradación natural,
Fitorrremediación, Biorremediación y Fitobactorremediación) aportó una mayor
recuperación ecológica de una manera económica en sistemas terrestres afectados por
derrames inducidos de crudo Cusiana. Se basó en: 1) La determinación de las especies
vegetales de mayor resistencia a la contaminación con hidrocarburos, decidiendo cuáles de
ellas eran capaces de aportar una mayor cobertura y biomasa para poder ejercer los
procesos de fitorremediación. 2) El uso de un “biorreactor’’ natural rizosférico para
aumentar la Fitobactorremediación, que consistió en añadir al suelo material energético
sintetizado por las plantas para aumentar microorganismos autóctonos edáficos
bioaumentados y facultados para degradar los hidrocarburos a cadenas menos tóxicas y en
algunos casos a CO2 más agua. En línea con el primer principio, el Centro de Innovación
en Biotecnología Industrial (CINBIN) ha llevado a cabo la selección final de especies y
variedades vegetales con amplia cobertura nacional basadas en la estimulación de plantas
capaces de resistir y propagarse en suelos impactados por derrames de hidrocarburos. Para
el segundo caso se efectuó una bioaumentación y aclimatación de microorganismos
autóctonos y foráneos en medios contaminados con crudo Cusiana, para una posterior
inoculación, a un ecosistema terrestre contaminado con crudo Cusiana y bioestimulación
aportada por la biomasa vegetal previamente seleccionada.
Para ello se llevo a cabo: a) el aislamiento y caracterización de bacterias edáficas y
rizosféricas, b) la bioaumentación y aclimatación de microorganismos autóctonos y
foráneos en medios contaminados con crudo Cusiana, c) la evaluación de la actividad
microbiana, d) la selección de plantas tolerantes al hidrocarburo, que presentaron un

aumento en la cobertura, e) La evaluación del comportamiento de las plantas en suelos
contaminados, f) la determinación de la interrelación planta - bacteria y sus efectos en la
biodegradación.
El presente trabajo no sólo es un proyecto de investigación aplicada, sino que además es
una Innovación Biotecnológica en el área de recuperación de suelos contaminados con
hidrocarburos, por Fitobactorremediación y Fitorremediación, por ser el primer trabajo
realizado en Colombia sobre el tema.

1. FUNDAMENTO TEORICO.
1.1 SUELOS.
El suelo no debe ser visto como una estructura estable formada por componentes minerales
y orgánicos. Mas que eso, es un ecosistema muy complejo, en el cual están en permanentes
interacciones tanto factores físicos y químicos, como clima, organismos del suelo y
plantas . Las relaciones dominantes en un instante determinado son expresión de un
equilibrio dinámico. A los organismos del suelo les corresponden en este complejo sistema
el papel de recicladores, pues remineralizan el material orgánico. La totalidad de cada uno
de los trabajos efectuados por los organismos del suelo se resume como ‘actividad del
suelo’. (3).
En general el suelo es el resultado neto de la acción del clima y los organismos,
especialmente de la vegetación sobre el material materno de la superficie de la tierra. En
esta forma, el suelo se compone de un material materno, del substrato geológico o mineral
subyacente y de un incremento orgánico en el que los organismos y sus productos están
entremezclados con las partículas finamente divididas del material en cuestión. Los
espacios entre las partículas están llenos de gases y de agua. La textura y la porosidad del
suelo son características altamente importantes y rigen en gran parte la disponibilidad de

los alimentos para las plantas y los animales terrestres (21), (28).
En la gran mayoría la actividad biológica del suelo se ve reforzada por interacciones y
asociaciones que, en condiciones naturales y en presencia de otros organismos de diferentes
especies, constituye un valor importante y, al propio tiempo, necesario del ambiente y
hacen parte integrante de la actuación del complejo ecológico como un todo. Las acciones
pueden ser simultaneas (efecto sinérgico) o ser acciones sucesivas, en las que unos
organismos utilizan los productos residuales de los que han actuado en la etapa anterior de
la cadena trófica. (21), (28).
1.1.1 Tipos de organismos del suelo.
1.1.1.1 Tipos de organismos según la fuente de energía. Dependiendo de la forma en
que obtienen energía y carbono para sus funciones metabólicas, los organismos pueden
agruparse en productores, consumidores y degradadores de C- orgánico: (50).
 Autótrofos (fotótrofos): Obtienen la energía a partir de la radiación solar. Producen C-
orgánico por fijación de anhídrido carbónico de la atmósfera durante la fotosíntesis. Como
ejemplos: algas, bacterias fotosintéticas y plantas superiores, que dependen del suelo para la
absorción de nutrientes y agua, interaccionan con el propio suelo como factor formador y
con muchos microorganismos del suelo. (50)
 Quimiolitótrofos: Obtienen energía a partir de reacciones químicas y fijan C- orgánico
a partir de CO2. Ejemplos:
• En presencia de oxígeno: Nitrosomonas y Nitrobacter.
• En ausencia de oxígeno: Desulfovibrio desulfuricans.

 Heterótrofos (Organótrofos): Requieren compuestos orgánicos que utilizan como fuente
de carbono y energía. Descomponen los restos orgánicos por acción mecánica. Pueden
segregar enzimas que actúan sobre los compuestos orgánicos fuera de la célula, provocando
ya sea su degradación o su mineralización. Obtienen energía a partir de sustancias
orgánicas por oxidación enzimática con desprendimiento de CO2. En un medio
anoxigénico las sustancias orgánicas sufren una fermentación, con una liberación de
energía menos eficaz que la respiración oxigénica. (50)
 Simbióticos: Obtienen energía y nutrientes a partir de los seres vivos con los que se
asocia a los que proporcionan algún beneficio. Ejemplo bacterias fijadoras de N 2-
atmosférico tipo Rhizobium (50)
1.1.1.2 Tipos de organismos según el tamaño.
 Macrofauna (de 6 a 200 mm) Vertebrados, por lo general zapadores, tales como
ratones, topos y otros que viven total o parcialmente en el suelo.
 Mesofauna (200 a 6000 µm) Pequeños invertebrados, tales como artrópodos, anélidos,
nemátodos y moluscos.
 Microorganismos: Seres vivos muy diversos y menores a 200 µm. (50)
1.1.2 Componentes del sistema suelo. El suelo es un sistema dinámico, compuesto en
general, por cuatro fases a saber: a) Fase sólida; b) Fase líquida; c) Fase gaseosa y d) Fase
biológica. (59).
Fase sólida. La fase sólida del suelo está formada por partículas minerales y compuestos
orgánicos de naturaleza compleja. Los minerales pueden ser primarios o secundarios. Las
partículas gruesas del suelo, tales como: arena, grava y gravillas representan los primarios,
en tanto que, las arcillas constituyen principalmente los secundarios. Los sólidos orgánicos
están constituidos, bien por tejidos vegetales o animales frescos, o bien por complejos
orgánicos alterados por la acción microbiana. (59).
Fase líquida. La solución del suelo constituye realmente el componente liquido del suelo,
integrado por agua y sales en ella disueltas. Por consiguiente, en esta fase los nutrimentos
se encuentran en forma simple y en estado iónico, susceptibles a ser absorbidos por los
organismos edáficos. La solución del suelo está ocupando parte del espacio poroso, y en
ella, la concentración de los diferentes nutrientes es muy pequeña en relación con la
concentración en que se encuentran en la fase sólida y en la cambiable. Por ello, esta fase
no puede ser considerada una reserva nutricional. Además, los iones en solución pueden
perderse merced al arrastre del agua de gravedad (lixiviación). (59)
Fase gaseosa. La fase gaseosa comprende sobre todo el aire, si bien pueden estar presentes
otros gases (anhídrido carbónico, etc.). La capa viscosa del agua adsorbida que presenta
propiedades intermedias entre la fase sólida y la líquida, suele incluirse en esta fase, pues es
susceptible de desaparecer cuando el suelo es sometido a una fuerte evaporación (secado).
Fase biológica. La fase biológica del suelo se caracteriza por poseer una población muy
compleja de organismos, que juegan un papel definitivo en su mantenimiento y que le

proporcionan vida activa. Dentro de esos organismos, resultan de gran importancia las
bacterias y las plantas. (59)
El crecimiento de los organismos edáficos es de incuestionable importancia debido a su
acción en procesos tales como: la fijación del nitrógeno atmosférico, la acción de las
micorrizas en la dinámica de algunos nutrientes, y la degradación de los contaminantes que
llegan al suelo. Esta fase biológica edáfica constituye una entidad indispensable para el
mantenimiento y mejoramiento de la fertilidad y la productividad del suelo.
El término crecimiento, tal como se aplica a las bacterias y otros microorganismos, se
refiere comúnmente al aumento en la masa total de las células más que a cambios en un
organismo individual. El crecimiento denota incremento del número o de la masa, por
encima del inóculo original.
El modo en que se expresa el crecimiento vegetal puede variar según el interés particular de
la explotación. En general, y desde el punto de vista científico, la medida más frecuente es
el peso de la materia seca formada a lo largo del ciclo vegetativo, lo que de algún modo
brinda un resultado integrado de dicho crecimiento. En otros casos, pueden ser la longitud,
la altura, el diámetro, el número de flores, el tamaño de los granos, etc.
El crecimiento sigue una evolución muy característica cuya representación gráfica es la
típica curva de crecimiento en S o de forma sigmoidea que aparece en la figura 1 y que es
común al desarrollo de todos los seres vivos. (19), (32), (59).

Crecimien
to total
Tiempo
Figura 1 Curva de crecimiento de los microorganismos y plantas.
En la figura 1 se observa la curva Sigmoidea que tipifica el patrón de crecimiento de
órganos individuales, de una planta, de una comunidad de plantas o de los
microorganismos. (Cinco fases constituyen la curva, cada una de las cuales describe un
estado de crecimiento). (19), (59).
 Una fase de adaptación durante la cual ocurren cambios internos, preparatorios para el
crecimiento. Las células sufren cambios en su composición química y aumentan de tamaño
(a)
 Una fase ‘exponencial’, de rápido incremento del crecimiento o llamada también de
‘crecimiento equilibrado’. Las células se duplican (se dividen) a ritmo constante; (b)
 Una fase en la cual la velocidad de crecimiento disminuye gradualmente. (c)
 Una fase estacionaria. Para los vegetales es un punto en el que las plantas alcanzan la
madurez y el crecimiento termina. Para los microorganismos es un punto de acumulación
de productos tóxicos y de agotamiento de los nutrientes. Algunas células mueren, mientras
otras crecen y se dividen. (d)

 Senectud y muerte con el tiempo. Mueren mas células de las que se producen. La tasa
de muerte se acelera, haciéndose la fase exponencial. Para las bacterias esta muerte se
produce por la falta de nutrientes en el medio (e). (59).
1.2 PLANTAS._
Las plantas son organismos fotosintéticos multicelulares adaptados a la vida terrestre.
Entre sus adaptaciones están una cutícula cérea, poros a través de los cuales intercambian
gases, capas protectoras de células que rodean a las células reproductoras, y retención del
esporófito joven dentro del gametofito femenino durante el desarrollo embrionario.
A partir de un antecesor común, divergieron dos linajes principales: los briofitos y las
plantas vasculares.
Briofitas. Los musgos y otros miembros de la división Bryophyta son plantas
relativamente pequeñas, que se encuentran habitualmente en parajes húmedos. La mayoría
carece de tejidos vasculares especializados y todas carecen de hojas verdaderas, aunque el
cuerpo de la planta se diferencia en tejidos fotosintéticos, de almacenamiento, de alimento
y de fijación. Son determinantes para la formación del suelo ya que apresuran los procesos
de descomposición orgánica y enriquecimiento de éste y se les considera como ‘alfombras’
que disminuyen los procesos erosivos.
Traqueofitas o plantas vasculares. Son plantas que se caracterizan por tener un sistema
conductor especializado. Pueden agruparse informalmente en plantas vasculares sin
semillas (divisiones Psilophyta, Lycophyta, Sphenophyta y Pterophyta) y las plantas con
semillas. Las plantas con semillas pueden agruparse en gimnospermas, o plantas con
semillas desnudas (divisiones Coniferophyta, Cycadophyta, Ginkgophyta y Gnetophyta), y
las angiospermas, o plantas con flores (división Antophyta).
Las angiospermas o plantas con flores, son las más complejas así como las más familiares
de todas las plantas, además son las dominantes en nuestra era geológica actual. Se dividen
en dos clases Monocotiledóneas y Dicotiledóneas, y, generalmente difieren en varios
aspectos, pero ninguna de las diferencias es absolutamente constante.
Las angiospermas presentan gran variedad de plantas útiles para el hombre en cuanto a la
alimentación directa, alimentación animal, fibras, aceites, medicinas, ornamentales,
artesanías, etc. (59)
1.2.1 Principales procesos fisiológicos. El desarrollo de la planta está condicionado por
una serie de procesos fisiológicos y metabólicos, entre los que se destacan los siguientes:
fotosíntesis, absorción de nutrientes, transpiración y respiración. (19).
 La fotosíntesis: Asegura a la planta la energía necesaria para la formación de todo tipo
de compuestos orgánicos, los cuales a su vez son vitales para la constitución de los tejidos y
la realización de las demás funciones. (19).
 La absorción de nutrientes: Generalmente se realiza por medio de las raíces; es una

función primaria y básica para el resto del metabolismo de la planta. Para esta función ya
es necesaria la energía obtenida de la fotosíntesis. (19).
 La transpiración: Es un proceso por el que la planta se asegura el suministro de agua y
la turgencia de las células, así como un equilibrio de temperatura con el exterior. Es un
proceso puramente físico, controlado por la presión osmótica generada por las células y el
gradiente de tensión de vapor de agua creado por la evaporación de la misma en las hojas.
(19).
 La respiración: Es la reacción inversa a la fotosíntesis. Mediante este proceso se
libera la energía necesaria para realizar otros procesos tales como la absorción de elementos
nutritivos o la síntesis de todos los productos del metabolismo vegetal: hidratos de carbono,
lípidos y grasas, aminoácidos, proteínas, polisacáridos, almidón, nucleoproteínas,
fosfolípidos, celulosa, lignina, enzimas, etc. (19).
1.2.2 Exigencias y factores de crecimiento. Para su desarrollo, la planta necesita una
serie de elementos y unos factores ambientales que deben combinarse de la manera más
favorable posible. Agua, elementos minerales esenciales o elementos nutritivos, anhídrido
carbónico, luz (energía) y temperatura (Calor). (19)
El agua y los elementos minerales o nutritivos son absorbidos del suelo por el sistema
radicular de la planta. El anhídrido carbónico y el oxígeno se obtienen de la atmósfera,
aunque este ultimo es necesario en el suelo para asegurar la respiración de las raíces. La
luz y la temperatura son, junto con el agua, los principales factores climatológicos que
determinan la adaptación de las diferentes especies vegetales a las diversas áreas
geográficas.
La actividad funcional de la planta, referente a la absorción de agua, elementos nutritivos y
degradación de contaminantes atrapados en el suelo, queda centrada en una pequeña parte
del sistema vegetal y es el sistema radicular. (19).
1.2.3 Sistema radicular.
1.2.3.1 Funciones.
• Absorben nutrientes, agua y contaminantes del suelo.
• Transportan estos elementos a las partes aéreas.
• Producción de fitohormonas.
• Actúan como órganos de almacenamiento
• Sirven para anclar la planta en el suelo.
• Mantenimiento de una alta población bacteriana en la rizosfera por medio de la
presencia de compuestos solubles e insolubles que se liberan de las células vivas
(excreciones) y células muertas de la raíz (componentes químicos), que constituye una de
las funciones más importantes respecto a la depuración. (17), (45), (55).
1.2.3.2 Rizosfera. La rizosfera es un volumen de suelo muy limitado, inmediato a la raíz,
en el que la población de microorganismos está condicionada tanto cuantitativa como

cualitativamente por la presencia de raíces de las plantas. Es una zona de actividad
biológica intensa, con una transferencia importante de agua y nutrientes.
En la Figura 2 se distinguen la superficie de la raíz o rizoplano y la zona exterior inmediata
o endorrizosfera. En la Figura 3 se aprecian los componentes de la raíz secundaria (13),
(17), (30), (45), (50).
Figura 2 Representación de la Rizosfera y sus partes.
1.2.3.2.1 Microbiota de la Rizosfera. A menudo, las especies vegetales establecen
microbiotas algo diferentes. Estas diferencias se atribuyen a variaciones en los hábitos de
enraizamiento, composición del tejido y productos de excreción de las raíces.
La Rizosfera estimula la multiplicación de las bacterias, hongos y nemátodos de vida libre,
de una manera fuerte pero selectiva, por medio de sus exudados. Las algas y los
rotozoarios no son estimulados directamente aunque incrementan su número, porque más
bacterias significan más alimento. (17).

Figura 3 Constitución de la Raíz Secundaria
Las bacterias que reaccionan a la presencia de las raíces pertenecen a varios grupos
taxonómicos, fisiológicos y morfológicos claramente diferentes. Los más abundantes son
los bacilos cortos Gram negativos que, casi invariablemente, ocupan el mayor porcentaje de
la rizosfera comparado con la microbiota normal del suelo, que en su mayoría, resultan ser
del tipo Pseudomonas spp. Agrobacterium y Achromobacter también son relativamente
comunes.
Entre las bacterias Gram positivas se encuentran los bacilos endosporados y no

endosporados, cocos y bacilos pleomórficos. (13), (17).
Los microorganismos encontrados en la rizosfera pueden ser benéficos o perjudiciales; son
benéficos aquellos que intervienen en reacciones del suelo, conducen a la liberación de
nutrientes contenidos en la materia orgánica o fijan nitrógeno del aire, ya sea simbiótica o
autotróficamente. Pueden ser perjudiciales, si interfieren con el desarrollo normal de la
planta. (17), (45).
1. Exudados. Son compuestos de bajo peso molecular, varían de planta a planta, escapan
de las células por los espacios intercelulares y pasan al suelo gracias a las uniones entre
células o directamente por las paredes celulares epidérmicas. Estas son sustancias que
normalmente refuerzan la actividad microbiana, aunque también actúan en contra de ciertos
microorganismos produciendo un efecto antagónico. (45), (50).
La formación y el tipo de productos excretados son determinados por la especie vegetal, el
suelo, los microorganismos, las intensidades elevadas de luz y temperatura, el
marchitamiento temporal, el daño a la raíz, los nutrientes orgánicos disponibles, los niveles
de oxigeno y CO2, y la humedad que favorecen o alteran de alguna manera la exudación de
las plantas. (45)
Su aporte a los microorganismos varía de acuerdo al estado de desarrollo de la planta. En
plantas muy jóvenes los microorganismos responden a las excreciones de las raíces más
que a los tejidos muertos. (45).

2. Tejidos muertos. El crecimiento de la raíz a través del suelo implica el desprendimiento
de fragmentos tisulares y células de la cofia, epidermis y corteza, que a través de sus
contenidos celulares aportan al conjunto de exudados. Ya durante el desarrollo tardío, el
tejido muerto y descompuesto puede contribuir apreciablemente más que la exudación, a la
composición de la comunidad. (45).
3. Detritus. Constituyen un sustrato, aunque menos selectivo para los microorganismos.
4. Secreciones. Son compuestos de bajo peso molecular y mucílagos de alto peso
molecular. Se liberan activamente tanto por la cofia de la raíz como por las células
epidérmicas. (44)
5. Mucigeles. Capa de un material gelatinoso en el rizoplano, visible al microscopio
electrónico. Esta formado por mucílagos, células bacterianas y sus productos metabólicos,
así como material mineral coloidal y materia orgánica. (44), (45).
6. Lisados. Son compuestos procedentes de la autólisis de células epidérmicas viejas,
atacadas por los microorganismos. (17), (44), (45).
1.3 DINAMICA DEL SISTEMA SUELO - PLANTA.

Complejos
Orgánicos
Fase
sólida
Minerale
s
Primarios
Otros
mine rale s
se cundario
s
Figura 4 Representación de la dinámica del sistema suelo – planta.
En la Figura 4 se observa la dinámica existente entre el suelo y la planta, que establece una
serie de interrelaciones entre los componentes o fases del sistema. Estas interacciones son
complejos procesos de naturaleza físico - química o bioquímica cuya denominación sería:
(Planta)
(e )
(a) (d)
N (Sólido) N (Solución) N (Raíz)
(b)
(c)
(c)
N (Cambiable)
(a) Solubilización y mineralización, (b) Fijación e inmovilización, (c) Intercambio iónico,
(d) Absorción, (e)Translocación. (59).
1.4 BACTERIAS._
1.4.1 Características generales. Las células bacterianas son muy pequeñas, de menos de
1 micra hasta 10 micras de longitud, y de 0,2 a una micra de ancho. Casi todas las especies
bacterianas son unicelulares, aunque las hay filamentosas o con cierto grado de unión, se
caracterizan por no poseer compartimentos intracelulares. Son los más pequeños y
numerosos microorganismos que viven libremente en el suelo.
En ellas existe una menor diversidad morfológica, menor número de estructuras celulares
especializadas y tipos de agrupación; las especies bacterianas, sin embargo, cuando crecen
sobre un medio de cultivo sólido, difieren unas de otras en forma, disposición, estructura
interna de sus células y en su metabolismo; estas diferencias son las que nos permiten
establecer los parámetros adecuados para su identificación.
Las células individuales son elipsoidales, esféricas, alargadas (cilíndricas) o en espiral
(helicoidales). Cada una de estas características es importante para determinar la
morfología de una especie.
Las células bacterianas esféricas o elipsoidales se denominan cocos. Las células cilíndricas
o alargadas se denominan bacilos.
Ciertas especies de bacterias muestran patrones de ordenamiento de sus células tales como
parejas, racimos, cadenas o filamentos. De acuerdo a la especie los cocos aparecen
ordenados de varias formas características, entre ellos están Diplococos, Estreptococos,
Tetracocos, Estafilococos y Sarcinas. Contrario a los cocos algunas especies de bacilos no
tienen un patrón de ordenamiento de sus células. (2), (17), (25).
1.4.2 Condiciones del suelo que afectan al crecimiento de las bacterias. Muchas
condiciones del suelo afectan al crecimiento de las bacterias. Entre las más importantes
están las reservas de oxígeno y humedad, la temperatura, la cantidad y clase de materia
orgánica del suelo y la concentración de iones H+ en la solución del suelo, así como la
cantidad de calcio intercambiable presente. (34)
1.5 RELACIONES ENTRE PLANTAS Y BACTERIAS.
Los organismos que viven en el suelo, por su diversidad y su capacidad de adaptación a
condiciones diversas pueden desempeñar múltiples funciones de gran importancia para el
sistema. (50).
1.5.1 Acciones de las Plantas sobre los Microorganismos.

♦ Con el crecimiento de las raíces en el suelo, las bacterias y hongos se estimulan en la
rizosfera 50 veces con respecto al suelo adyacente. (13), (17), (45).
♦ Por medio de sus raíces proporcionan a las bacterias una humedad menos variable que
en la parte aérea de la planta y cuya concentración de nutrientes es mayor. (13), (50).
♦ Aflojan el suelo permitiendo mejores condiciones para los microorganismos como
humedad y oxigenación. (45).
♦ Aportan nutrientes a los microorganismos como la glucosa y la fructosa, aminoácidos
simples y factores de crecimiento tales como la aneurina y la biotina, nucleótidos y
flavanonas, bajas concentraciones de ciertas vitaminas, ácidos orgánicos en grado limitado
y enzimas activas. (13), (44).
♦ Incrementan la velocidad de liberación de los nutrientes insolubles. (17).
♦ Solubilizan compuestos inorgánicos debido a la producción de anhídrido carbónico y de
ácidos orgánicos, productos de su metabolismo. (17), (28), (45)
♦ Provocan diferencias en los potenciales osmótico y redox. (13), (17).
♦ Cambian considerablemente el pH del suelo que rodea a la raíz. (13), (17).
♦ Efectos inhibitorios como la producción de químicos “alelopáticos” que detienen el
crecimiento de otras plantas y bacterias alrededor de ellas (13), (45), (48).
1.5.2 Acciones de los microorganismos sobre las plantas.
 Ayudan a la planta hospedera influenciando: la disponibilidad de nutrientes, el
crecimiento, la morfología de raíces, los procesos de absorción de nutrientes, la fisiología y
desenvolvimientos de la planta. (17), (45).

 Ayudan a la exudación de las raíces, variando la permeabilidad de sus células,
facilitando su metabolismo y alterando la disponibilidad de nutrientes para la planta. (13),
(45)
 Disminuyen el pH, lográndose un aumento de disponibilidad de elementos para las
plantas. (17), (45).
 Solubilizan compuestos inorgánicos debido a su producción de ácidos orgánicos y
anhídrido carbónico producto de su metabolismo, formando complejos muy estables con
estos cationes y liberando iones a la rizosfera. (17), (45).
 Mineralizan compuestos orgánicos aumentando la disponibilidad de los nutrientes para
las plantas, mediante oxidación, reducción, hidrólisis y carbonatación. (17), (45).
 Afectan el crecimiento de la planta a través de la producción de sustancias reguladoras
de crecimiento tales como el ácido indolacético, las giberelinas, las citoquininas y otras
sustancias relacionadas con el crecimiento; y por supresión de microorganismos patógenos
causantes de enfermedades estimulando la acción benéfica de otros microorganismos
asociados a las raíces, como las micorrizas. (13), (45), (68), (79).
 Inhiben la germinación y el crecimiento de las plantas por sustancias tóxicas liberadas
del metabolismo microbiano en un estado de competición. (17), (45).
1.6 RELACIONES ENTRE SUELO - PLANTA - BACTERIAS.
1.6.1 Acciones del suelo sobre las plantas y las bacterias.
1.6.1.1 Principales acciones directas

La compactación: Inhibe el desarrollo radicular; de este modo, las raíces no pueden
ramificarse en las capas duras que a veces se presentan en el suelo o en el subsuelo, y
solamente pueden penetrar en ellas a través de canales o grietas preexistentes. Además
disminuye el contenido de oxigeno disponible para los microorganismos. (19), (21), (50).
La Resistencia física: Las raíces y las bacterias oxigénicas solamente pueden crecer
en suelos que tengan un adecuado número de canales con lo que se asegura una buena
aireación y retención de humedad. (41), (50)
1.6.1.2. Principales acciones indirectas
Humedad del suelo: Los suelos con alto contenido de materia orgánica y los de
textura fina (arcillosos) tienen una gran capacidad de retención de agua y nutrientes
beneficiando el desarrollo de plantas y bacterias. (41), (50).
Profundidad: Un suelo muy profundo tiene un efecto muy favorable sobre el
desarrollo de los organismos al aportarles un mayor volumen y en consecuencia, una mayor
cantidad de los elementos. (19).
Temperatura del suelo: A temperaturas bajas se reduce la permeabilidad de las
células y la actividad metabólica de las plantas y las bacterias. (4), (10).
Nutrientes: Se encuentran presentes en la solución de suelo. Se derivan de la
intemperización de los minerales primarios, de la descomposición de la materia orgánica,
de la deposición de la atmósfera, y de la aplicación de fertilizantes. (7), (59).
Aireación: El sistema radicular y las bacterias oxigénicas sólo crecen en suelos bien
aireados. La pobre aireación inhibe la absorción y afecta el estado de oxidación de los
nutrientes (4), (10).

pH: Los valores bajos de pH inhiben la absorción de cationes y los altos la
absorción de aniones. (17).
1.6.2. Acciones de las bacterias y las plantas sobre el suelo
1.6.2.1 Principales acciones directas
♦ Aceleran la meteorización física, química y biológica (50).
♦ Creación de una espacie de huecos en la masa del suelo, eficiente en la transferencia de
fluidos y gases.
♦ Descomposición de restos y residuos orgánicos por fragmentación a moléculas más
sencillas, favoreciendo la mezcla de material orgánico e inorgánico. (50).
♦ Aportan CO2 y otros componentes como el ácido láctico, el ácido acético e incluso el
cítrico que pueden actuar como agentes quelantes, contribuyendo al incremento de la
meteorización y al transporte de algunos elementos. (50).
♦ Los organismos del suelo aumentan tanto la materia orgánica como la forma y la
estabilización de las estructuras secundaria y terciaria del suelo. (13), (50).
1.6.2.2. Principales acciones indirectas
♦ Las plantas actúan como filtros frente a la radiación solar; además, regulan la
temperatura, la evaporación y el régimen de humedad (50).
♦ Proporcionan información acerca de las condiciones del medio (suelo y clima). (50)
♦ Las plantas frenan la erosión eólica e interceptan el material transportado por el viento.
(50).
♦ Las plantas aumentan la infiltración y disminuyen la erosión por escorrentía superficial
♦ Favorecen la secreción de diferentes sustancias que contribuyen directamente a
incrementar la velocidad de los nutrientes insolubles en el suelo. (17), (45).
♦ En los ciclos biogeoquímicos, actúan en la fertilidad del suelo, inmovilizando y
liberando nutrientes. (50).
♦ Las plantas interceptan las gotas de lluvia con lo que se evita el impacto directo y se
puede disminuir la erosión por salpicadura. (50).
♦ Ejercen influencia en el equilibrio de la solución del suelo por la absorción de nutrientes
solubles. (17), (50), (59), (60).
♦ Intervienen en el ciclo de numerosos elementos, C, N, P, Ca, Fe, Mn, entre otros. (13),
(50), (59), (60).
♦ Las raíces de especies herbáceas absorben agua en los primeros centímetros del suelo,
con lo que disminuye la percolación y el lavado. (50).
Las plantas pueden actuar como depuradores naturales frente a ciertos vertidos gracias a la
acción de la microbiota y a la mezcla de materiales desarrollada por la fauna.
El suelo es un medio receptivo por excelencia, puesto que interacciona químicamente con
la litosfera, hidrosfera y la atmósfera y sobretodo, recibe el impacto de los seres vivos que,
directa o indirectamente, pueden romper su equilibrio químico establecido. (50).
1.7 CONTAMINACIÓN DE SUELOS.

El término contaminación define numerosas acciones que de un modo u otro participan en
la degradación del medio ambiente. El problema de la contaminación no es un fenómeno
reciente y hoy en día, la tecnología le confiere una importancia sin precedentes. Los
adelantos de la ciencia, las profundas transformaciones de las sociedades modernas y la
tecnología, han traído sin duda beneficios a la humanidad, pero igualmente crean la
necesidad de hacer un uso más intensivo de los recursos naturales. (54).
El uso de hidrocarburos fósiles en todos los niveles de la actividad humana, los sitúa entre
las fuentes de contaminación de primera línea, ya que originan grandes cantidades de
residuos que alcanzan niveles críticos o que exceden los límites establecidos por las
autoridades internacionales, convirtiéndose así en una preocupación ambiental seria. El
efecto causado en suelos y en ecosistemas debido a la presencia de altas concentraciones de
hidrocarburos, sobrepasa la capacidad autodepuradora de la naturaleza, produciendo una
relación inversa entre éstos en función del tiempo. (18), (50), (54).
Los hidrocarburos constituyen uno de los aspectos más importantes en la degradación
edáfica, produciendo infertilidad y convirtiéndolos en suelos muertos para la vida animal,
vegetal y microbiana. (54).
1.7.1 Efectos del contaminante sobre el suelo. Según Genout et als. 1992, los efectos
desfavorables de los contaminantes sobre el suelo son:
 Destrucción del poder de autodepuración por procesos de regeneración biológica
normales. Los ciclos biogeoquímicos y la función de biofiltro se ven afectados al

superarse la capacidad de aceptación del suelo.
 Disminución tanto cualitativa como cuantitativa del crecimiento normal de los
microorganismos del suelo, o bien alteración de su diversidad, lo cual aumenta la
fragilidad del sistema.
 Disminución del rendimiento de los cultivos con posibles cambios en la composición de
los productos, con riesgos en la salud de los consumidores al entrar determinados
elementos en la cadena trófica.
 Contaminación de las aguas superficiales y freáticas por procesos de transferencia.
 Disminución de las funciones de soporte de actividades de ocio. Los espacios
contaminados presentan problemas de salubridad para los usuarios.
 Deterioro de la estructura del suelo. (29), (50), (54), (57).
1.7.2 Tipos de contaminación. Los contaminantes edáficos pueden clasificarse en
endógenos y exógenos dependiendo de sí provienen del mismo suelo o del exterior,
respectivamente. La presencia de un contaminante endógeno se debe a la producción de un
desequilibrio natural que conduce a la acumulación de un componente en concentraciones
nocivas para las especies vivas. No obstante, las situaciones más problemáticas ocurren en
el caso de contaminación exógena, debido al vertido accidental de residuos (hidrocarburos).
Estos aportes, si se realizan a un ritmo superior a la velocidad de asimilación del suelo,
conducen a su acumulación y a la alteración del equilibrio natural. (18).

1.7.3 Criterios para evaluar la contaminación. La ecotoxicología estudia los efectos
ocasionados por las concentraciones de un contaminante en el ecosistema. Los parámetros
que utiliza son:
 LC50 Concentración letal para el 50% de la muestra después de un determinado tiempo

de exposición.
 EC50 Concentración que produce efecto observable en un 50% de la muestra.
 NOEC Concentración máxima que puede existir en el medio sin que se produzcan
efectos observables. (50).
Los estudios de contaminación del suelo se pueden llevar a cabo por dos vías diferentes: 1)
realizando análisis químicos de los suelos o de las plantas, lo cual permite evaluar el nivel
de contaminación de forma cuantitativa. 2) evaluando la respuesta de las plantas en un
suelo que se supone contaminado. El uso de especies indicadoras pueden proporcionar una
información cualitativa de la contaminación. (50).
Para evaluar la respuesta de las plantas en un suelo contaminado puede introducirse un
índice de tolerancia que se estima mediante la siguiente ecuación.
Cc = crecimiento de la planta en un suelo

Cc
IT = contaminado (1)
Cn Cn = crecimiento de la planta en un suelo normal
1.8 DEPURACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

Cuando el hidrocarburo entra en el ambiente puede sucederle muchas cosas, como por
ejemplo, descomponerse con bastante rapidez formando productos esencialmente no
tóxicos, localizando los efectos dañinos en el tiempo y en el espacio. No obstante, el
hidrocarburo puede persistir, produciendo efectos drásticos al ecosistema. Es por esto, que
la extensión y el grado de daño ambiental dependerán de las propiedades del suelo
contaminado, de la naturaleza del ecosistema afectado y de las propiedades de los
hidrocarburos implicados.
Propiedades químicas de los hidrocarburos que determinan su persistencia sobre
el suelo. Biodegradación es la modificación o descomposición de los contaminantes por
acción de los microorganismos para producir células microbianas y dióxido de carbono.
La siguiente ecuación describe la degradación de productos del petróleo mediante el uso de
microorganismos: (2), (33), (53).
Hidrocarburos + Microorganismos + O2 + Nutrientes → CO2 + H20 + Bioproductos + Biomasa.
Según las características químicas del crudo, este puede producir toxicidad a los
microorganismos encargados de la biodegradación aumentando su persistencia sobre el
suelo. La toxicidad de un determinado hidrocarburo depende de su composición química.
En general, los efectos tóxicos están asociados con los componentes de bajo punto de
ebullición y bajo peso molecular. Los efectos tóxicos de un derrame disminuyen en el
tiempo debido a que las fracciones responsables del daño se evaporan afectando la
composición inicial del producto derramado, aumentando de esta manera su densidad y
viscosidad y disminuyendo su solubilidad en agua. (2), (8), (20), (46).
La degradación potencial de alcanos es una función de la longitud de la cadena del carbono.
Las cadenas cortas son más difíciles de degradar que las cadenas más largas, sin embargo,
cadenas de alcanos muy largas son resistentes a la biodegradación. En realidad, los
hidrocarburos con menos de 10 carbonos, tienden a ser tóxicos por su alta solubilidad, sin
embargo, la mayor parte de ellos se pierde por volatilización más que por biodegradación.
Los n- alcanos y los n- alquilaromáticos, entre Cl0 y C22 son considerandos los menos
tóxicos y los más biodegradables. (46).
Los alcanos normales se degradan por oxidación monoterminal, diterminal o subterminal.
En la Figura 5, seDegradación
observan la biodegradación de n – Degradación
alcanos donde se inicia por la
Oxigénica Anoxigénica
modificación monoterminal del alcano hacia un alcohol primario, seguido por la oxidación
H C – (CH2)n – CH2 – CH3 H3C – (CH2)n – CH3 –
secuencial hacia3 el correspondiente aldehído y ácido monocarboxílico. La degradación de
CH2
los ácidos carboxílicos continúa por la vía de β-oxidación con la formación de unidades de
acetato como acetil – CoA; así, los ácidos carboxílicos se dividen sucesivamente en dos
carbonos. Las unidades divididas de acetato de los alcanos se metabolizan en las vías
metabólicas centrales con la liberación eventual de CO2. + agua (8).

Figura 5 Degradación de alcanos mediante microorganismos oxigénicos y
anoxigénicos. (Tomado de Bouwer et als. 1993).
Los alcanos cíclicos insustituibles, componentes principales del petróleo crudo, son
relativamente resistentes a la degradación microbiana y tienden a persistir en el medio
ambiente. Aunque éstos se extienden en el ambiente debido a los procesos naturales y a las
actividades humanas, pocos microorganismos son hábiles para utilizar los cicloalcanos para
su crecimiento. Su biotransformación ocurre utilizando un co - substrato que resulta del
metabolismo de las plantas y de los microorganismos, sirviendo como sustrato de
crecimiento para otros microorganismos; así, se considera que la degradación de alcanos
cíclicos por poblaciones mezcladas en el ambiente inicia con el cometabolismo y sigue con
la mineralización de cometabolitos. La biodegradación de cicloalcanos de C 10 y menores

presentan problemas de toxicidad para la membrana celular por su carácter de solvente.
(2), (8), (72).
Los compuestos aromáticos también son biodegradables, aunque lo son menos a medida
que aumenta el número de anillos aromáticos. Los alcanos, los alquilaromáticos y los
aromáticos por encima de C22 presentan baja toxicidad, pero sus características físicas,
entre ellas su baja solubilidad en agua y su estado sólido a la temperatura óptima de 35
grados Celsius, no favorecen su biodegradabilidad. (46).
Los sistemas aromáticos y cicloparafínicos, particularmente aquellos con cuatro o más
anillos, se consideran los más resistentes a la biodegradación. (46).
Para muchos compuestos aromáticos es común la biodegradación oxigénica y procede a
través de la formación del intermediario Catecol (Figura 6a). El mecanismo de formación
del Catecol y subsecuente clivaje del anillo bajo condiciones oxigénicas se muestran en la
Figura 6b. Los Eucariotes producen catecoles a partir de compuestos aromáticos
individuales vía epoxi y transdiol usando una monooxigenasa (secuencia superior de la
Figura 6b). Los Procariotes introducen el oxígeno molecular completo mediante una
reacción de dioxigenasa, formando primero un Cis - diol (secuencia inferior de la Figura
6b). En ambos tipos de organismos el anillo aromático del Catecol se abre por cualquiera
de los caminos del clivaje orto o meta. (Figura 6b). (8).
Figura 6 (a) Degradación Condiciones

general deOxigénicas
compuestos aromáticos bajo condiciones
oxigénicas. (b) Mecanismo específico de la conversión de un compuesto aromático a
Catecol bajo condiciones oxigénicas. (Tomado de Bouwer et als. 1993).

La presencia de grupos funcionales en la cadena de hidrocarburo o en el anillo aromático
puede incrementar o disminuir la tasa de bioconversión. Los grupos funcionales como nitro
y sulfo son relativamente resistentes a la degradación y favorecen la persistencia del
compuesto en el ambiente; los grupos hidroxilo, metoxilo y carboxilo son atacados más
fácilmente. El número de grupos sustituidos y la presencia de enlaces dobles son
igualmente determinantes en la biodegradabilidad. En general, la presencia de dos grupos
funcionales en un anillo bencénico disminuye su facilidad de degradación. Por otro lado,
hay que tener en cuenta que un crudo típico contiene decenas de miles de compuestos que
difieren marcadamente en volatilidad, solubilidad y susceptibilidad a la biodegradación.
Un producto refinado como el Kerosene puede contener de 5.000 a 10.000 compuestos
diferentes. (46).
Propiedades físicas de los hidrocarburos que determinan su persistencia sobre el
suelo. Las películas de petróleo retardan la absorción de oxígeno al suelo y, por
consiguiente, causan la disminución de oxígeno disuelto y la muerte de muchos
organismos. (29), (52), (54), (57)
Propiedades del suelo que influyen en la persistencia del hidrocarburo.
Figura 7. Representación de los diferentes tipos de adsorción sobre una partícula de
suelo (Tomado de Bornemisza 1982).
Para que el crudo y sus metabolitos puedan ser degradados por los organismos y disminuya
su persistencia en el suelo, éstos deben estar disponibles en fase liquida, proceso que se
dificulta cuando intervienen mecanismos de retención o inmovilización por parte del suelo,
y entre ellos el más importante es el de adsorción, fenómeno mediante el cual una sustancia
es atraída por fuerzas electrostáticas o de Van der Waals o químicas y se ‘une’ a la
superficie de otra por un período corto. (Figura 7). (7), (18).

La adsorción está determinada por ciertas características del suelo y del contaminante:
 Solubilidad del contaminante. Que se relaciona con el coeficiente de partición del
contaminante entre 1-octanol y agua (Kow) y que determina el grado de adsorción del
contaminante por parte del suelo. Los compuestos de moléculas pequeñas y polares
presentan bajos valores de Kow que indican alta solubilidad de agua y poca tendencia a
adsorberse en los suelos; por el contrario, compuestos con moléculas grandes y poco
polares o apolares, presentan altos valores de esta constante y están asociados con los
compuestos hidrofóbicos con tendencia a permanecer adsorbidos en el suelo. (13), (18),
(77).
 Tamaño de las partículas. Habrá mayor adsorción cuanto más pequeñas sean las
partículas del suelo. Esto se debe a que las partículas pequeñas aportan una gran área
superficial para la adsorción de los productos químicos. La arcilla es el nombre dado a las
partículas más pequeñas del suelo (aproximadamente 0,002 mm de diámetro). (18), (24).
 Superficie disponible. Los suelos con mucha materia orgánica y que se caracterizan por
su extensa superficie, adsorberán, y con ello inactivarán más contaminantes que otros
suelos con superficie reducida. (28).
Probablemente los dos componentes inanimados más importantes del suelo en relación con
la persistencia de sustancias tóxicas son la materia orgánica y la arcilla. La materia
orgánica consiste principalmente en compuestos húmicos que presentan una alta capacidad
de intercambio de cationes. Los grupos carboxilo, amino y fenol aportan centros para que
se formen enlaces de hidrógeno con las sustancias tóxicas. El humato de sodio presenta
propiedades semejantes a las de los detergentes y puede ayudar a solubilizar los
compuestos insolubles en agua. A menudo, la arcilla y la materia orgánica están asociadas
a los coloides del suelo, los cuales pueden adsorber sustancias tóxicas reduciendo de esta
manera su disponibilidad para los organismos. (7), (18).
Existen en la actualidad diferentes metodologías que pueden utilizarse para eliminar los
contaminantes del suelo, dejándolo prácticamente inalterado en lo referente a sus
propiedades físicas, químicas y biológicas. La elección de la tecnología más apropiada
dependerá si los contaminantes se encuentran en la zona saturada o en la zona insaturada,
del tipo de suelo, de la naturaleza química y física de los contaminantes y del horizonte del
suelo que se desee tratar. (6), (18), (29).
En general, las técnicas de depuración se pueden aplicar de tres maneras diferentes: in
Situ, mediante cual el contaminante es eliminado en el mismo lugar donde se encuentra, on
Situ, el suelo es excavado y tratado en el mismo terreno y, finalmente, off Site o ex Situ,
para el que se requiere excavación, transporte del material contaminado y tratamiento
adecuado en un lugar distinto de donde se encuentra el suelo afectado. (1), (18), (33), (35),
(53).
1.8.1 Técnicas de limpieza por tratamiento “ex – Situ”. Las técnicas se pueden
clasificar como:
• Tratamiento térmico. Es la incineración con la cual se lleva a cabo una combustión
controlada del suelo contaminado a elevadas temperaturas. (1), (18), (67).
• Biodegradación. Es el tratamiento biológico de suelos contaminados con compuestos
orgánicos, mediante la acción microbiana. En la actualidad existen dos principales tipos de
técnicas biológicas disponibles: 1) Landfarming. Esta tecnología consiste en extender el
suelo contaminado sobre una geomembrana para evitar el escape de lixiviados, airearlo
mediante volteo o arado y para proporcionarle microorganismos y nutrientes. Se emplea
para reducir niveles tóxicos en suelos altamente contaminados. La efectividad de estas
metodologías depende de innumerables factores, entre ellos están, las condiciones
climáticas, las características agronómicas, topográficas y microbianas del suelo receptor,
entre otras. 2) Biorreactores. Se toma un suelo altamente contaminado y se pasa a un
sistema reactor compacto el cual provee oxígeno y nutrientes. El suelo contaminado se
mezcla para promover un mejor contacto entre los microorganismos, los contaminantes, el
oxígeno y los nutrientes, controlando los factores bióticos y abióticos. Una forma especial
de biorreactor es el reactor de Compostaje en el cual se puede acelerar la degradación en
celdas aireadas y llevar a cabo un sistema de control de pérdidas de lixiviados. (1), (34),
(58).
1.8.2 Tecnologías de biodegradación “on Situ”. El suelo se coloca en piscinas de suelo
arcilloso, con el fondo recubierto de una capa de plástico de polietileno, que dispone de
drenaje para tratar el agua de percolación. Por encima de la capa de polietileno se coloca
arena limpia para proteger la capa de plástico y para ajustar el drenaje. El sistema dispone
de rociadores, con los que se va añadiendo agua, nutrientes y microorganismos (18). (33)
1.8.3 Tecnologías de biodegradación 'in Situ'. Las técnicas se pueden clasificar como:
1.8.3.1 Extracción in-Situ. (Landfarming). Consiste en la percolación de la extracción de
agentes acuosos dentro del sitio contaminado. Los contaminantes solubles del suelo se
disuelven en la percolación, por medio de un sistema especial de separación donde la
percolación es bombeada y tratada. Después del reacondicionamiento, los agentes
extractores son reutilizados. El proceso continúa hasta que la concentración de residuos en
el suelo satisface los estándares de limpieza. (1).
1.8.3.2 Ventilación del suelo (extracción vaporosa del suelo).
La extracción por vapor es aplicable a tratamientos in - Situ de suelos contaminados con
compuestos orgánicos volátiles, como el tricloroetileno y percloroetileno. Solamente se
puede aplicar a suelos arenosos. (1), (2).
1.8.3.3. Bioestimulación. Es una de las tecnologías más empleada por los científicos del
mundo. En ella se introducen los nutrientes necesarios al sistema para que los
microorganismos activen su metabolismo. Esta técnica puede ser aplicada en combinación
con la bioaumentación. (40).
Los procesos que conducen de una manera natural a la biodegradación son bastante lentos,
por este motivo se suele aumentar la temperatura, añadir oxígeno, agua o nutrientes, así
como también ajustar el pH, brindándole a los microorganismos las condiciones adecuadas
para acelerar considerablemente la biodegradación. (1), (46), (56), (77), (85).

1.8.3.4 Bioaumentación. Consiste en añadir al suelo otro tipo específico de
microorganismos o aumentar la concentración de los existentes, en aquellas condiciones en
las que los procesos biológicos naturales no son suficientes para llevar a cabo la
depuración, con el fin de favorecer los procesos de biodegradación. Los microorganismos
que se utilizan en el proceso pueden ser obtenidos por aislamiento a partir del suelo a
rehabilitar y pueden ser 'autóctonos' o exógenos, es decir, son traídos de otro ecosistema y
se adaptan a las nuevas condiciones. (6), (29), (46), (85).
Con la introducción de microorganismos al suelo se obtienen mejoras en las actividades
metabólicas especializadas, para así transformar los contaminantes que se resisten a la
acción degradativa de la microbiota nativa o cuando la matriz de suelo ha sido esterilizada
por los contaminantes. (29), (40), (77), (85).
Las técnicas de adaptación de cepas microbiológicas en la degradación de sustratos
especiales son muy comunes en la microbiología tradicional. La adaptación de las cepas a
altas concentraciones de un sustrato en particular, se hace mediante el procedimiento de
inducción enzimática, incrementando la producción de enzimas específicas requeridas para
degradar el sustrato.
Esta capacidad adicional de producir un tipo específico de enzima se lleva a cabo a
expensas de la habilidad del microbio para producir otras enzimas. Por lo tanto al ser
puestos los microorganismos adaptados en un ambiente en el cual su sustrato preferido no
está disponible, tendrán desventajas competitivas con relación a otros microorganismos no

especializados y por consiguiente más aptos para degradar sustratos comunes. Sin
embargo, cuando los sustratos preferidos están presentes, los microorganismos adaptados
serán la especie dominante sobre las poblaciones microbianas nativas. (1), (33), (85).
Estos microorganismos inoculados en el medio ambiente, únicamente crecen mientras
exista el contaminante, lo metabolizan y devuelven al suelo las sustancias simples no
tóxicas. Cuando el contaminante es completamente degradado, el organismo pierde su
competitividad y muere por falta de sustrato. (77), (85).
La biodegradación se hace por medio de enzimas llamadas oxigenasas, localizadas en la
pared celular del microorganismo, que introducen uno o más átomos de oxígeno en el
compuesto a degradar. Estas enzimas específicas son: a) monooxigenasas para la
biodegradación de hidrocarburos alifáticos, b) dioxigenasas para la biodegradación de
compuestos aromáticos, que tienen como función la oxidación inicial del anillo aromático.
(8), (46)
Los microorganismos emplean el sustrato como fuente energética para cumplir con sus
actividades catabólicas, pero también requieren que el sustrato proporcione los materiales
suficientes para la síntesis del material celular, tales como protoplasma, ácidos nucleicos,
proteínas, enzimas, cofactores, etc. Además se requiere de un ambiente propicio para el
crecimiento de las bacterias que esté dirigido por una serie de parámetros como lo son: la
temperatura, la relación de oxigeno, el pH, la energía, el agua, las sustancias tóxicas y las
trazas de nutrientes. (1), (34), (85).

Los sistemas basados en cultivos dispersos de microorganismos que no forman tejidos
(bacterias y hongos) son conocidos como reactores microbianos (biorreactores,
fermentadores). Estos biorreactores se encargan de mantener los microorganismos
destinados para la bioaumentación, y en ellos se controlan la temperatura, la humedad, los
nutrientes y los microorganismos (24), (25).
1.8.3.4.1 Biorreactores para crecimiento microbiano. El biorreactor, es sin duda, uno de
los equipos fundamentales de la microbiología industrial. Es el recipiente donde se realiza
el cultivo y su diseño debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los
microorganismos Las 'tareas' que realiza el biorreactor pueden resumirse de la siguiente
manera:
 Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen del cultivo a fin de
prevenir la sedimentación o la flotación.
 Mantener constante y homogénea la temperatura.
 Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
 Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo.
 Diseñar el biorreactor de tal forma que permita mantener el cultivo axénico o libre de
contaminantes, una vez que todo el sistema haya sido esterilizado y posteriormente
sembrado con el microorganismo deseado. (2), (25).
Hay dos tipos de biorreactores de uso muy difundido: a) el tipo tanque agitado y b) el tipo
''Air Lift''. En el primero de ellos la agitación se realiza mecánicamente mediante un eje

provisto de turbinas accionado por un motor. El aire se inyecta en la parte inferior del
tanque y es distribuido por una corona que posee pequeños orificios espaciados
regularmente. El chorro de aire que sale de cada orificio es 'golpeado' por las paletas de la
turbina inferior generándose de este modo miles de pequeñas burbujas de aire, desde las
cuales difunde el Oxígeno hacia el seno del líquido. El sistema de agitación se completa
con cuatro o seis deflectores que tienen como fin cortar o romper el movimiento circular
que las turbinas imprimen al líquido, generándose de este modo mayor turbulencia y mejor
mezclado. (2), (25).
En los reactores de tipo 'Air Lift' es el mismo aire inyectado al cultivo lo que promueve la
agitación. Consiste de dos cilindros concéntricos; por la base de uno de ellos, por ejemplo
en el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulación del líquido
ascendente en el compartimento interno y descendiente en el externo, lo que favorece el
mezclado. (2), (25).
El aire se inyecta solo en una parte de la sección transversal del tanque, llamada ''riser'. La
presión de gas y la disminución de la densidad del líquido en ese punto, hacen que el
líquido fluya hacia arriba. El aire abandona al líquido en el tope del reactor, dejando un
líquido pesado y libre de burbujas que recircula por el ''dowcomer''. La circulación del
líquido en un reactor ''Air Lift'' es resultado de la diferencia de densidades entre el ''riser'' y
el ''dowcomer''
a b c
Figura 8 Configuración de un reactor ''Air lift''
En la Figura 8 se observan tres diferentes configuraciones de un reactor ''Air Lift''. En el
interior del tanque en las figuras 8(a) y 8(b), tanto el ‘riser’ como en el ''dowcomer'' están
separados por un bafle interno. En el asa externa de la figura 8(c) los tubos verticales de
separación están conectados por una sección horizontal en el tope y en el fondo. (2), (25)
1.8.3.5 Fitorremediación. El término genérico “Fitorremediación” consiste en el prefijo
griego Fito (planta) y remediación de la raíz latina (corregir o quitar un mal). La
Fitorremediación es una tecnología emergente "verde" y consiste en favorecer el desarrollo
de un determinado tipo de vegetación, ya sea flora arbórea, arbustiva o herbácea que
puedan limpiar, corregir, atrapar y retener distintas sustancias químicas del medio ambiente
o que sustente una población específica de bacterias capaces de llevar a cabo la degradación
de contaminantes. (13), (14), (16), (22), (23), (70), (75).

El término Fitorremediación, como el de remediación, está divido en: 1) Fitoestabilización.
2) Fitodescontaminación
1.8.3.5.1 Fitoestabilización. Son los procesos involucrados en la estabilización y en la
retención de los contaminantes en el suelo. Este proceso busca reducir el daño
medioambiental potencial, disminuyendo la movilidad y disponibilidad del contaminante.
En general, estos procesos están bien documentados y ocurren naturalmente, pero son
difíciles de cuantificar. (Figura 9) (13), (16).
El proceso con contaminantes orgánicos, sin embargo, está sólo empezando a ser un factor
importante en discusiones reguladoras. En este momento, ningún sitio, contaminado con
orgánicos, ha sido o está siendo intencionalmente remediado por fitoestabilización, hecho
que no ocurre con los sitios contaminados con inorgánicos (13), (15), (16).
Los procesos naturales que involucran la fitoestabilización se pueden clasificar en:
 Humificación. Las enzimas de las plantas y las bacterias incorporan los contaminantes
al humus del suelo produciendo la más baja biodisponibilidad. La polimerización del
contaminante hacia la superficie de la raíz o en la porción húmica del suelo, es
frecuentemente, el resultado de la acción de los óxido- reductores sobre los contaminantes.
(13).
 Lignificación. Los componentes tóxicos son atrapados irreversiblemente por la pared
de la célula de la planta. (13).
 Ligamento irreversible (envejecimiento). Los Compuestos van disminuyendo la
disponibilidad debido al ligamiento dentro del suelo. (13).
1.8.3.5.1.1 Procesos de las plantas que benefician la estabilización. Estos procesos son:
• Transporte de iones a través de las membranas de las células de la raíz
• Flujo de agua a la planta manejada por transpiración
• Absorción de compuestos orgánicos dentro de las raíces
• Captura de compuestos orgánicos en la fracción lignificada de las plantas
(lignificación). (15).
1.8.3.5.1.2 Procesos del suelo que benefician la estabilización. Se mencionan los
siguientes:
• Fijación bioquímica (humificación): incorporación enzimática dentro del humus.
• Fijación química: precipitación
• Fijación física: fase sólida, difusión dentro de las estructuras del suelo (arcillas,
materia orgánica etc.); formación de una capa de óxido (15).
1.8.3.5.2 Fitodescontaminación. La Fitodescontaminación es un subconjunto de la
Fitorremediación. En este proceso se reduce la concentración de contaminantes en el suelo

a un nivel aceptable a través de las técnicas agronómicas, la acción de las plantas y de su
microbiota asociada. (13), (14).
Fitovolatilización
Fitodegradación
Fitoextracción
Fitoestabilización
Figura 9 Representación general de los bioprocesos de la Fitorremediación.
Los procesos naturales que involucran la Fitodescontaminación se pueden clasificar en:

 Fitoextracción. Conocida también como Fitoacumulación. En la figura 9 se muestra la
captación de metales contaminantes por las raíces de la biomasa vegetal - extractiva y su
acumulación en tallos y hojas.
Algunas plantas absorben cantidades extraordinarias de metales en comparación con otras.
Se selecciona una o varias de este tipo de plantas y de acuerdo a los metales presentes y a
las características del lugar se plantan en un sitio. Después de un tiempo, cuando las
plantas han crecido, se cortan y este tejido fino, rico en contaminantes acumulados es
procesado fácilmente y con seguridad, secándose, incinerándose o dejando que se
transformen en abono vegetal para reciclar los metales.
Este procedimiento se puede repetir la cantidad de veces que sea necesario para reducir a
límites aceptables la concentración de contaminantes en el suelo. Si se incineran las
plantas, las cenizas deben colocarse en un vertedero para desechos peligrosos; el volumen
de basura tóxica producida por la cantidad de ceniza será solo alrededor del 10% del
volumen de los desechos que habría que eliminar si se excavara el suelo contaminado para
tratarlo. (12), (65)
El producto de los procesos que acompañan a la Fitoextracción en suelos y aguas
contaminadas es una eliminación de tóxicos, cualidad que permanece en el tiempo. (13),
(14), (16), (38), (75), (86).
 Fitovolatilización. Las plantas o su actividad microbiana asociada ayudan al aumento

de la proporción de la volatilización de un contaminante desde el suelo contaminado. La
volatilización ocurre tanto desde los retoños de la planta o raíces, como desde la superficie
del suelo. (12), (13).
La Fitovolatilización se produce a medida que los árboles y otras plantas en crecimiento
absorben agua junto con contaminantes orgánicos. Cuando las plantas toman los
contaminantes tienen dos vías para la degradación, a) los acumula porque no le son tóxicos
b) los elimina porque le son tóxicos; estos contaminantes pueden llegar hasta las hojas y
evaporarse o volatilizarse en la atmósfera como un gas no tóxico. (13), (65), (79).
 Bombeo orgánico. Una planta se puede comparar a una bomba dirigida por energía
solar. Los árboles pueden realizar una acción de bombeo orgánico cuando sus raíces bajan
hacia la capa freática, formando una masa densa de raíces que absorben gran cantidad de
agua.
La acción de bombeo de las raíces disminuye la tendencia de los contaminantes
superficiales a descender hacia el agua subterránea y el agua potable, reduciendo el
escurrimiento, la corrosión de la superficie y las proporciones de flujo de tierra - agua,
controlando la pendiente hidráulica y previniendo la migración lateral de los contaminantes.
Así mismo, los árboles plantados en vertederos como sustitutos orgánicos de la tradicional
capa de arcilla o de plástico absorben agua de lluvia que, de lo contrario, se filtraría por el
vertedero y llegaría al fondo en forma de ‘lixiviado’ contaminado. (13), (70)

 Fitodegradación. En algunos casos, los contaminantes degradados en moléculas más
simples se usan para acelerar el crecimiento de las plantas. Las plantas tienen enzimas que
degradan solventes clorados y otras que degradan herbicidas. (Figura 9) (13), (14), (23).
 Biodegradación intensificada de la rizosfera. Es un proceso mucho más lento, donde
las raíces de las plantas, su microbiota asociada y / o los productos excretados, destruyen el
contaminante en la zona de la raíz mediante el proceso denominado biodegradación.
Las sustancias naturales liberadas por las raíces de las plantas estimulan la degradación de
compuestos químicos orgánicos en la rizosfera por medio de exudados de la raíz,
aumentando las comunidades microbianas y a su vez la actividad biodegradativa de los
microorganismos. Se puede añadir al suelo otro tipo específico de microorganismos o
aumentar la concentración de los existentes con el fin de acelerar los procesos de
degradación en la rizosfera. (13), (75).
Además, la interacción sinérgica entre los microorganismos y las plantas puede ser
requerida para degradar completamente los compuestos orgánicos recalcitrantes. El uso de
plantas podría ser particularmente importante cuando el contaminante orgánico se degrada
mediante un proceso cometabólico. (13).
1.8.3.5.2.1 Procesos de las plantas que benefician la destrucción del contaminante y / o la
extracción. Los principales se enumeran a continuación:
 Bioactividad microbiana alrededor de las raíces de la planta (Rizosfera).

 Las plantas y los microorganismos producen quelatos y agentes activos en la superficie
del suelo. (79).
 Las micorrizas aumentan el área de superficie del suelo y proporcionan una capacidad
enzimática adicional.
 La raíz, el tallo y las hojas poseen actividades metabólicas enzimáticas para la
detoxificación.
 Captación de cationes y algunos aniones en la raíz.
 Translocación de iones absorbidos por las raíces a los retoños.
 Evapotranspiración a través de las raíces hacia los retoños de la planta.
 División de las moléculas orgánicas hidrofóbicas en las raíces. (15).
1.8.3.5.2.2 Procesos del suelo que benefician la destrucción del contaminante y / o
extracción. Se identifican:
 Prácticas agronómicas que proporcionen aire, nutrientes, rupturas de área de superficie,
flujos químicos y estímulo microbiano. (15).
 Volumen de suelo: tanto para la degradación microbiana como para la química.
 Procesos de reducción y oxigenación en las estaciones secas y estaciones húmedas.(15).
 Procesos químicos y bioquímicos como: hidrólisis, sustitución y eliminación.
1.8.3.5.3 Ventajas y desventajas de la fitorremediación.
♦ Ventajas. Las más sobresalientes se mencionan a continuación.

 La efectividad del costo es uno de las más grandes y claras ventajas de la
Fitorremediación. Las técnicas agronómicas son considerablemente más económicas. Los
costos de cultivo son a menudo menores de 1 a 2 órdenes de magnitud que el tratamiento
‘ex Situ’. (13), (72), (73), (80).
 Es una tecnología ‘in Situ’ que incluye menor perturbación del lugar, y emisiones
aéreas mínimas. (13), (75), (76).
 Emplea la energía solar disponible y los procesos biológicos, químicos y físicos
emanados de las plantas para lograr la remediación, entre ellos, la absorción, la
transformación, la acumulación, la extracción, la reserva y la degradación rizosférica
microbiana. (13), (14), (15), (63).
 Su capacidad extractiva se mantiene debido al crecimiento vegetal, además es capaz de
ser modificada para aumentar su capacidad y selectividad extractivas. (71), (73), (75).
 Las plantas tienen la habilidad de resistir más concentraciones de contaminantes
orgánicos que la mayoría de los microorganismos. (83).
 Es aceptada por las comunidades aledañas como una tecnología potencialmente
elegante y estética. (13), (71).
 Efectiva contra una gran variedad de contaminantes, incluyendo una mezcla de
afluentes. (13), (14), (23).
 Es un “biorreactor autónomo, manejado solarmente ” (13), (72), (73).
 Es una técnica que actúa en conjunto con el proceso de revegetalización -
biodegradación. (13).
 Al contrario de los sistemas degradativos basados en microbios, la presencia y
condición de las plantas son fácilmente monitoreados. Una mirada casual puede decir que
ellas existen, que están creciendo o si necesitan agua o fertilizante. (13).
♦ Desventajas. Se pueden mencionar las siguientes:
 El problema de biodisponibilidad, lo concerniente a la habilidad de lixiviar el
contaminante, la heterogeneidad del sitio, y la complejidad del perfil del contaminante
pueden restringir severamente muchas, si no todas, las formas de Fitorremediación. (13).
 Alcanzan únicamente la profundidad hasta la cual llegan las raíces y pueden usar
suelos, cursos de agua y agua subterránea poco profundos. (13), (14), (23), (73).
 Todas las raíces de las plantas requieren oxígeno para la respiración, así, las raíces no
pueden penetrar bajo condiciones, donde la textura del suelo, el volumen del agua o las
proporciones de la respiración microbianas son altas. (13), (50).
 Los compuestos presentes en concentraciones fitotóxicas no pueden tratarse a menos
que una especie resistente sea seleccionada o que el suelo sea pre-tratado para reducir la
fitotoxicidad. (13).
 Comparada con otras tecnologías empleadas para eliminar residuos peligrosos, esta
requiere períodos de tiempo relativamente largos. (13), (14).
 El suelo está desnudo y sujeto a erosión durante las fases tempranas de establecimiento
de la planta. (13).
 Puede ocurrir que los compuestos solubles sean liberados de la textura del suelo a través
del crecimiento de la planta, aumentando los lixiviados(13).
 La presencia de plantas perennes, podría reforzar la infiltración, mediante la creación de
canales desde la superficie hasta las raíces. (13).

1.8.3.5.4 Requisitos para iniciar el proceso deFitorremediación.
 Las variedades deben adaptarse al clima de la región. Sin embargo, la selección final
de especies y variedades está basada en la absorción/degradación de los contaminantes
orgánicos.
 Deben aplicarse prácticas agronómicas tales como, cultivos de las semillas o trasplantes
a profundidades apropiadas y el control de la mala hierba.
 Para la fitorremediación, el espaciamiento de la planta (proporción del sembrado) será
ajustado a la máxima densidad de la raíz, de lo contrario no se logrará alcanzar el más alto
rendimiento.
 Como resultado de la contaminación el suelo puede tener químicos y propiedades
físicas desfavorables, lo cual necesita superarse antes de plantar.
 Deben supervisarse los nutrientes y aplicarse tanto como se necesiten. Generalmente se
requerirá agregar a las plantas mucho más nitrógeno y fósforo de los necesarios.
 Las plantas seleccionadas necesitan ser manipuladas para asegurar su máximo
crecimiento. Los niveles de humedad deben ser óptimos y se pueden establecer a la
necesidad de ciertas rutinas de corte.
 Se deben determinar las ventajas de las monocotiledóneas y dicotiledóneas antes de
iniciar el proceso Fitocorrectivo. Por ejemplo, las estructuras fibrosas de la raíz en las
gramíneas pueden explorar suelos a profundidades de hasta 3 m, mantener un área de
superficie más grande de colonización y un mejor contacto suelo / raíz. Además las plantas
que utilizan el sistema fotosintético C4 son más eficaces en el uso de CO2 y pueden tolerar
el calor y la sequía mejor que las plantas con sistema C3, por consiguiente, sería importante
una comparación de las plantas C3 con C4. Algunas plantas dicotiledóneas poseen raíces
más profundas y tienen mayor capacidad para pasar grandes cantidades de solución
contaminante de la tierra al cuerpo de la planta a través de las raíces y evaporarlas por
medio de la Fitovolatilización. (13), (48), (51), (52), (61), (72), (73), (78).
1.8.3.5.5 Requerimientos para todo proceso de Biodegradación y Fitodegradación. Los
exudados de la raíz son uno de los componentes más importantes de las interacciones planta
/ microorganismo; parece lógico empezar con la exudación como punto controlador
potencial. La exudación de la raíz (composición y cantidad) puede ser influenciada
dramáticamente según la edad, el estado nutritivo y las especies de plantas. Los factores
medioambientales que controlan la exudación de la raíz y el desarrollo de su microbiota son
muchos e incluyen: La intensidad de luz, la temperatura, la humedad del suelo, el medio de
sustento, la fertilización, los químicos exogénicamente aplicados y la presencia de
micorrizas.
 Requerimientos de Oxígeno. Casi todos los organismos necesitan oxigeno para utilizar
la energía contenida en los alimentos orgánicos. Este gas se libera durante la fotosíntesis y
es necesario para la respiración en todos los órganos de la planta y de los microorganismos.
Los pasos iniciales de un catabolismo rápido y eficiente de hidrocarburos alifáticos, cíclicos
y aromáticos por parte de las bacterias y las plantas involucran la oxidación del sustrato por
oxigenasas.
La disponibilidad del oxígeno edáfico depende del tipo de suelo, de su saturación y de las
acciones de los organismos sobre él. El contenido de aire en el suelo disminuye cuando el
de agua se incrementa y viceversa; por esta razón, resulta importante el mantenimiento de
las condiciones óptimas de humedad en el suelo proporcionadas en este caso por las
plantas. (1), (8), (13)
 Aceptor de electrones. Simultáneamente a los procesos de oxidación, se deben llevar a
cabo las semireacciones de reducción. Por lo tanto es necesaria la presencia de substancias
que sean aceptoras de electrones. Los aceptores de electrones más comunes presentes en el
suelo son: O2, NO3, S042- y CO2. El aceptor de electrones establece el tipo de metabolismo
y por consiguiente las reacciones de degradación. (2), (11), (64).
 Requerimientos de Nutrientes. Para la biorremediación de suelos contaminados se
busca mantener una relación de nutrientes equivalentes de C: N: P de 100: 15: 3, porque
ésta es, por término medio, la relación elemental en las células. En suelos altamente
contaminados su concentración es muy baja. Debe señalarse que también son necesarias
pequeñas cantidades de otros elementos como K, Mg, Ca, Fe, Na, Co, Zn, Mo, Cu y Mn.
(4), (11), (46).
 pH. El pH afecta la habilidad de los organismos para dirigir sus funciones celulares, el
transporte de sustancias a través de la membrana celular y el equilibrio de sus reacciones
catalizadas. La literatura referencia que la biodegradación de hidrocarburos es más rápida
cuando los valores de pH están comprendidos entre 4 y 9. (2), (4), (5), (50).
 Temperatura. Es un parámetro crítico, que por su efecto, influencia la biodegradación

tanto en la composición química y la naturaleza del compuesto a biodegradar como en la
comunidad microbiana. En general la degradación sigue un comportamiento del tipo
Arrehnius, aumentando la velocidad de reacción con la temperatura. Al disminuirse la
temperatura decrece la actividad microbiana y las reacciones bioquímicas de las plantas así
la persistencia del contaminante crece. La elevación de la temperatura hace aumentar la
velocidad de volatilización de los productos químicos, también promueve el metabolismo y
aumenta la velocidad de absorción y translocación de sustancias tóxicas por parte de los
organismos vivos. Cuando la temperatura está comprendida entre 21º y 38ºC (70º a 100º F),
la actividad bacteriana es casi siempre la mejor. (4), (46).
 Humedad. La distribución de la vegetación y de los microorganismos sobre la
superficie del suelo está controlada por la disponibilidad de humedad más que por cualquier
otro factor ecológico individual. Es a través de su efecto en los procesos fisiológicos
internos como el agua afecta el crecimiento de las células. El nivel óptimo de humedad
para las plantas superiores suele ser el mejor para casi todas las bacterias. El contenido de
humedad del suelo afecta tanto el valor como el nivel tóxico efectivo de los contaminantes,
la transferencia de gases y las etapas de crecimiento de las bacterias y de las plantas.
Los niveles de humedad inferiores al 40% disminuyen, la actividad de las plantas y de las
bacterias ya que limita tanto el movimiento celular como las reacciones metabólicas y, por
consiguiente, la tasa de biodegradación. Valores comprendidos entre el 50 y el 70%
favorecen la biodegradación de compuestos del petróleo; cuando sobrepasa el 70%
obstaculiza la transferencia gaseosa de oxígeno e impide la actividad de los

microorganismos y de las plantas significativamente. (2), (4), (5).
 Anhídrido carbónico. Como se trata de uno de los compuestos esenciales que
intervienen en la fotosíntesis, es entonces un factor ecológico de vital importancia. Se
encuentra en la atmósfera en cantidades muy pequeñas; sólo constituye el 0.030% del aire
(300 ppm.) por volumen, o sea 1/700 del 02 presente en la atmósfera. Se necesita una
concentración de cerca de 50 ppm. de CO2 en la atmósfera para que la mayoría de las
plantas inicien una fotosíntesis activa. (4).
 Luz. Es el factor esencial en la fotosíntesis. Es un proceso mediante el cual los
vegetales captan la energía luminosa y la transforman en energía química contenida en los
compuestos orgánicos. La absorción de la luz se realiza a través de los pigmentos de la
clorofila y de los carotenos contenidos en los cloroplastos de las células verdes.
La radiación ultravioleta de la luz solar provoca reacciones de oxidación que produce la
llamada oxidación fotoquímica, que puede implicar la degradación diaria de 0.1% del
derrame por día. Esta reacción viene limitada por la ausencia de luz solar una vez
incorporado el producto al suelo. (4), (18), (29).
1.8.3.5.6 Las plantas como estructuras de remediación de suelos contaminados. Las
raíces de las plantas captan rápidamente contaminantes de cada una de las siguientes fases
del suelo:
 Fase gaseosa. La captación de los contaminantes volátiles encontrados en la fase
gaseosa del suelo, por medio de las raíces de las plantas, es un mecanismo importante para
algunos compuestos (como el naftaleno), incluso para aquéllos con presión de vapor
relativamente baja. (13)
 Fase líquida. Los contaminantes encontrados en la fase líquida del suelo, son captados
por las raíces de las plantas por difusión y flujo de masa. Sin embargo, los compuestos
muy solubles con afinidad pequeña para los sólidos del suelo también están sujetos a
lixiviar fuera de las zonas de la raíz y pueden ponerse físicamente indisponibles para la
captación de la raíz.
La lipofilicidad es “el equilibrio entre la afinidad del producto químico para las fases
acuosas y lípidas” Esta propiedad determina la facilidad de movimiento en las membranas
de la planta.
Los compuestos solubles en agua (un Kow bajo) son fácilmente transportados a la rizosfera
por difusión y flujo de masa. Además, para su absorción, las moléculas no solamente
dependen de la Kow sino que generalmente deben estar en tamaños moleculares menores a
la dispersión coloidal; las moléculas muy grandes tienen poca probabilidad de entrar a la
célula vegetal (13).
 Fase sólida. Las raicillas y pelos están, en muchos casos, en íntimo contacto con las
superficies coloidales del suelo. En efecto, esa relación es tan estrecha que se cree que los
contaminantes adsorbidos pasan de los sólidos del suelo a la planta sin la influencia
coloidal. Sin embargo, comparando el área de un suelo con el área de una raíz, es difícil
imaginar esto como una estrategia de remediación viable. (13), (44).
1.8.3.5.7 Transporte de los contaminantes dentro de la Planta. La solución contaminante
disuelta en la fase liquida del suelo con valores por debajo del log K ow, es transportada a
células porosas del espacio libre de la raíz, por medio del flujo de masa. Este movimiento
de la solución contaminante en el suelo es resultado de un déficit de agua en la raíz
inducido por la transpiración. Si la planta realiza una absorción de la solución del suelo
mayor que el flujo de ésta hacia la raíz, se desarrolla un gradiente de concentración,
obteniéndose un movimiento por difusión.
La solución contaminante disuelta que entra a la raíz debe atravesar primero la epidermis y
una capa cortical parenquimatosa que presenta numerosos espacios intercelulares.
Seguidamente pasa a la endodermis, donde se limita la velocidad para el movimiento de la
solución por la presencia de una barrera xerosa llamada banda de Caspary. Una vez se
dividen los compuestos dentro de las membranas lipofílicas, de la banda de Caspary estos
necesitan ser desorbidos en una solución acuosa para poder entrar en los vasos de xilema
por vía simplásto.
Se estima una cantidad insignificante de flujo total vía apoplástica, disponible sólo cerca de
la punta de la raíz donde la banda de Caspary aún no se ha desarrollado bien, a menos que
la raíz sufra variaciones o perturbaciones.(13), (19).
Conceptualmente, el camino entero de la raíz puede simplificarse como: a) pre- banda de
Caspary, b) la desorción fuera de esta membrana. El primer paso favorece más a los
compuestos lipofílicos; el segundo paso para la desorción favorece más a los compuestos
hidrófilos. (13).
Una vez que la sustancia entra en el tejido vascular, puede ser transportada con rapidez
desde las raíces hasta las hojas a través de la corriente de transpiración por el xilema o más
lentamente desde las hojas hacia abajo por el floema. El transporte a través del floema es
complejo y no se comprende por completo, pero parecen existir pocas dudas de que las
sustancias tóxicas que entran en el floema pueden ejercer un efecto adverso severo en la
planta. La absorción de sustancias a partir del sistema vascular varía a lo largo de la planta,
y depende de la naturaleza de los tejidos, de su estado hormonal y de las condiciones
ambientales. (20), (60).
En el campo de la Fitorremediación, no se ha prestado aún mucha atención a los aspectos
mecanicistas de la captación de la raíz y de la translocación del xilema; la mayoría de los
estudios usan el análisis por compuestos radioetiquetados. Tales estudios siempre son
complicados debido al metabolismo de las plantas y a la limitación de dichos compuestos
(13).
Aun se desconocen receptores específicos en las raíces para la toma de estos contaminantes,
el tipo de transformaciones y el lugar de la planta donde se realizan, sin embargo se sabe
que los sistemas fotosintéticos, especialmente el Fotosistema II, no se altera y las
modificaciones ocurren en las células meristemáticas de las raíces.
1.8.3.5.8 Metabolismo dentro de la Planta. Las enzimas de las plantas pueden
metabolizar una amplia variedad de contaminantes xenobióticos. Estas se encuentran y son
activas en el interior de la raíz, tallos, y hojas o también pueden encontrarse en suelos y en
sedimentos.
El metabolismo de los contaminantes en el interior de la planta es notablemente similar a
los tipos de metabolismo xenobiótico que ocurren en el hígado del mamífero mediante
transformaciones mediadas por hidrólisis, conjugación y oxigenación. Esta comparación se
ha denominado “hígados verdes”. Los materiales relativamente lipofílicos sufren un
ataque enzimático que produce compuestos más solubles en agua. En los sistemas de
mamíferos la disposición final termina a menudo en rutas excretoras con las cuales la planta
no cuenta. En principio, tanto en la planta como en los sistemas metabólicos del hígado se
pueden dividir en las mismas tres fases: transformación, unión, y disposición final. (13),
(75).
La fase final del metabolismo de la planta consiste en el transporte y rotura de los
productos metabolizados en las vacuolas celulares, en los espacios intracelulares o en los
variados componentes de la pared de la celular. Existen dos sistemas enzimáticos
especializados responsables de los procesos de detoxificación del hígado con formas muy
similares a estas enzimas (isoformas) en varias especies de plantas, a saber:
• Las oxigenasas citocromo P450 que ejecutan su acción cambiando la naturaleza y
estructura de un compuesto químico nocivo mediante la adición de oxígeno a la molécula.
Este proceso denominado oxigenación ocurre en sistemas denominados microsomales.
Esta molécula compleja posee en su estructura una molécula de Fe en estado de oxidación
+2 o +3, y es de suma importancia para la adición de oxígeno al substrato. (13), (75).
• Glutatión S-transferasas. (GSTs) Representan un grupo grande de enzimas
involucradas en el metabolismo secundario de las plantas y tienen la habilidad de
destoxificar xenobióticos hidrofóbicos. Es un tripéptido que se encuentra en casi todas las
células vivas. La hidrólisis ácida parcial del glutatión produce dos dipéptidos y cada uno
posee un sitio activo compuesto del sitio GSH (sitio G) de atadura constante y uno más
variable (sitio H) para los co-substratos hidrófobos. La GSTs también puede actuar
ligando hidrófobos a otros espacios del sitio – H. La GSTs de las plantas son
sorprendentemente diversas, pero puede agruparse como Tipo I o de Tipo IV basados en las
similitudes en las sucesiones de los aminoácidos. (13), (69), (82).
A pesar de toda la discusión anterior acerca de las capacidades degradativas de la planta,
los sistemas metabólicos de la planta se opacan comparado con sus análogos microbianos.
A diferencia de los microorganismos, los sistemas de la planta no tienen un amplio rango
de substratos, ni pueden actuar sobre un amplio rango de concentración. Esto puede
ilustrarse fácilmente comparando respectivamente las habilidades de las plantas con las de
los microbios. En las plantas, hay quizás cuatro reacciones de ruptura de enlaces de C bien
documentadas. En los microbios hay tal vez una docena. Este tipo de comparación ha
incentivado a la investigación actual para aprovecharse de la ingeniería y de las
asociaciones plantas - microbios para mejorar las actividades metabólicas. (13).
Algunas enzimas provenientes de los exudados radiculares o de raíces muertas, son activas
en el exterior de la raíz y están localizadas en el suelo. Entre ellas están: (13), (75).
• Dehalogenasa. Parece ser una enzima de senescencia expresada durante la muerte y
degrada subproductos del etileno o productos clorados.
• Nitrilasa. Quita el grupo cianuro de los pesticidas y otros compuestos.
• Fosfatasa. Enzima de crecimiento que degrada grupos fosfato de los organofosforados.
• Peroxidasa. Interviene en la degradación de fenoles y otros compuestos químicos que
ocurren naturalmente. (84).
• Nitrorreductasa. Se localiza en la membrana de la célula, expresándola bajo una
variedad de condiciones en cianobacterias, algas verdes, y plantas (monocotiledóneas y
dicotiledóneas); reduce los grupos nitrato de los compuestos nitroaromáticos, para obtener
nitrógeno utilizado en el crecimiento celular. (Figura 10). (84).
• Lacasa: Se localiza dentro del xilema de la planta y desempeña un papel vital en la
lignificación (síntesis de estructuras de apoyo a la planta) y deslignificación agregando
oxígeno (Figura 10).

En la figura 10 se observa una propuesta de biodegradación de TNT por la Nitroreductasa y
la Lacasa encontradas en las plantas.
Lacasa Otras
Clivaje del anillo reacciones
y
productos
Figura 10. Propuesta de biodegradación de TNT por la Nitroreductasa y la Lacasa
encontradas en las plantas (Tomado de Steven 1999)
Se completa la degradación del trinitrotolueno (TNT) por la oxidación del triaminotolueno
y rompimiento del anillo. La Lacasa parece estar involucrada en la incorporación de
fragmentos del anillo en la biomasa de la planta. (Figura 10).
La degradación realmente es un multi- proceso donde la Nitroreductasa reduce la molécula
primero a triaminotolueno (TAT), posteriormente actúa la Lacasa y oxida TAT a
Cetona.
Esto es consistente con el papel de la Lacasa en la lignificación. (84).

El resultado de la acción de los compuestos óxido- reductores sobre los contaminantes es la
polimerización del contaminante en la superficie de la raíz o en la porción húmica del
suelo. (13).
Cualquier cosa que perturbe drásticamente el metabolismo de la célula vegetal, tiende a
desencadenar la producción de compuestos aromáticos como mono y dihidrofenoles,
glucósidos fenólicos, flavonoides, antocianinas, aminoácidos aromáticos, derivados de la
cumarina, y aumenta la actividad de varias enzimas oxidantes incluyendo la citocromo -
oxidasa, la fenol - oxidasa, la oxidasa del ácido ascórbico y la peroxidasa que dan
resistencia a las plantas para las sustancias tóxicas con las cuales tenga contacto. (20).
2. METODOLOGIA.
2.1 RESUMEN DEL BIOPROCESO.

La metodología seguida se resume en la Figura 11
La etapa inicial se desarrolló en el laboratorio y durante ella se obtuvieron características
físicas, químicas y microbiológicas del suelo y del crudo, las cuales fueron utilizadas
para determinar los bioprocesos de Fitobactorremediación, Fitorremediación y
Biorremediación de suelos contaminados con crudo Cusiana.
Se seleccionaron plantas que soportaron suelos contaminados con crudo Cusiana y se
valoró su germinación y crecimiento en dicho suelo. Una vez valorada cada especie
vegetal se escogieron aquellas que presentaron mayor germinación, crecimiento y cobertura
frente al sustrato contaminado.
Se utilizaron microorganismos foráneos ‘Pseudomonas putida’. (CINBIN) y se
seleccionaron microorganismos ‘nativos’ obtenidos de suelos sin crudo y de la rizosfera de
plantas cultivadas en suelos contaminados. El material obtenido se aisló en cultivo axénico
para su identificación y se valoró su capacidad biodegradativa en un medio de sales
modificado con crudo y su adaptación a un medio nutritivo modificado con crudo Cusiana.
Una vez valorada cada cepa, se escogieron los microorganismos que presentaron una mayor
capacidad de biodegradación y adaptación al hidrocarburo, al ofrecer los mejores
crecimientos en el medio nutritivo modificado.

El paso siguiente consistió en el montaje bajo condiciones de laboratorio de pruebas
especificas como: a) Cinéticas para cada uno de los microorganismos, usando como
variables presencia/ausencia de hidrocarburos y concentración de nutrientes, para analizar
el comportamiento poblacional del consorcio microbiano en el hidrocarburo y b) Pruebas
de biodegradación usando como variables concentración de nutrientes y presencia/ausencia
de biosurfactante.
Con las condiciones óptimas de biodegradación y adaptación logradas en las etapas
anteriores, se seleccionó un biorreactor para la multiplicación microbiana a gran escala y
así se pudo disponer de las concentraciones necesarias de inóculo microbiano para la
biodegradación.
Una vez valoradas las especies vegetales tolerantes al crudo y las condiciones óptimas de
biodegradación y adaptación por parte de los microorganismos, se procedió al montaje del
diseño experimental a nivel de campo.
Tomando como patrón la Biodegradación natural, se estudiaron los bioprocesos de
Fitorremediación, Biorremediación, y Fitobactorremediación ‘in Situ’, para determinar cual
de ellos aportaba los mayores porcentajes de biodegradación en suelos contaminados por
derrames inducido de crudo.
Para estimar si existieron relaciones antagónicas o sinérgicas, que influyeron sobre los
resultados de la biodegradación, se estudiaron los siguientes resultados de las interacciones

plantas – bacterias: a) Efecto de la rizosfera en el crecimiento poblacional de las bacterias
nativas bioaumentadas en los biorreactores e inoculadas en los diferentes semilleros, b)
Efecto de la rizosfera en el crecimiento poblacional de las bacterias nativas presentes en el
suelo contaminado, c) Efecto de la población bacteriana en el desarrollo de las plantas
cultivadas, d) Efecto del crudo en el desarrollo de las plantas. Con estos cuatro análisis se
determinó, si la relación antagónica o sinérgica era aportada por las plantas, por las
bacterias o por el crudo Cusiana.
Caracte
Las variables estudiadas para observar rización
las relaciones plantas – bacterias fueron: a)
Físico-química y
microbiológica
Población bacteriana (se estimó por recuentos en cámara Neubauer), b) Altura del vástago,
c) Diámetro del tallo, d) Cobertura de las plantas, e) Biomasa de la raíz, f) Biomasa total de
De rrame
las plantas, g) Análisis nutricional, h) Indice de tolerancia. inducido
Biorremediación
Suelo Suelo
De crudo
Por medio de un análisis del tejido foliar de las plantas cultivadas, se valoró la
Aislamiento y Inte mpe rism
selección o
de pesados (Ni) aportados
contaminación inorgánica por metales por el hidrocarburo Cusiana.
bacterias
Cinética microbiana
Control flujo de aire
Valoración
2.2 ESQUEMA capacidad
GENERAL DE TRABAJO.
biodegradativa Biorre actor para Estudio de los
cre cimie nto e fe ctos de l crudo
bacte riano e n las plantas
Selección
Fitobactorremediaci Fitorremediaci
Plantas
ónRecuento bacteriano ón
Porcentaje de degradación resistentes al
Crecimiento de plantas (Variables crudo Cusiana
agronómicas)
Estudio de la inte rre lación

Planta – bacte ria – crudo
para aplicarlos a los Estudio de la re lación
proce sos biode gradativos. Planta - bacte ria
Figura 11. Esquema general del trabajo de investigación aplicada como
Fitobactorremediación
2.3 SUELO
2.3.1 Área de estudio. La presente investigación se realizó con el apoyo del CENTRO
DE INNOVACIÓN EN BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL (CINBIN), ubicado en la sede
de Investigaciones de la Universidad Industrial de Santander, en el valle de Guatiguará,
municipio de Piedecuesta, donde se asignó un terreno inicial con un área aproximada de
300 m2.
Del área del terreno asignada se tomaron 600 Kg. de suelo; 400 Kg. de este suelo se
mezcló, tamizó, homogeneizó y contaminó con crudo Cusiana al 30 % p/p. Los 200 Kg.
restantes se mezclaron, tamizaron y homogeneizaron sin hidrocarburo.
De cada tratamiento se tomaron aleatoriamente seis porciones de suelo y se repartieron en
cantidades iguales de 500 gramos, los cuales se utilizaron para el análisis físico – químico y
microbiológico.
2.3.2 Ensayos preliminares.
2.3.2.1 Caracterización físico - química.
2.3.2.1.1 pH. El pH se determinó por el método del potenciómetro de vidrio en la relación
suelo-agua por volumen de 1 a 1 en una solución de CaCl2 0.01M
2.3.2.1.2 Textura. Se analizó la textura del suelo por el método de Bouyoucous.
2.3.2.1.3 Composición. Se determinó, por métodos analíticos, la composición inicial del
terreno. Este estudio tuvo lugar en el laboratorio de aguas y suelos de la Corporación de
Defensa de la Meseta de Bucaramanga. (C.D.M.B.). (Tabla 1).
2.3.2.2 Caracterización microbiológica.
2.3.2.2.1 Recuento y caracterización de bacterias presentes en el suelo.

Tabla 1. Métodos analíticos utilizados para obtener la composición inicial del suelo objeto
de estudio.
Elemento analizado Método analítico

Materia orgánica, % Walkley - Black
Fósforo, mg P/100 gr. S Bray y Kurtz I Y II
Calcio, meq Ca/100 gr. S Extracción con acetato de amonio. Absorción atómica.
Magnesio, meq Mg/100 gr. S Extracción con acetato de amonio. Absorción atómica.
Potasio, meq K/100 gr. S Extracción con acetato de amonio. Absorción atómica.
Sodio, meq Na/100 gr. S Extracción con acetato de amonio. Absorción atómica.
Aluminio meq Al/100 gr. S Extracción con KCL – volumetría y Absorción atómica
Cobre, ppm Solución ácida. Absorción atómica
Zinc, ppm Solución ácida. Absorción atómica
Hierro, ppm Solución ácida. Absorción atómica
Manganeso, ppm Solución ácida. Absorción atómica
Boro, ppm Solución ácida. Absorción atómica.
Se utilizó el método de recuento de colonias por agar (‘Plate count’) para determinar el
número de bacterias presentes en el suelo de estudio contaminado por crudo Cusiana y el
número de bacterias presentes en el suelo sin crudo; la metodología implementada fue la
siguiente: Se tomaron 5 gramos de cada suelo y se adicionaron por separado a dos
erlenmeyer que contenían 95 mL. de agua peptonada, se agitaron durante dos horas cada 20
minutos y se dejaron sedimentar; se filtró el sobrenadante y se tomaron por separado de
cada tratamiento una alícuota de 1 mL. con el fin de preparar la batería de diluciones en dos
tubos de ensayo que contenían 9 mL. de solución salina estéril. Se prepararon diluciones
de los microorganismos de cada tratamiento desde 1/10 hasta 1/100.000.000, de cada
dilución se tomó 1 mL.. con pipeta serológica para ser sembrados por extensión en cajas de
petri con agar recuento; Las cajas se incubaron a temperatura ambiente de manera invertida
de 24 -36 horas. En la cámara de Quebec se contaron las UFC (Unidades formadoras de
colonias / mL.) en las cajas que presentaron un crecimiento entre 30 y 300 colonias.
2.3.2.2.2 Aislamiento de bacterias presentes en el suelo. Para aislar las bacterias, se llevó
a cabo la incubación, durante 72 horas, de 10 gramos de suelo rizosférico contaminado con
crudo Cusiana y 10 gramos de suelo sin crudo (sustrato), distribuidos en cantidades de 1
gramo en 20 recipientes con 20 mL. de agua peptonada al 2.5 % p/v cada uno. Se
sembraron por agotamiento en varias cajas de Petri con un asa de punta redonda. Las cajas
de Petri contenían un medio de cultivo selectivo (agar Nutritivo + Suelo en una
concentración del 1%). Después de una semana de incubación a temperatura ambiente, se
efectuaron varios repiques en las condiciones mencionadas y se inició el aislamiento
teniendo en cuenta las características microscópicas y morfológicas de las colonias
resultantes. Las cepas aisladas se caracterizaron morfológicamente por medio de tinción de
Gram y por pruebas bioquímicas.
2.4 CRUDO.
2.4.1 Caracterización físico – química.
2.4.1.1 Tipo de crudo. El crudo que se utilizó para la realización de este proyecto fue
suministrado por la EMPRESA COLOMBIANA DE PETROLEOS, Gerencia Complejo de
Barrancabermeja, procedente del campo de producción Cusiana.
2.4.1.2 Propiedades físicas. Las principales propiedades físicas del crudo utilizado se
determinaron experimentalmente; los métodos empleados se ilustran en la Tabla 2.

Tabla 2. Métodos utilizados para la determinación de las propiedades físicas del crudo
suministrado como sustrato contaminante (crudo Cusiana).
Propiedad física Método utilizado

Densidad absoluta a 25ºC, g/mL. Picnómetro
Gravedad API a 60º F, 0API Probeta y densímetro
Viscosidad, cp Brookfield
Flash Point, º C Copa cerrada, ASTM D -56º (Anexo A)
2.4.1.3 Rendimiento y composición química del crudo. Esta información fue
suministrada por la Empresa Colombiana de Petróleos.
2.4.2 Ensayo de penetrabilidad. Mediante la simulación de un derrame, se determinó la
profundidad máxima a la cual el crudo penetró en el suelo. Para ello se tomaron muestras
del suelo a 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80 cm de profundidad, las cuales fueron diluidas en
agua y dejadas en reposo durante 24 horas. Pasado este tiempo, se procedió a la búsqueda
de formaciones de una fase aceitosa sobre él liquido.
2.4.3 Ensayo de evaporación. Se efectúo una prueba con el fin de determinar el
porcentaje de evaporación del crudo Cusiana. Para tal efecto, se depositaron por triplicado
50 mL. de crudo en tres frascos abiertos a condiciones de campo bajo techo por 20 días. Se
tomaron el peso inicial y final de cada uno de ellos y se calculó el porcentaje de
evaporación.
2.4.4 Caracterización microbiológica. Para el aislamiento de bacterias, se sembraron por
agotamiento (la cantidad de crudo tomada por un asa de punta redonda), en varias cajas de
Petri que contenían medios de cultivo selectivos: agar nutritivo modificado (agar nutritivo
+ 2 % crudo); después de una semana de incubación a temperatura ambiente, se inició el
aislamiento teniendo en cuenta diferencias morfológicas y microscópicas de las colonias
resultantes.
2.5 PLANTAS.
Se estudió el efecto del crudo en el desarrollo de las plantas a nivel de laboratorio y de
campo
2.5.1 Selección de plantas para las pruebas de biodegradación. Los siguientes factores
se tuvieron en cuenta en el momento de la selección de especies vegetales:
♦ Plantas con alta capacidad reproductora, gran poder de adaptación a diferentes
condiciones de clima y suelo, alta capacidad para soportar condiciones adversas de
humedad, temperatura, contaminación; buena capacidad de propagación vegetativa por
semillas, tallos, rizomas, bulbos y raíces; desarrollo rápido de raíces y partes aéreas.
♦ Plantas que no fueran de consumo humano.
♦ Plantas con un flujo de materiales relativamente bajo hacia productores secundarios.
♦ Plantas con una amplia distribución en Colombia.

♦ Plantas diferentes a la maleza.
Los Cuadros 1A y 1B describen e incluyen las plantas seleccionadas para el proceso de
biodegradación.
El tipo de reproducción seleccionado para obtener mejores resultados en corto tiempo fue el
recomendado por los Agrónomos; además, en algunas especies se alternó la reproducción
Cuadro 1A Plantas seleccionadas para las pruebas de Fitobactoremediación (I parte).
Nombre
Especie Familia Características. Reproducción
Vulgar
Especie perenne que crece en matojos, muy
Hyparrhenia Pasto adaptado al clima cálido, resistente a la Sexual
Gramíneas
rufa puntero sequía, a las quemas y al pisoteo, no es muy vegetativa
exigente en suelos
Especie perenne de crecimiento erecto, tiene
Dichanthium Pasto gran macollamiento; resistente a la humedad y Sexual
Gramíneas
aristatum angleton a la sequía. Se adapta a diferentes tipos de vegetativa
suelos.
Especie perenne de crecimiento en matojo,
Brachiaria
está muy bien adaptada al clima cálido, es
decumbens. Pasto Sexual
Gramíneas resistente a la sequía, a las quemas, soporta
Brachiaria braquiaria vegetativa
bien las condiciones de suelos ácidos y pobres
brizantha
en nutrientes
Puede ser Brachiaria radicans o Brachiaria
plantaginea es una especie de muy reciente
Brachiaria introducción. Son plantas perennes, con
vegetativ
spp. Gramíneas Braquipará estolones duros que emiten raíces en los
a
nudos y dan origen a nuevas plantas. Tallos
decumbentes, nudos densamente pilosos,
vainas pubescentes de 10 a 20 cm de longitud.
Especie perenne de crecimiento en macollas,
crece en una amplia variedad de suelos, desde
Andropogon fértiles hasta infértiles; se caracteriza por Sexual
Gramíneas Andropogon
gayanus tolerar suelos de muy baja fertilidad, ácidos, vegetativa
de textura suelta y tolerante a veranos
prolongados
Especie perennes de crecimiento en matojos.
Saccharum Caña vegetativa
Gramíneas Se adapta a gran diversidad de suelos,
officinarum forrajera (Cepas)
resistente a la sequía.
Crece bien hasta las alturas de 1.800 metros
sobre el nivel del mar, las temperaturas más
Cajanus
Fabáceas Guandul favorables están entre 20 y 30º C, se Sexual
cajan
desarrolla en suelos pobres con buenos
resultados en suelos sueltos o francos
Anual, trepadora, de crecimiento rápido.
Canavalia
Fabáceas Canavalia Tiene raíces profundas y es resistente a la Sexual
ensiformis
sequía
Las plantas son postradas o rastreras,
Desmodium Sexual
Fabáceas Amor seco subarbustos erectos Crece en un amplio rango
spp vegetativa
de climas y son resistentes a las sequías.
Cuadro 1B Plantas seleccionadas para las pruebas de Fitobactoremediación (II parte)
Nombre
Especie Familia Características Reproducción
Vulgar
Crece en forma de enredadera, de duración
perenne, raíces profundas, abundantes y ricas
Pueraria
Kudzu en nódulos. Crece bien en climas cálidos, es
Fabáceas Sexual
tropical tolerante a la sequía moderada a la alta
phaseoloides
humedad del suelo, es poco exigente en
suelos.
Se adapta bien desde el nivel del mar hasta
3.200 m.s.n.m. se produce bien en clima
Medicago
Fabáceas Alfalfa cálido y medio, exigen suelos fértiles, bien Sexual
sativa
drenados, raíz profunda lo que le da
resistencia a la sequía
Crotalaria Especie erecta, anual y magnifica fijadora de
Fabáceas Crotalaria Sexual
juncea nitrógeno.
Vigna
Fabáceas Caupi Leguminosa anual, de crecimiento vigoroso. Sexual
ungiculata
Leguminosa arbórea y perenne cuya rusticidad
y reproducción vegetativa le permite
desarrollarse en condiciones adversas. Con
Gliricidia Vegetativa
Fabáceas Matarratón raíces profundas, se desarrolla en una amplia
sepium (estacas)
variedad de suelos, incluyendo los ácidos y
los erosionados, soporta bien la sequía,
prefiere los suelos livianos y profundos.
Leucaena Mimosáceas Leucaena Se comporta bien en suelos de baja fertilidad, Sexual
pedregosos y pesados. Tiene la propiedad de
leucocephala profundizar fácilmente su raíz pivotante en
corto tiempo.
Mimosa Mimosáceas Dormidera Leguminosa de baja talla, altamente invasora. Sexual
pudica Especie resistente a condiciones adversas. Vegetativa
Requiere suelos profundos, bien drenados y
Boehmeria ricos en materia orgánica, susceptible a la Vegetativa
Urticáceas Ramio
nivea sequía. Posee gran capacidad para extraer (Cepas)
minerales del suelo.
Arbol ornamental de más de 5 mts de alto,
origen desconocido, bastante ramificado
desde su base, hojas alternas compuestas
Swinglea trifoliadas, imparipinadas, el foliolo central Sexual
Rutáceas Swinglea
glutinosa más grande, oblongo a lanceolado, siempre vegetativa
verde oliva, brillante. Fruto similar a un
limón, grande, poco jugoso cascara bastante
gruesa. (74).
Planta erecta y anual, de 90 cm a 2.5 mts de
Helianthus Semilla
Asteraceas Girasol alto, hojas en espiral, fruto recorrido por
annuus L. sexual
rayas. Se adapta bien a diferentes climas. (74)
vegetativa y sexual con lo que se evitó dar resultados desalentadores como lo es la baja
germinación de la mayoría de las semillas al estar en un suelo contaminado.
Para obtener éxito en los resultados se utilizaron semillas sexuales comercialmente
certificadas y de buena calidad, distribuidas por Semicol (Bogotá), y las semillas
vegetativas de Gramíneas, Fabáceas, Mimosáceas, Urticáceas y Rutáceas provenían de los
alrededores del área de estudio.
Las semillas de Leucaena leucocephala, Pueraria phaseoloides, Brachiaria decumbens y
Brachiaria brizantha se dejaron en agua caliente (50º C) durante 24 horas, como
tratamiento pregerminativo. Además, todas las semillas se desinfectaron con agua destilada
e hipoclorito de sodio al 0.5% y adicionalmente con seis lavados de agua estéril.

2.5.2 Selección de plantas resistentes a la contaminación con crudo Cusiana. Para
dicha selección se tuvieron en cuenta las siguientes variables de crecimiento:
1) Germinación de las plantas de estudio en un sustrato contaminado con crudo Cusiana.
En esta prueba se hicieron ensayos por triplicado y se utilizaron dos metodologías:
 Se evaluó el porcentaje de germinación de las plantas cultivadas en un medio
hidropónico de Jensen con crudo / sin crudo. En esta prueba se utilizaron 50 semillas por
especie las cuales fueron puestas en cajas de petri que contenían algodón y medio de Jensen
modificado con crudo al 0%, 3%, 7%, y 15% durante una semana.
Medio de Jensen.
Solución de reserva: (‘Stock’)
H3BO3 0.31 g
NaMoO4 0.01 g
CuSO4.5H2O 0.01 g
KCl 0.041 g
CaCL2 0.001g
Agua destilada 250 mL.
Preparación de un litro del medio
CaHPO4 1.0 g
K2HPO4 0.2 g
MgSO4. 7H2O 0.2 g
NaCl 0.2 g
FeCl3 0.1 g
Solución ‘Stock’ 5 mL.
Agua destilada 1000 mL.
Este medio fue modificado agregando crudo al 3%, 7%, y 15%

Si el porcentaje de germinación era igual o superior al 80% las semillas se consideraban
viables. Como en suelos contaminados la germinación disminuye debido a la toxicidad
producida por los hidrocarburos volátiles, la viabilidad de la semilla respecto al porcentaje
de germinación era variable. De acuerdo a los costos de siembra fue conveniente
seleccionar semillas con un porcentaje de germinación igual o superior al 70% en sustratos
contaminados.
El porcentaje de germinación esta dado por la ecuación 2
%Germinación Número semillas germinadas x 100 (2)

= Número semillas sembradas
 Se evaluó el porcentaje de germinación de las plantas cultivadas en un sustrato de arena
y sustrato de arena modificada con crudo al 10% y 30%. En esta prueba se sembraron 100
semillas certificadas de cada especie por tratamiento en germinadores de arena esterilizada
(con agua caliente) y en germinadores de arena esterilizada más crudo al 10% p/p y al 30%
p/p, a una profundidad de 1 cm, con riego constante, a fin de mantener el valor de humedad
óptimo para la germinación. Posteriormente para su elección se tomaron las semillas con
un porcentaje de germinación mayor al 70% en suelos contaminados.
Se efectuó un registro diario de las plantas germinadas hasta seis días después, fecha que se
tomó como fin de la germinación e inicio del período de crecimiento (tiempo cero).
2) Crecimiento de las plantas de estudio en un sustrato contaminado con crudo Cusiana.
En esta prueba se hicieron ensayos por triplicado y se utilizaron tres metodologías:
 Se evaluó el crecimiento de las plántulas resistentes a la contaminación en un sustrato
de arena y sustrato de arena modificada con crudo al 10% y 30%. En esta prueba se hizo el
seguimiento de las semillas germinadas de la prueba anterior, efectuándose un conteo diario
de las plántulas que sobrevivían.
 Se evaluó el crecimiento de las semillas vegetativas (estacas) de Gliricidia sepium
cultivadas en un suelo sin crudo y un suelo con crudo al 10% y 30%. En esta prueba se
sembraron por tratamiento, 50 estacas de forma puntiaguda con dimensiones de 25 cm de
longitud y 1.5 cm de diámetro a la circunferencia media del tallo, de madera suave (verde)
provenientes de arboles de un año de edad. Las puntas inferiores de las estacas se
humedecieron y se les depositó una capa delgada de hormonagro, luego fueron sembradas
en suelos patrón y suelos contaminados con crudo. Se efectuó un registro diario de las
estacas que presentaron rebrotes para realizarles análisis posteriores.
 Se evaluó el crecimiento de las semillas vegetativas (cepas), cultivadas en un suelo sin
crudo y un suelo con crudo al 10% y 30%. En esta prueba se tomaron cepas provenientes
del área de estudio con raíces desnudas y desinfectadas con hipoclorito de sodio al 5%;
posteriormente se sembraron en suelos patrón y suelos contaminados con crudo. Las
pruebas de crecimiento se realizaron por un período de tres meses en el cual las plantas
estuvieron expuestas a la intemperie, sin adición de fertilizantes, con un riego continuo y

arado semanal. En esta prueba se buscó observar la planta de mayor crecimiento,
propagación y cobertura en el menor tiempo posible, con el menor costo, en suelos
contaminados con hidrocarburos.
Se realizaron pruebas adicionales, donde se mezclaron Brachiaria decumbens y Brachiaria
brizantha con Mimosa pudica en el suelo contaminado con crudo y en otro sin crudo
(patrón).
2.6 BACTERIAS.
2.6.1 Selección de bacterias para los procesos de Fitobactorremediación y
Biodegradación in Situ' por bioaumentación. Para la realización de este trabajo
experimental de Fitobactorremediación y Biodegradación in Situ' se diseñaron dos
modelos:
1) Adaptación de los microorganismos aislados para la bioaumentación en agar nutritivo y
agar nutritivo modificado con crudo Cusiana. Con este modelo se buscó la influencia de
las Bacterias en el desarrollo fisiológico de las plantas, para que éstas últimas se encargaran
de la fitorremediación.
Los microorganismos que se utilizaron en este tratamiento fueron obtenidos por aislamiento
a partir del suelo a rehabilitar (autóctonos) y de microorganismos aportados por el
CENTRO DE INNOVACION EN BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL (CINBIN).

Las bacterias del suelo, objeto del presente estudio de Biotecnología aplicada y las bacterias
‘foráneas’ crecieron inicialmente por separado en agar nutritivo modificado (ANM), el cual
presentaba la siguiente composición:
Peptona 5.0 g/L

Extracto de carne 3 g/L
Agar - agar 12 g/L
Este medio se modificó adicionando extracto de raíces al 10%, suelo (10 g/L) proveniente
de los semilleros y crudo (0.5, 1 y 2%) con el fin de estimular la memoria metabólica y
conseguir su adaptación.
Al completarse el crecimiento de las bacterias adaptadas a estas condiciones, se procedió a
aislar, preservar y repicar las bacterias sobrevivientes en un medio de agar nutritivo
modificado con concentraciones de crudo del 2 % v/v. Se realizaron repiques seriados
cada 25 días para evitar el deterioro.
Para la selección de bacterias adaptadas se tuvo en cuenta su capacidad de crecimiento en
agar nutritivo modificado con crudo. Se realizó un examen macroscópico y otro
microscópico al cultivo obtenido y además se tomaron muestras con montaje en placa para
su posterior identificación.
2) Adaptación de los microorganismos para la bioaumentación en medio con sales. . Con
este modelo se buscó la influencia de las plantas en el desarrollo fisiológico de las
bacterias, para que éstas últimas se encargaran de la biodegradación.
Los microorganismos 'autóctonos' que se utilizaron en este proceso fueron obtenidos por
aislamiento a partir de la rizosfera de plantas resistentes a la contaminación utilizadas en las
pruebas de crecimiento.
Los consorcios microbianos aislados fueron inoculados inicialmente en tres frascos de
vidrio de 300 mL. que contenían 120 mL. del medio con sales (A) modificado con crudo al
1% en cada uno de ellos, pasada una semana se tomó 1 mL. de este medio y se inoculó en
un medio con sales (A) modificado con crudo al 3%, este procedimiento se repitió a
concentraciones crecientes del contaminante hasta llegar a una concentración del 10%.
Estos frascos fueron sellados con un tapón de caucho a través de los cuales se introdujeron
dos mangueras de plástico: una para suministro de oxígeno, la siguiente para salida de
gases. El cultivo permaneció a temperatura ambiente, con pH no controlado y con
aireación continua, suministrada por bombas neumáticas bajo condiciones de esterilidad.
La composición del medio de sales A fue la siguiente:
Cloruro de sodio 5.0 g/L

Sulfato de Magnesio 0.2 g/L
Fosfato ácido de amonio 1.0 g/L
Fosfato ácido de potasio 1.0 g/L
Sulfato de amonio 0.5 g/L
Extracto de levadura 0.02 g/L
Este medio se modificó adicionando crudo al 10%.

Después fue transferido asépticamente a un tubo de ensayo que presentaba el medio de
mantenimiento (Medio de sales B) y se almacenó en refrigeración para la posterior
identificación de las bacterias sobrevivientes. La composición del medio de sales B fue la
siguiente: (24).

Fosfato ácido de sodio 5.68 g/L
Cloruro de amonio 1.00 g/L
Cloruro férrico 1.50 mg/L
Cloruro de calcio 0.15 mg/L
Crudo Cusiana 16 g/L
Agar 25.0 g/L
Para la selección se tuvo en cuenta el crecimiento de las bacterias en el medio de sales B lo
cual determinó su capacidad degradativa. Se le realizaron exámenes macroscópico y
microscópico al cultivo obtenido y se tomaron muestras para montaje en placa y su
posterior identificación.
2.6.2 Identificación de bacterias para el proceso de biodegradación 'in Situ' La
identificación se realizó por el Centro de Innovación en Biotecnología Industrial (CINBIN).
El fundamento teórico de las pruebas realizadas para las bacterias se presenta en el AnexoB
2.6.3 Optimización del crecimiento del Pool bacteriano bioaumentado y adaptado a
un medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10% dentro de las
condiciones de laboratorio. Las variables definidas fueron:

 Clase de medio nutritivo. Se observó el crecimiento del Pool bacteriano en dos medios:
a) Medio nutritivo A, modificado con crudo (1 g/L, y 10 g/L) y extracto de raíces de las
plantas seleccionadas (10%), cuya composición fue la siguiente:
Infusión Cerebro Corazón 1/10

Glucosa comercial 1%
Peptona 1%
Suelo 10%
b) Medio de agar avena (AAC) modificado con concentraciones progresivas de crudo (0.5,
1,0 y 2%) con la siguiente composición:
Avena molida 15 g/L

Suelo 5 g/L
Agar - agar 12 g/L
 Presencia o ausencia de sustrato (crudo Cusiana al 10%). Se evaluó el efecto del
crudo sobre el desarrollo de los microorganismos.
Inicialmente las cepas crecieron en un medio nutritivo A y en agar avena. Debido a las
altas contaminaciones con hongos en este último, se decidió cultivar y aislar las cepas en el
agar nutritivo. Estas cepas fueron aisladas por sus características morfológicas y se
inocularon individualmente en dos frascos de vidrio de 300 mL. que contenían el medio
nutritivo A, a uno de ellos se le inoculó Bacilos y al otro se le inoculó Cocobacilos, Cocos y
Pseudomonas putida (CINBIN).

Cuatro días después se procedió al montaje de las curvas de crecimiento de los
microorganismos utilizando el siguiente patrón metodológico: Se prepararon preinóculos
de 350 mL. de: a) Pool de Bacilos + medio A + crudo al 10%, b) Pool de Bacilos + medio
A, c) Pool de Cocobacilos. - Cocos - Pseudomonas putida (CINBIN) + medio A y d) Pool
de Cocobacilos. - Cocos - Pseudomonas putida (CINBIN) + medio A + crudo al 10%;
incubados durante 24 horas a temperatura ambiente.
Pasado el tiempo de incubación, se tomó 1 mL. de cada preinóculo para la preparación de
los inóculos y se diluyeron por separado en cuatro frascos que contenían 19 mL. de
solución salina estéril, de cada uno de ellos se tomó 1 mL. para realizar la valoración del
recuento inicial de UFC / mL. y los 19 mL. restantes se adicionaron a cuatro frascos que
contenían 2500 mL. del medio nutritivo A. El cultivo se mantuvo a temperatura ambiente y
con aireación permanente suministrada por bombas neumáticas.
Cada 24 horas se retiró de cada cultivo una alícuota de 1 mL. con el fin de preparar la
batería de diluciones en tubos de ensayo con 9 mL. de solución salina estéril. Para
determinar la concentración microbiana se prepararon diluciones de los microorganismos
desde 1/10 hasta 1/100.000.000. De cada dilución se tomó 1.0 mL. con pipeta serológica
para ser sembrados por extensión en cajas de petri que contenían agar de recuento “Plate
count” que mostró la siguiente composición:
Extracto de carne 0.6 g/L

Trytona 1.0 g/L
Dextrosa 0.2 g/L
Agar - agar 15 g/L
Para este medio, se ajustó el pH a 6.8.
Las cajas fueron incubadas de 24 a 36 horas a una temperatura ambiente. En las cajas se
contaron las UFC / mL. que presentaron un crecimiento entre 30 y 300 colonias. Los datos
fueron tabulados y graficados. Cada una de estas pruebas se procesó por triplicado.
2.6.4 Optimización del crecimiento del consorcio bacteriano bioaumentado y
adaptado a un medio sales y medio sales modificado con crudo al 10% dentro de las
condiciones de laboratorio. En esta prueba se hicieron ensayos por triplicado y se
utilizaron dos procedimientos:
1) Determinación del porcentaje de biodegradación. Los microorganismos que se
utilizaron en este proceso fueron obtenidos por aislamiento del medio de mantenimiento
(Medio de sales B). Las variables definidas para las pruebas de biodegradación fueron:
♦ Concentración de nutrientes. Se establecieron dos condiciones de trabajo: medios de
sales con una concentración de nutrientes alta (C) y medios de sales con una concentración
de nutrientes baja (D), cuyas composiciones son respectivamente:
Medio de sales C. (según Ercoli et al)
Cloruro de sodio 5.0 g/L

Sulfato de Magnesio 0.2 g/L
Fosfato ácido de amonio 1.0 g/L
Sulfato de amonio 3.0 g/L
Micronutrientes C 10.0 mL./L
Micronutrientes C.
Sulfato de Hierro heptahidratado 275 mL.

Sulfato de Zinc heptahidratado 550 mg/L
Cloruro de Calcio heptahidratado 110 mg/L
Cloruro de Manganeso heptahidratado 275 mg/L
Sulfato de Cobre heptahidratado 110 mg/L
Sulfato de Cobalto heptahidratado 110 mg/L
Cloruro de potasio 2750 mg/L
Cloruro de sodio 2750 mg/L
Este medio fue modificado adicionando crudo (10 g/L)
Medio de sales D.
Fosfato de amonio 0.6 g/L

Sulfato de Magnesio heptahidratado 0,2 g/L
Cloruro de potasio 0,2 g/L
Cloruro de sodio 5,0 g/L
Este medio se modificó adicionando crudo (10 g/L).
♦ Uso de biosurfactante. Se establecieron dos condiciones de trabajo, medios C y D con
0.22 mL. de Tween 80 y, medios C y D sin Tween 80.
Para obtener los porcentajes de biodegradación se partió de un preinóculo del consorcio
seleccionado (Consorcio I, II, III y IV), incubados durante 24 horas en 600 mL. del medio
de sales B. Pasado el tiempo de incubación, se tomaron 180 mL. del preinóculo y se
diluyeron en 180 frascos de vidrio de 300 mL., que contenían los siguiente tratamientos:
(Cuadro 2).
Cuadro 2. Tratamientos utilizados para realizar las curvas de biodegradación en un medio
de sales C o D en presencia / ausencia de surfactantes.
Tratamientos 110 mL. del 110 mL. del Crudo Biosurfactante 1 mL. de
c/u con 30 frascos Medio sales C Medio sales D 10% 0.2 % v/v inóculo
1 + + + +
2 + + +
3 + + + +
4 + + +
5* + +
6* + +
+ Indica presencia.
* Indica el tratamiento patrón (Sirvió para determinar las perdidas por evaporación).
Cada frasco se trabajó bajo condiciones de esterilidad, a temperatura ambiente, con pH no
controlado y estuvieron sellados con tapones de caucho a través de los cuales se introdujeron
dos mangueras: una para suministro de oxígeno y otra para la salida de gases.
Para obtener las curvas de biodegradación se tomaron tres frascos por tratamiento cada 14
horas durante seis días y cada una de estas muestras fueron llevadas a un pH ácido por la
adición de H2SO4, y sometidas en el laboratorio a 3 extracciones seriadas con n -Hexano en
un embudo de decantación.
Posteriormente, se separó el sobrenadante y se sometió a evaporación del n –Hexano; el
residuo remanente previamente seco se pesó en una balanza analítica. Se efectuaron

registros diarios por diez días de los pesos del crudo remanente, para posteriores análisis de
las curvas de biodegradación.
El cálculo de la cantidad de crudo total remanente en cada uno de los frascos se dio por la
ecuación (3).
Cr − Wf
(3)
V
Donde,
Cr = Cantidad de residuo del hidrocarburo en gramos
(peso del vaso con crudo remanente - peso del vaso seco)
Wf = Peso del vaso en g.
V = Volumen de muestra en L.
Los porcentajes de degradación de cada experimento se obtuvieron aplicando la ecuación
(4).
 Wci − Wcf   Wpi − wpf 

% De gra dación =  −   * 100 (4)
 Wci   Wpi 
Donde,
Wci = Contenido de crudo en g/L en la muestra inicial
Wcf = Contenido de crudo en g/L en la muestra después de la acción microbiana
Wpi = Contenido de crudo en g/L en la muestra inicial del tratamiento patrón

Wpf = Contenido de crudo en g/L en la muestra final del tratamiento patrón.
Los porcentajes de evaporación, determinados por el patrón, fueron restados a los
porcentajes de degradación. De esta forma se evitó incluir dentro de la biodegradación las
tasas de evaporación producidas por la oxigenación y la volatilización natural del crudo.
2) Crecimiento y recuento de los consorcios bacterianos adaptados en medio de sales y
medio de sales modificado con crudo Cusiana. Después de los análisis de los porcentajes
de biodegradación, la influencia del medio en dicha degradación, los aportes de sales al
suelo, las variaciones de pH, los beneficios económicos y los aportes de una población
bacteriana bioaumentada necesaria, se decidió seguir trabajando con el medio D y con los
mismos valores de temperatura y pH del procedimiento anterior.
De igual manera, se determinaron las curvas de crecimiento por el anterior procedimiento
(UFC / mL.) en el medio de sales D, modificado con / sin crudo para establecer, por
comparación, el efecto del crudo sobre el desarrollo de los microorganismos.
Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente en preinóculos de 350 mL e
inóculos de 2500 mL con aireación permanente suministrada por bombas neumáticas y en
condiciones de esterilidad. Cada una de estas pruebas se trabajó por triplicado.
2.6.5 Mantenimiento de los microorganismos seleccionados para el biorreactor. Se
seleccionaron tres biorreactores para el crecimiento de los consorcios microbianos.

Primer biorreactor (peso 4.366 Kg) Pool de Bacilos
Segundo biorreactor (peso 4.435 Kg) Pool de Cocos – Cocobacilos
Tercer biorreactor (peso 4.289 Kg) Consorcios I, II, III y IV
En la Figura 12 se observan los biorreactores usados en el laboratorio para las pruebas de
biodegradación.
Figura 12 Vista general de los biorreactores utilizados para el cultivo y multiplicación de
los diferentes tipos microbianos
Cada uno de los biorreactores presentó las siguientes características.
 Cuerpo del biorreactor. El material con el que construyeron los biorreactores de
crecimiento microbiano fue acrílico, éste soporto las condiciones de operación (baja presión
y temperatura ambiente) y es inerte a procesos bioquímicos por parte de los
microorganismos. También permitió realizar satisfactoriamente ciclos de esterilización y

observar el desarrollo del bioproceso. Las dimensiones de los biorreactores destinados al
crecimiento de la biomasa microbiana se observan en la Tabla 3.
Tabla 3. Dimensiones de operación de los biorreactores para el crecimiento de la biomasa
microbiana
Dimensión Valor
Diámetro del biorreactor, m 0.2
Altura del biorreactor, m 0.5
Volumen total de biorreactor, m3 1.5708 x 10-2
Volumen de operación, m3 1.2083 x 10-2
Altura del liquido, m 0.3846
Relación H/D 2.5
 Bafles Deflectores. Se utilizaron dos bafles deflectores ubicados en la pared del tanque
del biorreactor. Los objetivos de la adición de bafles deflectores fueron: prevenir la
formación de vórtices dentro del líquido, facilitar la transferencia de potencia sobre éste en
forma de flujo turbulento y facilitar su movimiento homogéneo a través de todo el reactor,
garantizando un mezclado eficiente.
 Dispersor. El biorreactor presentó un dispersor de pastilla perforada, construido en acero
inoxidable, evitando de esta forma la posible corrosión causada por los microorganismos y
sus metabolitos.
 Tubería y accesorios de flujo. Para su diseño se utilizó tubería de PVC de 1/2 pulgada
de diámetro, por su disponibilidad, facilidad de montaje, bajo costo y resistencia a las
condiciones de corrosión a las cuales se vió sometido.

 Compresor. Los biorreactores se alimentaron con aire comprimido mediante el uso de
un compresor centrífugo de una etapa con una potencia nominal de 3/4 HP, y un caudal de
2.25 SCFM (pies cúbicos estándar por minuto). Su flujo de salida se controló con una
válvula de bola de 1/8 de pulgada de diámetro, construida en bronce, a la cual se le adaptó
una expansión de tubería de 1/8 a 1/2 pulgada.
El compresor funcionó continuamente durante 16 horas, con ocho horas de descanso,
tiempo en el cual se le realizó el mantenimiento. Operó continuamente durante los 30 días
destinados para el tratamiento 'in Situ'. Las ocho horas de descanso fueron reemplazadas
por bombas neumáticas con salidas de aire de 20 cm3 / s.
El procedimiento de limpieza y esterilización de los biorreactores se llevó a cabo en tres
pasos:
 Lavado con agua y detergente en polvo
 Lavado con agua y solución de hipoclorito de sodio
 Calentamiento del agua con resistencias por dos horas, luego se dejó enfriar y se
repitió tres veces por día durante tres días el mismo procedimiento.
Para la producción de los microorganismos a gran escala se tuvieron en cuenta los
siguientes parámetros:
1) Medio. Para el crecimiento del Pool bacteriano ‘Bacilos’ y del Pool bacteriano
Cocobacilos – Cocos – Pseudomonas putida en el biorreactor, se empleó el medio nutritivo
B que presentó la siguiente composición:
Nitrato de amonio 0.1 g/L

Caldo de lactosa 2.7 g/L
Peptona 1 g/L
Para el crecimiento en el biorreactor de los consorcios I, II,III y IV, se empleó el medio de
sales D que presentó la siguiente composición:
Fosfato de amonio 0.6 g/L

Sulfato de Magnesio heptahidratado 0,2 g/L
Cloruro de potasio 0,2 g/L
Cloruro de sodio 5,0 g/L
Estos medios proporcionaron un pH cercano a la neutralidad con bajas variaciones, se
caracterizaron por ser medios muy utilizados por el Centro de Innovación en Biotecnología
Industrial (CINBIN) con buenos resultados y bajos costos. Todos los cultivos se llevaron a
cabo en condiciones de total asepsia con el fin de medir los efectos de los inóculos usados
sin la interferencia de otros tipos microbianos.
A cada biorreactor se le adicionó un volumen de 9500 mL. del medio fresco y estéril.
2) Preparación del inóculo. Se tomó con un asa de punta redonda un raspado suave de las
cajas de Petri correspondientes a cada una de las cepas elegidas, diluyendo por separado la
biomasa tomada con el asa en su correspondiente preinóculo, a) Pool de Bacilos más 2500
mL. de medio nutritivo B, b) Pool de Cocobacilos - Cocos más 2500 mL. de medio
nutritivo B, c) consorcio I, II, III y IV más 2500 mL. del medio de sales D.
Estos preinóculos se incubaron durante 48 horas a temperatura ambiente. Pasado el tiempo
de incubación, se tomó 1 mL. de cada preinóculo para la valoración del recuento inicial de
UFC / mL. y el restante se adicionó a tres biorreactores que contenían cada uno de ellos
9500 mL. del medio nutritivo B destinado para la producción a gran escala del Pool de
Bacilos, 9500 mL. del medio nutritivo B destinado para la producción a gran escala del
Pool de Cocobacilos - Cocos - Pseudomonas putida y 9500 mL. del medio de sales D
destinado para la producción a gran escala de los consorcios I, II, III y IV. Durante todo el
tiempo del tratamiento ‘in Situ’ se mantuvo bajo condiciones oxigénicas en el laboratorio
un inóculo de cada consorcio con las mismas características.
El volumen de operación de cada biorreactor fue del 80%, es decir 12 litros; dicho volumen
se consideró por las siguientes razones:
• La necesidad de suplir a cada era de tierra un volumen de microorganismos viable (700
mL. de inóculo para cada tratamiento).
• Dejar un espacio para la posible formación de espuma.
• Mantener una carga de cultivo como reserva.
• La necesidad de tomar volúmenes para el monitoreo de las variables de pH y
concentración de biomasa microbiana.

• La consideración de pérdidas por la formación de espuma y arrastre de aire.
3) Condiciones de operación. Se tuvieron en cuenta las siguientes condiciones de
operación:
• Presión. Dado que los microorganismos escogidos fueron de superficie y no podían
soportar presiones muy altas, se debió trabajar a bajas presiones. Por consiguiente, solo fue
necesario inyectar el aire a una presión capaz de vencer la resistencia de la columna de
fluido que estuvo por encima del punto de inyección.
• Temperatura. Los microorganismos empleados en este proceso de biodegradación se
adaptaron al valor de la temperatura ambiente.
• pH. Se mantuvo en entre 4.5 - 7.8 óptimo para cada uno de los cultivos celulares.
• Aireación. Debido a que los microorganismos escogidos necesitan oxígeno para su
crecimiento, desarrollo y multiplicación, se decidió colocar un punto de inyección de aire
comprimido, que garantizara el suministro de éste, en el fondo de los bioreactores.
• Agitación. Se aprovechó la energía suministrada al inyectar aire comprimido a los
bioreactores y se utilizó para la agitación del sistema. La necesidad del suministro de
disolución y oxígeno homogeinizado en el sustrato de crecimiento, hizo que el tipo de
reactor 'Air - Lift' o agitado por aire, fuera el mejor modelo para el desarrollo del proyecto.
4) Condiciones de escalado. Teniendo en cuenta las condiciones básicas para el escalado,
se tuvo en cuenta condiciones mínimas como:
• La función del sistema considerado fue muy compleja, ya que albergó consorcios de
microorganismos que se caracterizaron por tener un comportamiento al azar.
• Similitud dinámica, para ello se utilizó el mismo medio de cultivo en los biorreactores de
laboratorio como para los biorreactores de mayor tamaño, es decir, un medio de cultivo
para cumplir con las mismas propiedades reológicas; igualmente se colocó como punto de
inyección el centro del recipiente para obtener el mismo patrón de flujo.
• Similitud geométrica, se consideró la misma forma (cilíndrica).
5) Descarga del inóculo microbiano. Para realizar los procesos de Fitobactorremediación a
nivel de campo, se hizo un diseño experimental basado en semilleros, a los que se les
inoculó 700 mL. de biomasa microbiana obtenida de los biorreactores por bioaumentación.
Previamente a la realización del primer riego de los inoculantes en las parcelas de
tratamiento, se estimó la cantidad de células que se encontraban en el biorreactor mediante
recuento en cámara de Neubauer. Esta misma concentración bacteriana obtenida se
adicionó cada tres días a cada una de los semilleros durante los treinta días que duró el
tratamiento, condición necesaria para comparar los efectos biodegradativos de cada
organismo bajo las mismas condiciones

El esquema operativo utilizado en la producción de microorganismos a gran escala,
necesario para el proceso de biodegradación, se muestra en la Figura 13.
Esquema operativo de los

Biorreactores
Limpieza y esterilización
A los 15 días
Regulaciòn del flujo de aire,

temperatura ambiente y
pH expontáneo
A los tres días
Carga del medio de cultivo

días
Carga del inóculo microbiano
Mantenimiento y monitoreo
del crecimiento microbiano
Descarga de la biomasa microbiana
Figura 13 Esquema operativo del proceso de producción de biomasa microbiana.

2.7 INTERRELACION PLANTA - BACTERIA - CRUDO.
2.7.1 Distribución del terreno. Los procesos de Fitorremediación, Bactorremedición,
Fitobactorremediación y Biodegradación natural, se realizaron por duplicado, preparándose

para el cultivo de las plantas e inoculación microbiana siete semilleros con dimensiones de
191 cm x 37 cm, divididos en pequeños semilleros de 47.5 cm x 37 cm, para un total de 28
semilleros (Figura 14).
La preparación de estos semilleros consistió en:
 Adicionar inicialmente una capa de 10 centímetros de arcilla para limitar la lixiviación.
 Posterior a esta capa, se agregó 10 centímetros de arena.
 Luego se adicionó 40 centímetros de suelo de la zona.
 Finalmente, para iniciar las etapas de biodegradación, se seleccionaron 24 semilleros y
a cada uno de ellos se les añadió 40 centímetros (49 kg) de suelo agrícola previamente
homogeinizado y contaminado con crudo Cusiana al 30% p/p. Los 4 semilleros restantes
no se les adicionó crudo Cusiana, obteniéndose de este modo uno de los tratamientos
patrones del diseño experimental.
La Figura 14 muestra la disposición de cada uno de los semilleros y el diseño experimental
utilizado en los bioprocesos de la Biodegradación, la Fitobactorremediación, la
Fitorremediación y el Intemperismo en el área de trabajo.
Dise ño comple tame nte al azar
20 cm
Unidad experimental Semillero

15 cm
47.5 cm
Semilla
vegetativa
37 cm
Croquis: Tratamie ntos
191
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
1 Brachiaria spp + Consorcios I, II, III y IV 15 Brachiaria spp, sin crudo, sin inóculo
2 Suelo + crudo + Consorcios I, II, III y IV 16 Swinglea glutinosa, sin crudo, sin inóculo
3 Swinglea glutinosa + Pool de Cocobacilos – 17 Swinglea glutinosa + Pool de Cocobacilos –
Cocos. Cocos.
4 Swinglea glutinosa + sin inóculo + Crudo 18 Brachiaria spp+ Pool de Cocobacilos – Cocos.
5 Brachiaria spp+ Pool de Cocobacilos – Cocos. 19 Brachiaria spp + Consorcios I, II, III y IV
6 Suelo con crudo, sin inóculo, sin plantas. 20 Swinglea glutinosa+ Consorcios I, II, III y IV
7 Suelo + crudo+ Pool de Cocobacilos – Cocos. 21 Swinglea glutinosa + sin inóculo + crudo
8 Swinglea glutinosa + Consorcios I, II, III IV 22 Brachiaria spp + sin inóculo + crudo
9 Brachiaria spp + Pool de Bacilos 23 Brachiaria spp + Pool de Bacilos
10 Swinglea glutinosa, sin crudo, sin inóculo 24 Suelo con crudo, sin inóculo, sin plantas.
11 Brachiaria spp, sin crudo, sin inóculo 25 Swinglea glutinosa + Pool de Bacilos
12 Swinglea glutinosa + Pool de Bacilos 26 Suelo + crudo + Consorcios I, II, III y IV
13 Brachiaria spp + sin inóculo + crudo 27. Suelo + crudo+ Pool de Cocobacilos – Cocos.
14 Suelo con crudo más Pool de Bacilos 28 Suelo con crudo más Pool de Bacilos.
Biodegradación natural ‘Intemperismo’

Fitorremediación.
Fitobactorremediación.
Biorremediación.
Patrón (sin crudo).
Figura 14 Diagrama de la disposición de los semilleros y del diseño experimental utilizado
en el bioproceso de la Fitobactorremediación, de la Fitorremediación y de la
Biodegradación.
La Figura 15 muestra el aspecto del suelo después de la adición del crudo Cusiana al 30%
p/p y su homogeinización.
A B
Figura 15 (A) vista general y (B) acercamiento del suelo homogeinizado manualmente
con crudo Cusiana al 30% p/p.
Las plantas se cultivaron siete días después de haber contaminado el suelo con crudo
Cusiana, con lo cual a) Se evitó otorgarle beneficios indebidos a los procesos de
Fitobactorremediación y Fitorremediación, debido a las normales pérdidas por
volatilización y lixiviación producida en este tipo de hidrocarburo, y b) Se tuvieron en
cuenta los altos porcentajes de fitotoxicidad, debido a la presencia de elementos volátiles o
de cadenas cortas hidrocarbonadas en el contaminante. Además, para evitar relaciones
antagónicas por parte de los microorganismos bioaumentados, se inocularon dichos
consorcios dos días después del cultivo de las plantas, permitiendo de esta manera una corta
adaptación de ellas al nuevo medio.
Debido a la alta efectividad de las bacterias edáficas para usar el Nitrógeno se hizo
necesario, al momento de la siembra, realizar una fertilización foliar de Nitrógeno como
una aplicación de emergencia por medio de un estimulante agrícola comercial ‘Vitajardin’
con la siguiente formulación.
Aminoácidos 20 g/L
Nitrógeno total 60 g/L
Nitrógeno amoniacal 5 g/L
Nitrógeno nítrico 15 g/L
Nitrógeno ureico 40 g/L
Nitrógeno (alfa-aminico) 2 g/L
Nitrógeno proteico 2 g/L
Materia orgánica total 20 g/L
Fósforo soluble (P2O5) 30 g/L
Potasio (k2O) 50 g/L
El día del transplante, se añadió una única aplicación de 7 mL. de fertilizante por planta con
un aspersor manual. El efecto benéfico de la aplicación foliar se debe, esencialmente, al
Nitrógeno que lleva el fertilizante y no al Fósforo o al Potasio.
2.7.2 Bioproceso de Biorremediación, de Biodegradación natural, de
Fitorremediación y de Fitobactorremediacion 'in Situ'. Para los tratamientos con
plantas se estimo una unidad experimental de siete plantas o siete cepas con alturas
homogéneas. La distancia de separación por cada planta fue de 15 cm y por hileras de 20
cm.
La inoculación bacteriana sobre los tratamientos se hizo dos días después de la siembra, y
se realizo cada tres días por treinta días.
Para lograr los objetivos propuestos respecto a estos bioprocesos, se establecieron 3 fases
experimentales.
FASE 1: Análisis de la Biodegradación, Fitodegradación, Fitobactodegradación sobre el
crudo Cusiana contenido en cada uno de los semilleros. El objetivo de este análisis fue
examinar el efecto de las plantas, de las bacterias y de las bacterias junto con las plantas en
los bioprocesos de biodegradación de suelos contaminados por derrames inducidos de
crudo Cusiana.
Cada diez días y hasta el final del tratamiento, a cada uno de los semilleros se les tomó
muestras de suelo a 20 cm de profundidad de la endorrizosfera, en tres puntos diferentes
distribuidos aleatoriamente sobre la superficie del terreno, con el fin de determinar los
porcentajes de biodegradación; seguidamente, dichas muestras se analizaron mediante los
métodos analíticos que se describen a continuación (estos estudios fueron realizados por la
University of Texas – Houston School of Public Health Research):
• Cromatografía de gases / Detección ionización —flama. Se utilizó un equipo modelo
GC 14 A, marca Shimadzu, Kyoto, ajustado a una columna capilar con sílice fundida para
cromatografía de gases y como gas de arrastre Helio (1 mi/mm). Las temperaturas de
operación fueron: FID = 300ºC e Inyector =280ºC. La temperatura de la columna se
aumenta 8ºC/min, desde 40 a 105ºC y 2.5ºC/min, desde 105 a 280ºC.
• Cromatografía de gases / Espectroscopía de masa. Se realizó usando un equipo
modelo QP 2000 A, marca Shimadzu, ajustado a una columna capilar de sílice fundida. El
instrumento GC/MS es operado en modo de monitoreo de iones selectivos (SIM). Los
compuestos analizados son: n-alcanos (C12 a C32), derivados del naftaleno (C1 a C4),
derivados del fenantreno (C1 a C21) y derivados del dibenzotiofano (C0 a C2).
En el Cuadro 3 se observan cada uno de los tratamientos realizados para el análisis de la
Biodegradación, Fitobactodegradación, Fitodegradación, y Biodegradación natural sobre el
crudo Cusiana en cada una de los semilleros.
Cuadro 3. Tratamientos in Situ para observar los Bioprocesos de Biodegradación natural,
Biorremediación, Fitorremediación y Fitobactorremediación.
Semillero
TRATAMIENTOS Inóculos Crudo Plantas
(Figura 14)
Biodegradación natural
1 --- Si --- 6 y 24
(control 1)
2 Biorremediación Si Si --- 2, 7, 14, 26, 27 y 28
3 Fitorremediación --- Si Si 4, 13, 21 y 22
1, 3, 5, 8, 9, 12, 17,
4 Fitobactorremediación Si Si Si
18, 19, 20, 23, 25.
Diseño experimental. El diseño experimental de campo usado fue completamente aleatorio
en arreglo factorial 3 x 4 (tres tratamientos con plantas y cuatro tratamientos con inóculos),
con dos réplicas para un total de 24 tratamientos.
En el Cuadro 4 se observan cada una de las combinaciones realizadas para el análisis de la
Biodegradación, Fitobactodegradación, Fitodegradación, y Biodegradación natural sobre el
crudo Cusiana en cada una de los semilleros.
Cuadro 4. Tratamientos aplicados para medir los efectos de las plantas, de las bacterias y
de las plantas junto a las bacterias en la biodegradación del crudo Cusiana.

Componentes Tratamientos
Plantas Sin plantas (c0) Swinglea glutinosa (c1) Brachiaria spp (c2)
Inóculo d0 d1 d2 d3 d0 d1 D2 d3 d0 d1 d2 d3
Combinación c0 d0 c0 d1 c0d2 c0 d3 c1 d0 c1 d1 c1 d2 c1 d3 c2 d0 c2 d1 c2 d2 c2 d3
Tratamiento patrón.
* d0 = Sin inóculo; d1 = Pool de Bacilos; d2 = Consorcios I, II, III y IV d3 = Pool de
Cocobacilos – Cocos - Pseudomonas putida.
FASE 2. Análisis del crecimiento de Swinglea glutinosa y Brachiaria spp, en suelos
contaminados con derrames inducidos de crudo. El objetivo de este análisis fue
examinar, sí el desarrollo fisiológico de las plantas cultivadas en suelos contaminados con
derrames inducidos de crudo era ‘normal’ (comparado con el tratamiento patrón sin crudo
‘Cuadro 5’), para así determinar su efectividad en los bioprocesos de Fitorremediación y
Cuadro 5. Tratamientos in Situ para observar los efectos del crudo en el desarrollo
fisiológico de las plantas.
Semilleros
TRATAMIENTOS Inóculos Crudo Plantas
(Figura 14)
1 Control simple 1 --- --- Si 10, 11, 15 y 16
2 Fitorremediación --- Si Si 4, 13, 21 y 22
En el Cuadro 5 se observan los dos tratamientos realizados para examinar los efectos del
crudo Cusiana en el desarrollo fisiológico de las plantas en cada uno de los semilleros.
Diseño experimental. El diseño experimental de campo usado para cada especie vegetal
fue completamente aleatorio con dos réplicas y se comparó:
Brachiaria spp + suelo contaminado contra Brachiaria spp + suelo no contaminado

S. glutinosa + suelo contaminado contra S. glutinosa + suelo contaminado
Para un total de 4 tratamientos para Swinglea glutinosa y 4 tratamientos para Brachiaria
spp.
En el Cuadro 6 se observa cada una de las combinaciones realizadas para el análisis de los
efectos del crudo en el desarrollo vegetal en cada uno de los semilleros.
Cuadro 6. Tratamientos aplicados para medir el efecto del crudo Cusiana en el desarrollo
de las plantas
Plantas Brachiaria spp (C2) Swinglea glutinosa (C1)
Sustrato S0 (Suelo) S1 (Suelo crudo) S0 (Suelo) S1 (Suelo crudo)
Combinación c2 d0 s0 c2 d0 s1 c1 d0 s0 c1 d0 s1
** d0 Sin inóculo.
Con el fin de determinar el efecto del hidrocarburo en el crecimiento de Swinglea glutinosa
y Brachiaria spp cultivadas en suelos contaminados con derrames inducidos de crudo, se
analizaron las siguientes variables:
La altura, el diámetro del tallo y la cobertura de la planta están dados por la ecuación 5.
Altura de la planta = Altura final - altura inicial. (5)

Diámetro del tallo = Diámetro final - diámetro inicial
Cobertura = Cobertura final - cobertura inicial
♦ Altura del vástago: Por medio de un flexómetro, se tomó la medida desde la zona
marcada (a dos centímetros del cuello de la raíz, que es la zona de enlace entre la raíz
propiamente dicha y el eje hipocótilo) hasta el meristemo apical.
♦ Diámetro del tallo: Con la ayuda de un calibrador, se tomó el diámetro inicial y final
del tallo en la zona marcada.
♦ Cobertura. Por medio de un cuadrante imaginario observado en la vista superior de los
semilleros se realizó un cálculo aproximado de la cobertura de cada uno de los semilleros.
♦ Índice de tolerancia (ecuación 6)
Cc
IT = Cn (6)
Donde,
Cc : Crecimiento de las plantas en suelo con crudo.
Cn : Crecimiento de las plantas en suelo sin crudo
IT : Índice de tolerancia.
♦ Biomasa de la raíz: La raíz cortada se colocó en un horno a 90ºC durante 48 horas,
luego, se procedió a pesarla en una balanza analítica para calcular el peso seco de la raíz.
♦ Biomasa de la planta: El vástago y las hojas se colocaron en un horno a 90ºC durante
48 horas, luego, se pesaron en una balanza analítica y se sumaron al peso seco de la raíz.
♦ Análisis nutricional de las especies vegetales. Se realizó el análisis foliar para Potasio,
Calcio, y Magnesio en porcentaje (%), para Hierro, Boro, Cobre, Zinc, Manganeso,
Aluminio y Níquel en partes por millón (ppm), siguiendo las técnicas del Centro Nacional
de Investigaciones del Café (Cenicafé, 1994) (Anexo C).
♦ Análisis de metales pesados (Ni) en los tejidos foliares. Debido a la presencia de
Níquel en el crudo Cusiana, se realizó el análisis foliar de dicho elemento siguiendo las
técnicas del Centro Nacional de Investigaciones del Café (Cenicafé, 1994) (Anexo C).
La biomasa de la planta, la biomasa de la raíz, el análisis nutricional de las especies
vegetales y el contenido de metales pesados (Ni) en los tejidos foliares, se analizaron con
datos tomados al final de los tratamientos.
FASE 3 Análisis de la interrelación planta - bacteria sobre los procesos biodegradativos.
Este análisis se estudió en tres etapas:
ETAPA I. Efecto de la población bacteriana bioaumentada en el desarrollo Swinglea
glutinosa y Brachiaria spp cultivadas en suelos contaminados con crudo Cusiana. . . El
objetivo de este análisis fue examinar si las bacterias inoculadas aportaron un efecto
sinérgico o antagónico sobre las plantas cultivadas en suelos contaminados con derrames
inducidos de crudo (comparado con el tratamiento patrón sin inóculo ‘Cuadro 7’), para
determinar su efectividad en los bioprocesos de Fitobactorremediación.

Diseño experimental. El diseño experimental de campo usado para cada especie vegetal
fue completamente aleatorio por duplicado, y se comparo.
Brachiaria spp + Pool de Bacilos contra Brachiaria spp + Sin inoculo

Brachiaria spp + Pool de Cocobacilos y cocos contra Brachiaria spp + Sin inoculo
Brachiaria spp + Consorcios I, II, III y IV contra Brachiaria spp + Sin inoculo
S. glutinosa + Pool de Bacilos contra S. glutinosa + Sin inoculo
S. glutinosa + Pool de Cocobacilos y cocos contra S. glutinosa + Sin inoculo
S. glutinosa + Consorcios I, II, III y IV contra S. glutinosa + Sin inoculo
Para un total de 8 tratamientos para Swinglea glutinosa y 8 tratamientos para Brachiaria spp
Con el fin de determinar el efecto de las bacterias bioaumentadas en el crecimiento de
Swinglea glutinosa y Brachiaria spp cultivadas en suelos contaminados con derrames
inducidos de crudo, se analizaron las variables de la etapa I.
En el Cuadro 7 se observa cada una de las combinaciones realizadas para el análisis de los
efectos de las bacterias en el desarrollo vegetal.
Cuadro 7. Tratamientos aplicados para medir el efecto de la población bacteriana en el
desarrollo de las plantas cultivadas en suelos contaminados con crudo Cusiana
Plantas Swinglea glutinosa (c1) Brachiaria spp (c2)
Inóculo d0 d1 d0 d2 d0 d3 d0 d1 d0 d2 d0 d3
Combinación c1 d0 c1d1 c1d0 c1d2 c1d0 c1d3 c2d0 c2d1 c2d0 c2d2 c2d0 c2d3
Semilleros 12, 13, 13, 13, 5,
(Figura 14)
4, 21 4, 21 8, 20 4, 21 3, 17 9, 23 1, 19
25 22 22 22 18
d0: Sin inóculo; d1: Pool de Bacilos; d2: Consorcio I, II, III Y IV, d3: Pool de Cocobacilos,
Cocos y Pseudomonas putida
c1 d0 y c2d0 Tratamiento patrón.
ETAPA II Efecto de las plantas en el crecimiento poblacional de las bacterias
inoculadas en los diferentes semilleros con suelos contaminados con crudo Cusiana. El
objetivo de este análisis fue examinar, sí las plantas cultivadas en suelos contaminados con
derrames inducidos de crudo aportaban un efecto sinérgico o antagónico sobre las bacterias
inoculadas (comparado con el tratamiento patrón sin plantas ‘Cuadro 7), para determinar su
efectividad en los bioprocesos de Fitobactorremediación.
Hasta el final del tratamiento, se tomaron muestras de suelo de la endorrizosfera en cada
uno de los semilleros a 20 cm de profundidad cada tres días, antes de realizar la inoculción
microbiana, en tres puntos distribuidos aleatoriamente sobre la superficie del terreno; se
estimó la población bacteriana mediante recuentos en cámara de Neubauer y se midió el pH
cada cinco días. El pH se determino por el método del potenciometro de vidrio en relación
suelo - agua por volumen de 1:1 en una solución de CaCl2 0.01 M.
Diseño experimental. El diseño experimental de campo usado para los microorganismos
fue completamente aleatorio por duplicado, y se comparo.
contra Sin plantas

Pool de Bacilos contra Swinglea glutinosa
contra Brachiaria spp
contra Sin plantas
Consorcios contra Swinglea glutinosa
I, II, III, IV contra Brachiaria spp
contra Sin plantas

Pool de Cocos - contra Swinglea glutinosa
Cocobacilos contra Brachiaria spp
Para un total de 18 tratamientos.
En el Cuadro 8 se observa cada una de las combinaciones realizadas para los análisis
estadísticos de los efectos de las plantas en el crecimiento de las poblaciones bacterianas
inoculadas en cada una de los semilleros.
Cuadro 8. Tratamientos aplicados para medir los efectos de las plantas en la
multiplicación poblacional de las bacterias inoculadas en cada uno de los semilleros con un
suelo contaminado con crudo Cusiana.
Inóculo Pool de Bacilos (d1) Consorcios I, II, III y IV (d2) Cocos-Cocobacilos (d3)
Plantas C0 C1 C2 C0 C1 C2 C0 C1 C2
Combinación c0d1 c1d1 c2d1 c0d2 c1d2 c2d2 c0d3 c1d3 c2d3
Semilleros
14, 28 12, 25 9, 23 2, 26 8, 20 1, 19 7, 27 3, 17 5, 18
(Figura 14)
*C0 Sin plantas, C1 Swinglea glutinosa, C2 Brachiaria spp
c0 d1, c0d2 y c0d3 Tratamiento patrón.
ETAPA III. Efecto de las plantas en el crecimiento poblacional de las bacterias nativas
presentes en los diferentes semilleros con suelos contaminados con crudo Cusiana. El
objetivo de este análisis fue examinar, sí las plantas cultivadas en suelos contaminados con
derrames inducidos de crudo aportaban un efecto sinérgico o antagónico sobre las bacterias
‘autoctonas’ (comparado con el tratamiento patrón sin plantas y sin inoculo), para así
determinar si el crecimiento de las bacterias inoculadas era influenciado por las plantas
cultivadas o por el crudo Cusiana. (comparado con la etapa II) y de esta manera observar su
efectividad en los bioprocesos de Fitobactorremediación.
Las muestras de suelo para su análisis siguieron el procedimiento anterior (etapa II).
Diseño experimental. El diseño experimental de campo usado para los microorganismos
fue completamente aleatorio por duplicado, y se usaron tres tratamientos para un total de 6,
estos fueron:
♦ Swinglea glutinosa cultivadas en un suelo contaminado con crudo Cusiana al 30 % p/p
sin inóculo.
♦ Brachiaria spp cultivadas en un suelo contaminado con crudo Cusiana al 30 % p/p sin
inóculo.
♦ Patrón: Suelo contaminado con crudo Cusiana al 30 % p/p sin inóculo y sin plantas.
En la Figura 16 se observa un diagrama de flujo general, donde se resume el diseño
experimental para los tratamientos de laboratorio y de campo para cada uno de los
bioprocesos.
Suelo Aislamiento de Aislamiento bacterias Cultivo y
Suelo con crudo

S elección de
bacterias de la rizosfera de plantas
Adaptación en ANM plantas en medio
Adaptación
con crudo sales A con crudo
Selección Selección
Identificación Identificación
Consorcio I, II, III

Pool de C ocos,
Pool Bacilos C ocobacilos y
IV
Pse udom on as spp Mantenimiento medio B
Variable s Variable s
Crudo 0% Crudo Crudo 0% Crudo

10% 10%
Porce ntaje s y curvas de
Biode gradación
Replica 1 Replica 2 Replica 3
Medio C Medio D
Sin Con Con Sin

Tween Tween Tween Tween
Estimación de la población bacteriana
Cre cimie nto e n biorre actor, aplicación a los se mille ros
Bloqu e s 10, 11, 15 y Bloques 14, 28, 2, 26, 7, 27 Se m ille ros 6, 24. Bloque s 4, 13, 21 y
16 Patrón 2 22
Biorre m e diación Intemperismo Fitorre m e diación
Patrón 1 (sin cru do)
Bloques 12, 25, 8, 20, 3, 17.
Fitobactorre m e diació
Figura 16. Esquema general del trabajo de Fitobactoremediación.
2.7 ANALISIS ESTADISTICO.
Se empleo el programa STATISTICA versión 4, para determinar:
♦ Si la presencia de biosurfactante, hidrocarburo y tipo de medio de sales utilizado
generan diferencias estadísticas significativas en la degradación del crudo Cusiana.
♦ Si la presencia del hidrocarburo en un medio de sales utilizado genera diferencias
estadísticas significativas en el crecimiento de la población bacteriana adaptada.
♦ Si la presencia del hidrocarburo genera diferencias estadísticas significativas en el
crecimiento de la población bacteriana en un medio nutritivo.
♦ Si las relaciones de Biorremediación, Fitorremediación, Fitobactoremediación y los
efectos de intemperización generan diferencias estadísticas significativas en el crecimiento
de la población bacteriana inoculada y no inoculada, en el crecimiento de las diferentes
especies vegetales tratadas y en la degradación del crudo Cusiana contenido en cada una de
las eras de tratamiento.
2.8 ANALISIS ECONOMICO.

Para determinar las ventajas económicas y los costos de la Fitobactorremediación se hizo
necesario realizar una comparación con otras tecnologías de remediación de suelos. El
estudio económico comprendió costos fijos y variables de operación del bioproceso.

3. RESULTADOS Y DISCUSION.
3.1 SUELO.
3.1.1. Características físico - químicas. En el Cuadro 9 se observan los resultados de
los análisis físico-químicos realizados al suelo con crudo y sin crudo.
Cuadro 9. Caracterización físico- química del suelo con crudo y sin crudo.
Valor encontrado Valor encontrado

Parámetros Unidad
Suelo sin crudo Suelo con crudo
Textura Francoarenoso Francoarenoso
pH Unid. pH 6.70 7.80
Materia orgánica % MO 4.00 14.0
Fósforo Meq P/100 gr. S 10.4 34.0
Calcio Meq Ca/100 gr. S 5.10 14.6
Magnesio Meq Mg/100 gr. S 1.20 0.80
Potasio Meq K/100 gr. S 0.38 0.39
Sodio Meq Na/100 gr. S 1.20 2.40
Aluminio Meq Al/100 gr. S 0.00 0.00
Cobre ppm 1.7 0.50
Zinc ppm 5.6 0.80
Hierro ppm 1.13 1.80
Manganeso ppm 14 21.0
Boro ppm 0.83 0.65
Cómo se puede observar se dio una alteración física en cuanto a su estructura, al agregar
hidrocarburo; si se comparan los resultados estos presentaron una constitución compacta y
aterronada de forma irregular en su superficie, lo cual promovió una degradación física del
mismo (Figura 17).
Figura 17 Estructura aterronada y compacta del suelo con el hidrocarburo
La textura del suelo (Franco Arenosa) se conservó al agregar el contaminante y mantuvo las
características que se presentan en la tabla 4.
Tabla 4 Características de un suelo Franco Arenoso.
Condiciones Retención Fertilidad

Infiltración Erodabilidad Permeabilidad
de labranza de humedad potencial
Buena Buena Pobre Baja Pobre Buena
En cuanto a las condiciones químicas del suelo, se presentó:

1. Materia orgánica. La composición normal de materia orgánica en el suelo se observa
en la Tabla 5. El aumento desmedido de la fracción carbonada del suelo, atribuible a la
incorporación del petróleo, alteró la relación Carbono - Nitrógeno C/N.
Tabla 5 Estimativa conceptual de la materia orgánica en los suelos.
Clima Bajo Normal Alto

Medio < 2.5 2.5 - 4 >4
Cálido <1.5 1.5 - 3 >3
2. Reacción del suelo (pH). Es un suelo casi neutro o neutro, con buena disponibilidad de
Ca. Está entre los rangos adecuados para el crecimiento de la mayoría de las plantas y
microorganismos.
3. Nutrientes. En el suelo sin contaminar se presentó:
♦ Niveles adecuados de Calcio, Potasio y Fósforo, que evitaron una fertilización química
de los suelos para este tipo de Iones.
♦ Un pH de 6.7, encontrándose dentro de los niveles recomendados por los Agrónomos.
♦ Niveles adecuados del catión divalentes (Ca ++), que permiten el buen desarrollo de las
leguminosas que absorben preferiblemente este tipo de cationes.
♦ Niveles adecuados del catión (K+) y niveles altos del catión (Na+), que permiten el buen
desarrollo de las Gramíneas que absorben preferiblemente este tipo de cationes
monovalentes.
♦ Niveles bajos de Hierro y medios de Magnesio.
♦ Niveles altos de Sodio y Zinc y medios de Boro.
♦ Niveles adecuados (K; Ca y Mn); de los elementos encargados de la activación de
enzimas.
En el suelo contaminado con hidrocarburos se presentó:
♦ Niveles altos de Fósforo, Calcio y Sodio.
♦ Niveles medios de Potasio, Cobre, Boro y Manganeso.
♦ Niveles bajos de Magnesio, Zinc y Hierro.
Se realizó una fertilización foliar nitrogenada (Vitajardín) al momento de la siembra como
una aplicación de emergencia. El efecto benéfico de la aplicación foliar se debe,
esencialmente, al Nitrógeno que lleva el fertilizante y no al Fósforo o al Potasio.
Se decidió no realizar una fertilización completa debido a: a) Las implicaciones económicas
que conlleva. b) Utilización de niveles altos por las características físicas del suelo como
fertilidad potencial pobre y buena infiltración c) Las plantas escogidas eran plantas que se
adaptaban a diferentes tipos de suelos y se comportan bien en suelos contaminados de baja
fertilidad.
En cuanto a la caracterización microbiológica, en el suelo contaminado con crudo de
Cusiana se observó una disminución cualitativa y cuantitativa del crecimiento de los
microorganismos. ( Tabla 6).
Tabla 6 Recuento inicial de microorganismos totales en cada tratamiento al inicio de cada
ensayo.
Tratamiento UFC/ mL
Suelo con crudo 65 x 104
Suelo sin crudo 44 x 105
3.2 CRUDO.
1. Ensayo de evaporación: Se analizaron las tres muestras que fueron mantenidas en
condiciones ambientales de campo durante una semana y se observó una evaporación del
20% lo que determinó que se trataba de un crudo volátil.
2. Ensayo de penetrabilidad. Al analizar las muestras de suelo mantenidas en agua
durante 24 horas, se halló la presencia de aceite sobrenadante en las muestras a 10, 20, 30,
40, 50, 60 y 70 cm de profundidad. La velocidad y el grado de penetración dependieron del
tipo de aceite y del tipo de suelo; el crudo de Cusiana como es de baja viscosidad penetró
rápidamente en el suelo poroso seco ‘Franco arenoso’.

3. Caracterización físico – química: Las características físico-químicas del rendimiento
del crudo se observan en la Tabla 7.
Tabla 7. Rendimiento del crudo de Cusiana *
Rendimiento Temperatura % Volumen

Gases Hasta 90 ºF 6.80
Naftaleno 90 - 340 ºF 37.0
Querol jet - A 340 - 500 º F 23.6
A.C.P.M. 500 - 700 ºF 21.5
Destilado liviano 700 - 800 ºF 4.40
Destilado medio 800 - 900 ºF 4.10
Destilado pesado 900 - 1000 ºF 1.60
Fondos > 1000 ºF 1.00
*Fuente: Departamento de control y calidad de la Empresa Colombiana de Petróleos.
Las propiedades físicas del crudo de Cusiana se observan en la Tabla 8
Tabla 8 Propiedades físicas del crudo de Cusiana suministrado como sustrato
contaminante *
Propiedad física Resultado obtenido
Densidad absoluta 25ºC, g/mL 0.84258

Gravedad API 60ºF, º API 33.90
Viscosidad, 80ºF cSt 1.570
Viscosidad, 100ºF cSt 1.290
Flash Point, ºC 12.14
Presión de vapor, Kpa 54.40
Punto de fluidez, ºF <5
Punto de inflamación, ºF 35
Los componentes del crudo de Cusiana se observan en la Tabla 9

Tabla 9. Composición del crudo de Cusiana *
Parámetros Unidad Valor

Agua % Vol. 0.260
Azufre % Masa 0.320
Carbón Coradson % Masa 0.054
Calcio ppm 0.100
Cobre ppm 0.000
Hierro ppm 6.400
Magnesio ppm 0.100
Níquel ppm 0.100
Sodio ppm 0.500
Vanadio ppm 0.100
Nitrógeno % Masa 0.010
Sal LBS/KBL 4.000
4. Caracterización microbiológica. En figura 18 se observan las bacterias presentes en el
hidrocarburo de Cusiana.
A B
Figura 18 Tipos bacterianos encontrados en el crudo de Cusiana. (A) observación
macroscópica de Pseudomonas spp, (B) Observación macroscópica de Corynebacterium
spp
Las bacterias encontradas en el crudo de Cusiana fueron, Bacillus spp, Corynebacterium
spp y Pseudomonas spp.
3.3 PLANTAS.
3.3.1 Selección de las plantas resistentes a la contaminación con el crudo de Cusiana
3.3.1.1 Pruebas de germinación. Para esta prueba se realizaron los siguientes ensayos:
♦ Pruebas de germinación a nivel de laboratorio en medio nutritivo hidropónico de
Jensen y medio de Jensen modificado con crudo. Los resultados obtenidos de la
ecuación 2 para las pruebas de germinación en medio de Jensen realizadas durante una
semana se observan en el Cuadro 10 y en la Figura 19.
Al aplicar la ecuación 2 para obtener los porcentajes de germinación, se observó que las
semillas de Helianthus annuus ‘Girasol’ (muestra número 15 de la Figura 19) fueron las únicas
que tuvieron un porcentaje de germinación cercano al 70 % en un medio de Jensen
modificado con crudo al 15 %, las semillas restantes tuvieron porcentajes de germinación
bajos entre el 0 y 20%, observándose niveles altos de fitotoxicidad ocasionada por el crudo
de Cusiana al 15%.
En el Cuadro 10 y la Figura 19 se observa que los porcentajes de germinación disminuían
cuando los niveles del crudo se incrementaban. (porcentajes de germinación de 18 al 92%
con crudo al 3%, 12 al 32% con crudo al 7% y 0 al 20% con crudo al 15%).
Cuadro 10 Resultados de las pruebas de germinación (porcentaje de germinación) con tres

réplicas a nivel de laboratorio en los medios de Jensen sin modificar y modificados con
crudo al 3%, 7% y 15%.
Pruebas de germinación al nivel de laboratorio en medio de Jensen

Porcentaje de germinación
Semillas
Especie Patrón Crudo 3% Crudo 7% Crudo 15%
iniciales Réplicas
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Hyparrhenia rufa 50 76 70 66 30 26 24 18 22 16 8 12 16
Dichanthium aristatum 50 76 72 62 24 18 26 12 16 18 4 8 6
Brachiaria decumbens. 50 70 76 74 42 50 38 18 20 24 8 16 10
Brachiaria brizantha 50 74 84 82 30 26 36 20 18 16 2 4 4
Andropogon gayanus 50 74 72 70 32 22 42 16 14 22 4 0 10
Cajanus cajan 50 84 50 78 54 40 50 16 12 20 2 2 0
Desmodium spp 50 82 80 76 54 50 42 20 12 24 8 6 16
Pueraria phaseoloides 50 78 90 84 46 62 56 18 18 24 4 10 12
Medicago sativa 50 84 78 82 74 68 74 20 24 16 12 8 16
Canavalia ensiformis 50 92 80 86 80 70 82 32 30 26 8 12 10
Leucaena leucocephala 50 86 78 80 74 62 72 32 28 22 16 14 8
Crotalaria juncea 50 94 90 96 84 92 78 24 18 16 14 6 20
Vigna ungiculata 50 80 76 84 62 76 70 20 24 14 2 0 6
Swinglea glutinosa 50 70 78 74 56 70 58 24 22 24 8 16 10
Helianthus annuus L 50 92 90 84 80 70 82 66 70 80 70 58 78
100
90 Patrón
80
70
60 Crudo 3%
50
40
30 Crudo 7%
20
10
%degrminacó
0 Crudo 15%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Número de muestra
1 Hyparrhenia rufa
2 Dichanthium aristatum 9 Medicago sativa
3 Brachiaria decumbens. 10 Canavalia ensiformis
4 Brachiaria brizantha 11 Leucaena leucocephala
5 Andropogon gayanus 12 Crotalaria juncea
6 Cajanus cajan 13 Vigna ungiculata
7 Desmodium spp 14 Swinglea glutinosa
8 Pueraria phaseoloides 15 Helianthus annuus L
Figura 19. Resultados del porcentaje de germinación en un medio de Jensen como patrón
y un medio de Jensen modificado con crudo al 3%, 7% y 15%.
1 2 3 4
5 7 8
6
9 10 11 12
1. Canavalia ensiformis 5. Leucaena leucocephala 9. Vigna ungiculata

2. Vigna ungiculata 6. Medicago sativa 10. Helianthus annuus.
3. Crotalaria juncea 7. Brachiaria brizantha 11. Medicago sativa
4. Pueraria phaseoloides 8. Pueraria phaseoloides 12. Canavalia ensiformis
Figura 20 Pruebas de germinación en el medio nutritivo hidropónico de Jensen

En la Figura 20 se observan las pruebas de germinación realizadas en un medio nutritivo
hidropónico de Jensen modificado con crudo de Cusiana.
♦ Pruebas de germinación a nivel de campo en arena como sustrato no modificado y
modificado con crudo al 10% y 30%. Los resultados obtenidos aplicando la ecuación 2
para las pruebas de germinación en arena como sustrato modificado y no modificado,
realizados durante una semana se observan en el Cuadro 11 y en la Figura 21.
Cuadro 11 Resultados de las pruebas de germinación con tres réplicas a nivel de campo
con arena como sustrato sin modificar y modificado con crudo al 10% y al 30%.
Pruebas de germinación a nivel de campo en arena como sustrato

Porcentaje de germinación
Semillas Patrón Crudo 10% Crudo 30%
Especie
iniciales Réplicas
1 2 3 1 2 3 1 2 3
Hyparrhenia rufa 100 78 75 71 15 18 11 2 1 2
Dichanthium aristatum 100 75 70 78 27 31 33 6 5 9
Brachiaria decumbens. 100 70 72 76 33 26 25 3 6 7
Brachiaria brizantha 100 72 65 75 26 31 25 2 7 5
Andropogon gayanus 100 71 73 77 28 28 27 4 3 7
Cajanus cajan 100 78 72 74 25 24 18 6 4 8
Desmodium spp 100 75 71 76 15 10 17 3 6 4
Pueraria phaseoloides 100 81 76 77 18 21 14 3 2 5
Medicago sativa 100 85 72 78 18 19 25 3 1 2
Canavalia ensiformis 100 90 84 89 27 30 22 9 8 5
Leucaena leucocephala 100 86 75 77 21 25 26 5 6 9
Crotalaria juncea 100 92 89 84 27 24 23 4 3 5
Vigna ungiculata 100 82 84 86 21 17 25 4 7 8
Swinglea glutinosa 100 77 78 75 16 10 22 6 5 2
Helianthus annuus L 100 94 90 89 87 74 81 71 76 66
100
90
80 Patrón
70
60
50
40 Crudo 10%
30
20
10
%degrminacó
0 Crudo 30%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Número de muestra
1 Hyparrhenia rufa.
2 Dichanthium aristatum 9 Medicago sativa
3 Brachiaria decumbens. 10 Canavalia ensiformis
4 Brachiaria brizantha 11 Leucaena
leucocephala
5 Andropogon gayanus 12 Crotalaria juncea
6 Cajanus cajan 13 Vigna ungiculata
7 Desmodium spp 14 Swinglea glutinosa
8 Pueraria phaseoloides 15 Helianthus annuus L
Figura 21 Representación de los porcentajes de germinación de las especies vegetales en
arena como sustrato no modificado y modificado por la adición de crudo Cusiana en
concentraciones del 10% y 30%.
Al aplicar la ecuación 2 para obtener los porcentajes de germinación, se observó que las
semillas de Helianthus annuus ‘Girasol’ (muestra número 15 de la Figura 21) fueron las únicas
que tuvieron un porcentaje de germinación superior al 70% en la arena como sustrato
modificado con crudo al 30 %, las semillas restantes tuvieron porcentajes de germinación
bajos entre el 1% y 9%, observándose niveles altos de fitotoxicidad ocasionada por el crudo
de Cusiana al 30%.
En el Cuadro 11 y la Figura 21 se observa que los porcentajes de germinación disminuían
cuando los niveles del crudo se incrementaban. (porcentajes de germinación de 10% al 33%
con crudo al 10% y 1% al 9% con crudo al 30%), indicando, un efecto tóxico del
hidrocarburo en la germinación de las semillas.
Como se puede observar en las Figuras de la 19 a la 26 las semillas de Helianthus annuus
fueron las únicas que germinaron en el sustrato contaminado con hidrocarburos,
presentando así resistencia a la contaminación, por tal motivo fue la única especie
seleccionada para realizar una prueba posterior de crecimiento. Las demás semillas
presentaron poca resistencia con niveles bajos de germinación, que aumentaba
gradualmente a medida que se incrementaba la concentración del hidrocarburo en el
sustrato.
En la Figura 22 se observan las semillas de Canavalia ensiformis cultivadas en arena como
sustrato contaminado con crudo Cusiana al 30%. atacadas por hongos.

Figura 22 Proceso de germinación de Canavalia ensiformis a nivel de campo con arena
como sustrato modificado con crudo al 30 %.
En las Figuras 23, 24 y 25 se observan porcentajes de germinación muy bajos, para las
Leguminosas, para las Gramíneas y para Swinglea glutinosa cultivadas en arena como
sustrato modificado con crudo Cusiana al 30%.
1 4
8
2 5
6 7 9
3
1 Cajanus cajan
2 Desmodium spp 6 Leucaena leucocephala
3 Pueraria phaseoloides 7 Vigna ungiculata
4 Medicago sativa 8 Mimosa pudica
5 Crotalaria juncea 9 Canavalia ensiformis
Figura 23 Procesos de germinación de Fabáceas y Mimosáceas a nivel de campo con arena
3
2
Figura 24 Procesos de germinación de 1) Brachiaria decumbens, 2) Brachiaria brizantha
y 3) Andropogon gayanus a nivel de campo con arena como sustrato modificado con
crudo al 30 %.
Figura 25 Proceso de germinación de Swinglea glutinosa a nivel de campo con arena
En la Figura 26 se observan óptimos porcentajes de germinación para Helianthus annuus
cultivadas en arena como sustrato modificado con crudo Cusiana al 30%.
Figura 26 Proceso de germinación de Helianthus annuus a nivel de campo con arena

3.3.1.2 Pruebas de crecimiento
♦ Pruebas de crecimiento de Helianthus annuus y semillas vegetativas 'Estacas' de
Gliricidia sepium en suelo y suelo contaminado con crudo al 10% y 30%. En el Cuadro 12
y las Figuras 27 y 28 se observan los resultados obtenidos mediante la ecuación 2 para los
porcentajes de mortalidad de Helianthus annuus y Gliricidia sepium con tres réplicas
cultivadas en suelo y suelo contaminado con crudo al 10% y 30% después de tres meses de
experimentación.
Cuadro 12 Resultados de los porcentajes de mortalidad de Helianthus annuus y de las
semillas vegetativas (Estacas) Gliricidia sepium, con tres réplicas cultivadas en suelo y
suelo contaminado con crudo al 10% y 30%.
% Mortalidad
Seguimiento de la Estacas
Número de germinación
Especie Plantas Crudo Crudo
iniciales Patrón 10%
Crudo 30% Patrón 10%
Crudo 30%
Réplicas
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Gliricidia sepium 50 Estacas 20 16 22 92 94 98 96 100 100
Helianthus 2 6 2 92 94 96 98 96 100
50 Plántulas
annuus
120
Patrón 'Gliricidia sepium'
100
% Mortalidad
Gliricidia sepium +Crudo 10%

80
Gliricidia sepium +Crudo 30%
60
Patrón 'Helianthus annuus
40
Helianthus annuus +Crudo 10%
20
Helianthus annuus +Crudo 30%
0
75 Días 8 Días
Figura 27 Porcentaje de mortalidad de las especies vegetales Gliricidia sepium y
Helianthus annuus utilizando como sustrato suelo sin contaminar y modificado con crudo
Cusiana al 10 % y al 30 %
Figura 28 Prueba de crecimiento para Gliricidia sepium en un sustrato con crudo al 30%
Como se observa en el Cuadro 12 y las Figuras 27 y 28, las semillas vegetativas 'Estacas'
Gliricidia sepium fueron examinadas por un período de tres meses, tiempo en el cual no se
obtuvo rebrotes y hubo podredumbre de la estaca. Estas fueron descartadas ya que
presentaron al igual que Helianthus annuus una mortalidad del 100% en un sustrato
contaminado.
♦ Pruebas de crecimiento para semillas vegetativas de 11 especies cultivadas (cepas y
plántulas) en suelos contaminados con crudo al 10% y 30% y suelos sin contaminar. En
el Cuadro 13 y en la Figura 29, se observan cifras resultantes del manejo de la ecuación 2,

en referencia a los porcentajes de mortalidad de las semillas vegetativas 'Cepas' cultivadas
en un suelo como sustrato no modificado y un suelo contaminado con crudo al 10% y 30%,
obtenidos en tratamientos triplicados al final de tres meses.
Cuadro 13 Resultados de los porcentajes de mortalidad de semillas vegetativas (Cepas) y

plántulas con tres réplicas en suelo y suelo contaminado con crudo al 10% y 30%.
% Mortalidad de plántulas
Cobertura
y'cepas'
Plantas Patrón Crudo 10% Crudo 30% Inicial Final
Especie
Iniciales
Réplicas
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Hyparrhenia rufa 50 Cepas 20 14 18 50 36 40 70 58 70 71 70 75 3 9 6
Dichanthium aristatum 50 Cepas 14 18 20 44 38 48 78 80 94 71 68 78 10 10 8
Brachiaria decumbens. 50 Cepas 10 14 10 12 14 12 12 10 18 95 96 98 50 50 65
Brachiaria brizantha 50 Cepas 12 16 10 16 16 10 18 12 16 90 95 96 56 60 63
Brachiaria spp 50 Cepas 4 6 4 8 6 4 6 6 8 61 65 56 78 98 95
Andropogon gayanus 50 Cepas 18 16 12 48 36 46 82 80 88 59 71 62 10 14 16
Pennisetum hybridum 50 Cepas 18 16 10 34 30 50 82 78 90 61 66 65 8 11 13
Saccharum officinarum 50 Cepas 12 8 16 44 50 54 76 84 78 65 67 52 4 16 10
Desmodium spp 50 Cepas 14 10 12 46 42 50 76 70 98 68 71 82 1 6 8
Swinglea glutinosa 50 Plántulas 8 6 8 10 12 10 10 10 8 59 65 62 84 76 89
Boehmeria nivea 50 Plántulas 18 16 16 42 50 58 82 86 94 80 75 80 2 9 7
100 100
80
% Mortalidad
80
60
Cobertura
60
40
40
20
0 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0
Número de la muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Patrón Crudo 10% Crudo 30% Núm ero de m ues tra
(A) (B)
1 Hyparrhenia rufa
2 Dichanthium 7 Pennisetum hybridum
3 Brachiaria 8 Saccharum spp
4 Brachiaria brizantha 9 Desmodium spp
5 Brachiaria spp 10 Swinglea glutinosa
6 Andropogon gayanus 11 Boehmeria nivea
Figura 29 Resultados de los porcentajes de Mortalidad y Cobertura de las especies
vegetales en estudio con tres réplicas en suelo y suelo contaminado con crudo al 10% y al
30%. (A) Porcentajes de mortalidad, (B) Cobertura de las especies vegetales
En la Figura 30 se observan las pruebas de crecimiento de las diferentes especies cultivadas
a nivel de campo en un suelo contaminado con crudo de Cusiana al 30 %
Figura 30 Crecimiento característicos de las semillas vegetativas (Cepas y plántulas) en
suelo no contaminado y contaminado con crudo al 30%
Como se observa en el Cuadro 13 y la Figuras 29, la mayoría de las cepas y de las plántulas
presentaron un porcentaje de mortalidad entre el 30 y el 58% en un suelo con crudo al 10%
y del 58 a 94% en un suelo con crudo al 30% y se presentó una cobertura del 2 al 16% en
un suelo contaminado al 30%, sin embargo, para Brachiaria decumbens, Brachiaria

brizantha, Brachiaria spp y Swinglea glutinosa se encontraron coberturas y porcentajes de
mortalidad altos, descritas a continuación.
Brachiaria decumbens y Brachiaria brizantha fueron de las pocas especies que tuvieron
aceptación debido a los resultados en los porcentajes de mortalidad inferiores al 16%.
(Figuras 31 y 32 y Cuadro 13) y un buen desarrollo de sus raíces. En las Figuras 31 D y 32
D se aprecian las raíces de color blanco responsables del crecimiento longitudinal de la raíz
y encargadas de absorber agua y elementos nutricios, sin embargo, se presentó un reducido
crecimiento de la parte aérea encargada de la fotosíntesis, disminuyendo su cobertura al
56%, motivo por el cual se descartó su uso para las aplicaciones de Fitobactorremediación
y Fitorremediación. Estas cepas se vieron afectadas por el transplante convirtiéndose la
mayoría de sus hojas en necromasa.
(A) (B)
(C) (D)
Figura 31 Seguimiento del cultivo de Brachiaria brizantha cultivadas en un suelo con
crudo al 30%. (A) Parcelas donde fueron extraídas las cepas cultivadas, (B) Transplante
de las cepas un mes después de su cultivo, (C) Transplante de las cepas un seis meses
después de su cultivo y (E) Aspecto de las raíces 30 días después de su cultivo.
(A) (B)
(C) (D)
Figura 32 Seguimiento del cultivo de Brachiaria decumbens cultivadas en un suelo con
crudo al 30%. (A) Parcelas donde fueron extraídas las cepas cultivadas, (B) Transplante
de las cepas una semana después de su cultivo, (C) Transplante de las cepas un mes
después de su cultivo y (D) Aspecto de las raíces 30 días después de su cultivo.
Otra especie vegetal aceptada fue Brachiaria spp ‘Braquipara’, debido a los resultados en
los porcentajes de mortalidad inferiores al 8%. (Figura 33 A y Cuadro 13) y un buen
desarrollo de sus raíces (Figura 33 B). En el transplante Brachiaria spp presentó muerte
celular en los tallos largos y viejos pero hubo proliferación de sus raíces y aumentó en el
número de tallos jóvenes ampliando al 90% su cobertura y el área encargada de la
fotosíntesis, motivo por el cual fue una de las especies seleccionadas para realizar las
pruebas de Fitobactorremediación y Fitorremediación.
En la Figura 33 se observa el desarrollo fisiológico de dicha especie cultivada en un suelo
contaminado con crudo de Cusiana.

(B)
Figura 33. Pruebas de crecimiento de las semillas vegetativas ‘Braquipara spp’ en un suelo
contaminado con crudo al 10% y 30% un mes después de su cultivo. (A) Semillero
de la cepa, 30 días después de su cultivo con crudo al 30% y (B) Aspecto de las raíces
30 días después.
Otra especie vegetal seleccionada fue Swinglea glutinosa con un porcentaje de mortalidad
del 10%, un aumento en la cobertura del 62% al 83% y efectos en el transplante y
requerimientos nutricionales bajos (Figura 34 A). Es una especie dicotiledónea con raíz
axonomorfa de pronunciada profundidad (Figura 34 B) y una curva de crecimiento más
lenta que las plantas anteriores, lo que determinó pocas variaciones visuales en su altura
respecto al trasplante inicial.

(A) (B) (C)
Figura 34 Observación del crecimiento de plántulas de Swinglea glutinosa en un suelo
contaminado con crudo al 30%, 30 días después de su cultivo. (A) Semillero con crudo
al 30%, (B) Aspecto de las raíces y (C) Vista completa de la planta.
En general los efectos ecotoxicológicos del contaminante al 30% para la mayoría de las
especies vegetales estudiadas fueron de tipo LC50 (Concentración letal para el 50% de la
muestra después de un determinado tiempo de exposición.) y los efectos ecotoxicológicos
del contaminante al 10% fueron de tipo EC 50 (Concentración que produce efecto observable
en un 50% de la muestra.).
3.4 BACTERIAS.
3.4.1 Selección de bacterias por el bioproceso de bioaumentación. Para la realización
de este trabajo experimental de Fitobactorremediación y Biodegradación in Situ' se
diseñaron dos modelos:
 Selección de los microorganismos para la bioaumentación en agar nutritivo y agar
nutritivo modificado con crudo de Cusiana. En el Cuadro 14. se observan los géneros y
las especies de bacterias seleccionadas (‘foráneas’ y ‘autóctonas’) para la bioaumentación
en agar nutritivo y agar nutritivo modificado con crudo de Cusiana
Cuadro 14 Géneros y especies de bacterias seleccionadas para la bioaumentación en agar
nutritivo y agar nutritivo modificado con crudo de Cusiana.
CEPA
TIPO MICROBIANO FAMILIA BIOREACTOR
N.
2 (1) Bacillus polymixa

3 (2) Bacillus subtilis Bacillaceae
7 (3) Corynebacterium spp CoryneBacteriaceae
UNO
11 (4) Nocardia spp Nocardiaceae
13 (5) Corynebacterium glutamicum CoryneBacteriaceae
19 (6) Bacillus circulans Bacillaceae
1 (7) Edwuarsiella spp

14 (8) Hafnia spp EnteroBacteriaceae
15 (9) Enterobacter spp
DOS
17 (10) Micrococcus spp Micrococcaceae
20 (11) Streptococcus spp Streptococcaceae
P Pseudomonas putida Pseudomonadaceae
Debido a que la microbiota Gram + ha mostrado características fisiológicas especiales para
soportar condiciones ambientales adversas, y que las Bacterias que reaccionan a la
presencia de las raíces más marcadamente son los bacilos cortos Gram- negativos, que casi
invariablemente, ocupan el mayor porcentaje de la rizosfera, se decidió separar estos
grupos por sus características morfológicas para los análisis de Biorremediación y
Fitobactorremediación.
A excepción de Edwuarsiella spp., Hafnia spp., Enterobacter spp, y Pseudomonas putida
caracterizadas como Bacterias pleomórficas Gram negativas las demás son Gram positivas,
algunas con una gran habilidad en bioprocesos de remediación mediante microorganismos.
 Selección de los microorganismos para la bioaumentación en medios con sales.
De la rizosfera de las plantas cultivadas en suelos contaminados se obtuvieron un total de
44 cepas de las cuales se seleccionaron cuatro consorcios que presentaron el mejor
desarrollo y crecimiento celular en el medio con sales B. El Cuadro 15 muestra los géneros
y especies 'autóctonas' seleccionadas.
Cuadro 15 Géneros y especies de Bacterias selecciodas para la bioaumentación en medio
con sales y medio con sales modificado con crudo de Cusiana.
CEPA N. CONSORCIOS MICROBIANOS FAMILIA BIORETOR

Micrococcaceae
Consorcio I Micrococcus spp +Bacillus spp
Bacillaceae
Bacillaceae
Consorcio II Bacillus spp + Streptococcus spp
Streptococcaceae
TRES
Micrococcaceae
Consorcio III Micrococcus spp + Enterobacter spp
Enterobacteriaceae
Corynebacteriaceae
Consorcio IV Corynebacterium spp + Micrococcus spp
Micrococcaceae
No todas las bacterias aisladas del suelo que tuvieron la capacidad de crecer en medios
modificados con crudo Cusiana fueron utilizadas como inoculantes, se seleccionaron solo
las Gram positivas porque mostraron características fisiológicas especiales para soportar
condiciones ambientales adversas.
3.4.2. Identificación de bacterias para el proceso de biodegradación 'in Situ'. Se
describen a continuación características morfológicas macroscópicas y microscópicas de
las bacterias, las pruebas bioquímicas de las 12 cepas utilizadas para los reactores 1 y 2 y
los consorcios enumerados en el cuadro 15 aislados del suelo en estudio, suelo rizosférico
contaminado con crudo y del crudo Cusiana
 Dominio: Bacteria
Filum: Gracilicutes
Orden XII: Enterobacteriales
Familia I: Enterobacteriaceae
Genéro: Edwuarsiella
Hafnia
Enterobacter
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo presentan un color pálido
crema, forma irregular, elevación plana, margen ondulado, superficie brillante traslúcida y
una consistencia blanda. En agar McConkey toman un color rojizo (Lactosa positiva).
♦ Descripción microscópica: Bacilos cortos y rectos generalmente de 1µ de diámetro,
Gram negativos, móviles por flagelos peritricos.

Cuadro 16 Características bioquímicas de Edwuarsiella spp.
PRUEBA TSI SIM LIA Citrato V P.

Glucosa Movilidad:+
Rx + - -
fermentada Indol : -
Hidrólisis Hidrólisis Malonato- Agar
PRUEBA Nitratos
Gelatina Almidón Fenilalanina. McConkey
Malonato:- Degradación
Rx + + +
FenilAlanina:- de lactosa
V P = Voges Proskauer.
(A) (B)
Figura 35 Caracterización macroscópica (A) y microscópica (B) de Edwuarsiella spp
 Genéro: Hafnia
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo presentan un color crema,
forma irregular, elevación media, margen ondulado, superficie opaca y una consistencia
blanda. En Agar McConkey toman un color rojizo.
♦ Descripción microscópica: Son bacilos cortos, rectos o curvados, generalmente
presentan un tamaño de 1 µ de diámetro por 2-3 µ en longitud, Gram negativos, no
presentan cápsula, móviles por flagelos peritricos.

Cuadro 17 Características Bioquímicas de Hafnia spp

Glucosa,lactosa
Movilidad:+
Rx y sacarosa + - +
Indol : -
fermentadas

PRUEBA Nitratos
Malonato: + Degradación
Rx - + +
V P = Voges Proskauer
(A) (B)
Figura 36 Características macroscópicas (A) y microscópicas (B) de Hafnia spp.
 Genéro: Enterobacter
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo toman un color crema, forma
circular, elevación media, margen entero, superficie brillante, traslúcida y consistencia
blanda. En agar McConkey las colonias toman un color rojizo.

♦ Descripción microscópica: Bacilos cortos, con un tamaño aproximado de 0.6-1.0 µ de
ancho por 1.2-3.0 µ de largo, Gram negativos, móviles por flagelos peritricos.
Cuadro 18 Características Bioquímicas de Enterobacter spp.

Glucosa, lactosa
Movilidad:+
Rx y sacarosa - + +
Indol : -
fermentadas
PRUEBA Nitratos
Malonato: + Degradación
Rx (+) L + +
(+) L= Licuefacción lenta.
(A) (B) (C)
Figura 37 Características macroscópicas (A y B) y microscópicas (C) de Enterobacter spp.
 Dominio: Bacteria
Filum: Firmicutes
Sub orden II: Micrococcineae

Familia II : Micrococcaceae
Genéro: Micrococcus
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo presentan un color crema,
forma puntiforme, elevación plana, margen entero, superficie brillante traslúcida y
consistencia blanda. ( Lactosa Negativas).
♦ Descripción microscópica: Células esféricas, presentan un diámetro de 0.5-2.0 µ, se
asocian en parejas, tétradas o racimos. Gram positivos, inmóviles
Cuadro 19 Características Bioquímicas de Micrococcus spp.
PRUEBA TSI SIM LIA Catalasa NaCl 5 %

Glucosa Movilidad:-
Rx + + +
PRUEBA Nitratos
Malonato: + No degradación
Rx - + +
Fenilalanina:- de lactosa
Figura 38 Características macroscópicas (Izquierda) y microscópicas (Derecha) de

Micrococcus spp.
 Dominio: Bacteria
Filum: Firmicutes
Orden II: Lactobacillales
Familia III: Streptococcaceae
Genéro: Streptococcus
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo son incoloras de forma
irregular, elevación plana, margen entero, superficie brillante, traslúcida y consistencia
blanda.
♦ Descripción microscópica: Células esféricas u ovoides, presentan un diámetro de 2 µ, se
pueden encontrar en pares o en cadenas, cocos Gram positivos no son móviles.
Cuadro 20 Características bioquímicas de Streptococcus spp.
PRUEBA TSI SIM LIA Catalasa VP

Glucosa Movilidad:-
Rx + - -
Agar
Hidrólisis Hidrólisis Malonato-
PRUEBA Nitratos
Gelatina Almidón Fenilalanina.
McConkey
No
Malonato: -
Rx + + - degradación de
FenilAlanina:-
lactosa
Streptococcus spp.
 Dominio: Bacteria
Filum: Gracilicutes
Clase I: Zymobacteria
Orden VIII: Pseudomonadales
Familia I: Pseudomonadaceae
Genéro: Pseudomonas.
Especie: putida
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo toman un color café, de forma
irregular, elevación plana, margen entero, superficie opaca y una consistencia blanda.
Poseen pigmentos difusibles en el medio.
♦Descripción microscópica: Bacilos rectos o curvados, pero no vibroides, tienen un
diámetro aproximado de 0.5-1.0 µ, Gram negativos, móviles por un único flagelo polar o
múltiples.
Cuadro 21 Características bioquímicas de Pseudomonas putida.

PRUEBA TSI SIM LIA Citrato VP
Azucares Movilidad:+
Rx + + -
No fermentados Indol : -
Agar
PRUEBA Nitratos
McConkey
Malonato: - No degradación
Rx +
+ + FenilAlanina:- de lactosa
Figura 40 Características macroscópicas de Pseudomonas putida
 Dominio: Bacteria
Filum: Firmicutes
Clase I: Bacilli
Orden I: Bacillales
Familia I: Bacillaceae
Genéro: Bacillus
Especie: polymyxa
subtilis
circulans.
• Bacillus polymyxa.
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo toman un color blanco, de
forma circular, elevación plana, margen ondulado, superficie mate opaca y una consistencia
mucoide. En agar McConkey toman un color gris.
♦ Descripción microscópica: Bacilos endosporados, Gram positivos, flagelos peritricos,
alcanzan un diámetro menor a 1 µ.
Cuadro 22 Características bioquímicas de Bacillus polymyxa.
PRUEBA TSI SIM LIA Catalasa VP

Glucosa Movilidad:+
Rx + + +
PRUEBA Nitratos
No
Malonato: -
Rx (+) L + d degradación de
FenilAlanina:-
lactosa
(+) L= Licuefacción lenta d = débil
Figura 41 Características macroscópica (Izquierda) y microscópica (Derecha) de Bacillus

polymyxa
• Bacillus subtilis
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo toman un color blanco, una
forma irregular, elevación plana, margen ondulado, superficie mate opaca y una
consistencia blanda. En agar McConkey toman un color gris.
♦ Descripción microscópica: Bacilos endosporados, Gram positivos, flagelos peritricos,
alcanzan un diámetro menor a 1µ.
Cuadro 23 Características bioquímicas de Bacillus subtilis.

Glucosa,lactosa
Movilidad:+
Rx y sacarosa + + +
Indol : -
fermentadas
PRUEBA Nitratos
No
Malonato: -
Rx + + + degradación de
FenilAlanina:+
lactosa
Bacillus subtilis
 Bacillus circulans
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo toman un color blanco
cremoso, una forma irregular, elevación plana, margen entero, superficie mate opaca y una
consistencia blanda. En agar McConkey toman un color gris.
♦Descripción microscópica: Bacilos endosporados, Gram positivos, flagelos peritricos,
alcanzan un diámetro menor a 1µ con gránulos metacromáticos.
Cuadro 24 Características bioquímicas de Bacillus circulans.

Glucosa Movilidad:+
Rx + - -
Hidrólisis Malonato- Agar
PRUEBA Almidón Nitra-tos
Gelatina Fenilalanina. McConkey
No
Malonato: -
FenilAlanina:-
lactosa
Bacillus circulans
 Dominio: Bacteria
Filum: Firmicutes
Orden V: Actinomycetales
Sub orden III: Corynebacterineae
Familia I: Corynebacteriaceae
Genéro: Corynebacterium
Especie: spp.
glutamicum
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo toman un color crema, una
forma puntiforme, elevación media, margen entero, superficie brillante y una consistencia
blanda.
♦ Descripción microscópica: Bacilos cortos, irregulares, Gram positivos, no forman
endosporas, las células se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su
disposición en letras chinas.
Cuadro 25 Características bioquímicas de Corynebacterium spp.
PRUEBA TSI SIM LIA Citrato Rojo de metilo

Glucosa Movilidad:+
Rx + + +
fermentada Indol : +
PRUEBA Nitratos
Malonato: - No degradación
Rx + - +
(A) (B)
Figura 44 Características macroscópicas (A) y microscópicas (B) de Corynebacterium

spp.
• Corynebacterium glutamicum.
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo toman un color blanco crema,
una forma irregular, una elevación media, un margen entero, una superficie brillante y una
consistencia blanda.
♦ Descripción microscópica: Bacilos Gram positivos, no forman endosporas, las células
se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su disposición en letras
chinas
Cuadro 26 Características bioquímicas de Corynebacterium glutamicum
PRUEBA TSI SIM LIA Citrato Rojo de metilo
Glucosa Movilidad:+
Rx + + +
fermentada Indol : +
Agar
PRUEBA Nitratos
McConkey
Malonato: - + No degradación
Rx + -
(A) (B)
Figura 45 Características macroscópicas (A) y microscópicas (B) de Corynebacterium
glutamicum.
Dominio: Bacteria
Filum: Firmicutes
Orden V: Actinomycetales
Sub orden III: Corynebacterineae
Familia V: Nocardiaceae
Genéro: Nocardia
♦ Descripción macroscópica: Las colonias en agar nutritivo toman un color blanco crema,
una forma irregular, elevación plana, margen ondulado, característica opaca y consistencia
blanda.
♦ Descripción microscópica: Presencia de estructuras vegetativas en forma de hifas,

con un diámetro entre 0.5 y 1.2 µ, Bacteria filamentosa, Gram positiva o Gram
variable, no endosporada.
Cuadro 27 Características bioquímicas de Nocardia.
PRUEBA TSI SIM LIA Citrato Caseína
Glucosa Movilidad:-
Rx + + -
Agar
PRUEBA Nitratos
McConkey
No
Malonato: -
FenilAlanina:-
lactosa
Nocardia spp.
 CONSORCIO I:
Micrococcus spp + Bacillus spp.
Figura 47 Características macroscópicas (Izquierda) y microscópicas (Derecha) del
consorcio I.
 CONSORCIO II:
Bacillus spp + Streptococcus spp.

Figura 48 Características macroscópicas (Izquierda) y microscópicas (Derecha) del
consorcio II
 CONSORCIO III:
Micrococcus spp + Enterobacter spp.
A B
Figura 49 Características macroscópicas (A ) y microscópicas (B) del consorcio III.
 CONSORCIO IV:
Corynebacterium + Micrococcus
A B
Figura 50 Características macroscópicas (A) y microscópicas(B) del consorcio IV.
3.4.3 Adaptación de los microorganismos aislados para los bioprocesos de
Biorremediación y Fitobactorremediación mediante bioaumentación bajo condiciones

de laboratorio. Para la realización de este trabajo experimental de Fitobactorremediación
y Biodegradación ‘in Situ’ se diseñaron dos modelos:
1) Adaptación de los microorganismos aislados para los bioprocesos de
Biorremediación y Fitobactorremediación mediante bioaumentación en un medio
nutritivo. Se realizó el recuento (UFC/mL) y el estudio de las variaciones de pH para
cada uno de los Pool bacterianos bioaumentados (Pool de Bacilos y Pool de Cocos -
Cocobacilos) en medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10% .
 Comportamiento del Pool de formas bacilares en el medio nutritivo y medio nutritivo
modificado con crudo al 10%. Las pruebas para establecer la capacidad de adaptación de
las bacterias bacilares como: Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Corynebacterium spp,
Nocardia spp, Corynebacterium glutamicum y Bacillus circulans sobre el crudo al 10%, se
efectuaron tomando como medio de cultivo al medio nutritivo A. Se realizaron dos
experimentos con tres réplicas para cada uno, con un total de 6 pruebas, en 11 días de
ensayo.
Cada 24 horas de cada cultivo se tomó 1 mL con el fin de preparar las diluciones para
determinar las UFC / mL.
En el Cuadro 28 se observan las variaciones del pH como consecuencia del crecimiento del
pool de formas bacilares en un medio nutritivo sin crudo y un medio nutritivo modificado
con crudo al 10%. El pH se dejó evolucionar libremente, su variación en medio nutritivo y
medio nutritivo modificado con crudo fue homogéneo, sin diferencias significativas. El pH
máximo fue de 6.58 hacia el día 10 para el crecimiento sobre sustrato no modificado y de
6.38 al 10 día en un sustrato modificado, el pH menor, 4.15 se alcanzó al 16 día en un
medio sin crudo y de 4.29 al día 17 en medio modificado con crudo al 10%
En el Cuadro 28 y en la Figura 51 se observan, la influencia de la contaminación sobre el
crecimiento del pool de tipo bacilares y los valores del pH consecuentes al crecimiento.
Cuadro 28. Recuento del Pool de formas bacilares (expresado como UFC / mL). en medio
nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10% y los valores de pH al cabo de 11
días.
Bacilos (sin crudo) Bacilos (Con crudo 10%)

Día UFC / mL x 10 6
UFC / mL x 10 6
Rép 1 pH Rép 2 pH Rép 3 pH Rép 1 pH Rép 2 pH Rép 3 pH
1 2,01 6,51 2,01 6,45 2,01 6,58 2,01 6,36 2,01 6,38 2,01 6,35
2 3,2 6,27 3 6,35 3,3 6,25 2,42 6,2 2,31 6,25 2,1 6,18
3 18,2 4,54 19,2 5,38 22 4,65 3,6 4,54 4 4,59 3,2 5,21
4 10 4,48 8,4 4,59 17,3 4,55 5,8 4,5 6,3 4,51 4,6 4,49
5 15,8 4,37 20,1 4,65 11,3 4,41 4,2 4,42 4,9 4,49 5 4,42
6 23,2 4,26 14,6 4,32 10,1 4,43 12,2 4,34 10,7 4,36 9,6 4,41
7 27,5 4,35 28,2 4,28 19,8 4,15 9,2 4,4 9,1 4,56 8,2 4,38
8 36 4,38 40 4,18 60 4,19 8,3 4,46 9,9 4,47 12,1 4,29
9 98 4,4 102 4,22 64 4,25 15,1 4,6 18,2 4,68 16 4,55
10 71 4,42 78 4,25 75 4,22 2,64 4,45 2,72 4,72 3,4 4,52
11 52 4,37 48 4,4 39 4,28 2,76 4,42 2,82 4,51 2,5 4,4
2,5 1,4
1,2
Log (UFC / mL)
Log (UFC / mL)
2
1
1,5 0,8
1 0,6
0,4
0,5
0,2 Medio con crudo
Medio sin crudo
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tiempo (Días) Tiempo (Días)
(A) (B)
Figura 51. Curva de recuento de bacterias bacilares (A) en medio nutritivo sin crudo y (B)
en medio nutritivo modificado con crudo al 10%
Se observaron diferencias en el tipo de crecimiento en los dos medios de cultivo; cuando la
población bacteriana creció en un medio nutritivo sin crudo el comportamiento poblacional
del Pool bacteriano de formas bacilares presentó un corto período de latencia seguido de la
fase de crecimiento logarítmico con una duración de 3 días, tiempo en el cual se alcanzó el
primer pico poblacional.
Una vez alcanzado el primer pico poblacional, se presentó una fase estacionaria hasta el
sexto día, momento en el cual nuevamente se incrementó la población bacteriana hasta el
décimo día, donde se formó un segundo y último pico población, finalizando con un
descenso del crecimiento bacteriano en el undécimo día.
En el medio nutritivo modificado con crudo se observó un corto período de latencia
(significa que las bacterias 'recordaron' la adaptación) seguido de la fase de crecimiento
logarítmico con una duración de 4 días tiempo en el cual se alcanzó el primer pico
poblacional.
Una vez alcanzado el primer pico poblacional, se observaron dos picos mas, manifestados
hacia los séptimo y noveno días, donde se inició la última fase del crecimiento bacteriano
que presentó un decrecimiento por la disminución de nutrientes y a pesar de que el

crecimiento se vé disminuido, conserva el mismo patrón del Pool bacteriano bioaumentado
en un medio sin crudo. (Figura 52).
En la Figura 52 se hace una comparación del crecimiento celular del Pool bacteriano de
formas bacilares en un medio nutritivo con crudo y en un medio nutritivo sin crudo..
2,5
Log (UFC / mL)
1,5
0,5
Medio sin crudo Medio con crudo
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tiempo (Días)
Figura 52. Comparación en el crecimiento del Pool de formas bacilares en medio nutritivo
sin crudo y medio nutritivo modificado con crudo al 10%
En la Figura 52 se observa, una curva de crecimiento diauxia para el Pool de formas
bacilares bioaumentado en un medio nutritivo, que se manifiesta cuando los
microorganismos actúan sobre el sustrato.
Medio
Medio
nutritivo
nutritivo
Sin
Con
crudo
crudo
Figura 53. Montajes para el recuento de Bacilos en medio nutritivo y medio nutritivo
 Comportamiento del pool Cocobacilos y Cocos en medio nutritivo y medio nutritivo
modificado con crudo al 10%. Las pruebas para establecer la capacidad de adaptación de
las bacterias escogidas en las pruebas preliminares Edwuarsiella spp , Hafnia spp ,
Enterobacter spp , Micrococcus spp , Streptococcus spp y Pseudomonas putida (foránea)
sobre el crudo al 10%, se efectuaron tomando como medio de cultivo al medio nutritivo A.
Se realizaron dos experimentos con tres réplicas para cada uno con total de 6 pruebas, en un
lapso de tiempo de 11 días de ensayo.
En el Cuadro 29 y en la Figura 54 se observan, la influencia de la contaminación sobre el
crecimiento del pool Cocos - Cocobacilos y los valores del pH consecuentes al crecimiento.
Cuadro 29. Recuento del pool de tipos Cocos - Cocobacilos (expresado como UFC / mL).
en medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10% y los valores de pH al
cabo de 11 días.
Cocos - Cocobacilos (sin crudo) Cocos - Cocobacilos (Con crudo 10%)

Día UFC / mL x 10 6 UFC / mL x 10 6
Rép 1 pH Rép 2 pH Rép 3 pH Rép 1 pH Rép 2 pH Rép 3 pH
1 1,02 6,49 1,02 6,45 1,02 6,47 1,02 6,43 1,02 6,48 1,02 6,41
2 2,97 6,12 2,84 6,18 2,22 6,18 1,11 6,11 1,18 6,45 1,33 6,19
3 26,8 4,55 27,2 6,25 23 4,57 4,2 4,82 4,8 5,11 6,1 4,54
4 238 4,45 232 4,78 290 4,58 17,3 4,75 17,7 4,98 8,90 4,57
5 500 4,39 460 4,56 410 4,53 27,7 4,68 26,7 4,74 34,0 4,48
6 380 4,31 420 4,38 620 4,27 29,8 4,78 32 4,71 5,80 4,72
7 610 4,52 570 4,25 1290 4,17 38 4,71 42 4,73 38,0 4,54
8 870 4,66 790 4,59 880 4,21 76 4,68 82 4,62 5,20 4,38
9 1020 4,81 680 4,58 330 4,25 277 4,48 254 4,67 126 4,25
10 700 5,54 730 4,98 800 4,56 282 4,65 277 4,52 260 4,54
11 300 5,01 340 5,04 460 4,79 254 4,55 248 4,54 370 4,21
1000 350
Log (UFC / mL)
Log (UFC / mL)

300
800
250
600 200
400 150
100
200 50
Sin crudo 0 Con crudo
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tie mpo (Días) Tiempo (Días)
(A) (B)
Figura 54. Curva de recuento del pool de tipos Cocobacilos - Cocos (A) en medio
nutritivo sin crudo y (B) en medio nutritivo modificado con crudo al 10%
La Figura 54 describe la influencia del crudo en la población bacteriana. Hubo diferencias
en el crecimiento en los dos medios de cultivo, cuando la población bacteriana creció en un
medio nutritivo sin crudo, el comportamiento poblacional del pool microbiano presentó un
corto período de adaptación durante los dos primeros días, seguido de la fase de
crecimiento logarítmico hasta el séptimo día.

Una vez alcanzado el pico poblacional se presentó un decrecimiento ligero (‘Fase
estacionaria’) hasta el noveno día momento en el cual empezó la fase final de la curva de
crecimiento. (Figura 54 A).
En el medio nutritivo modificado con crudo se observó una fase de adaptación larga por la
presencia del hidrocarburo y un crecimiento inicial lento en los seis primeros días,
momento en el cual dio inicio a la fase logarítmica bajo las condiciones presentes de
experimentación y que duró hasta el último día de la observación (Figura 54 B).
1000
Log (UFC / mL)
800
600
400
200
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Con crudo Sin crudo Tiempo (Días)
Figura 55. Curvas comparativas del recuento del pool Cocobacilos - Cocos en medio
nutritivo sin crudo y medio nutritivo modificado con crudo al 10%.
En la Figura 55 se hace una comparación del crecimiento celular del pool bacteriano en un
medio nutritivo con crudo y en un medio nutritivo sin crudo. El comportamiento de los
microorganismos en la curva de crecimiento, permitió comprobar que los microbios como
pool en presencia de hidrocarburos se desarrollaron lentamente, manifestando una etapa de
adaptación de 7 días, momento en el cual se inició su crecimiento logarítmico, que bajo
estas condiciones de experimentación fue alcanzado de los 7 al 11 días. Esta curva indica
que el crecimiento se extendió mas allá de los 11 días de la experimentación.

Medio
Medio
nutritivo
nutritivo
Sin crudo
Con crudo
crudo
crudo
Figura 56 Montajes para el recuento de Cocobacilos y Cocos en medio nutritivo y medio
nutritivo modificado con crudo al 10%.
En la Figura 56 se observan los montajes que se hicieron en el laboratorio para el recuento
de Cocobacilos y Cocos en medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10%
en ella se puede apreciar el sedimento bacteriano formado en el fondo de los biorreactores.
En el Cuadro 29 y en la Figura 57 se observan las variaciones del pH, consecuentes al
crecimiento del pool Cocos - Cocobacilos en un medio nutritivo sin crudo y un medio
nutritivo modificado con crudo al 10%. El pH se dejó evolucionar libremente, su variación
en medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo fue homogéneo, sin diferencias
significativas. El pH máximo fue de 6.49 hacia el día 10 para el crecimiento sobre sustrato
no modificado y de 6.48 al 10 día sobre sustrato modificado, el pH menor, 4.3 se alcanzó al
15 día en un medio sin crudo y de 4.71 al día 16 en medio modificado con crudo al 10%
7
6
5
pH 4
3
2
1 Medio sin crudo Medio con crudo
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tiempo (Días)
Figura 57 Comparación en las variaciones del pH como consecuencia del crecimiento del
pool de Cocos y Cocobacilos en medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al
10%
En la Figura 57 se hace una comparación de las variaciones del pH, consecuentes al
crecimiento del pool Cocos - Cocobacilos y se presentan curvas similares con una pequeña
variación, a partir del noveno día, en un medio nutritivo sin crudo, donde hay un leve
aumento de pH llegando a ser 4.8 respecto a 4.4 del medio con crudo.
Tanto el pool de formas bacilares como el pool de Cocos y Cocobacilos desarrollados en un
medio nutritivo sin control del pH presentaron curvas similares que iniciaban con un pH
ligeramente ácido y finalizaban con un pH más ácido. Esta tendencia a la acidez es el
resultado de los ácidos que se producen durante el crecimiento bacteriano.
2) Adaptación de los microorganismos aislados para los bioprocesos de
Biorremediación y Fitobactorremediación mediante bioaumentación en un medio con

sales. Los microorganismos seleccionados para las pruebas de adaptación por
bioaumentación en medio con sales fueron: Consorcio I Micrococcus spp + Bacillus spp,
Consorcio II Bacillus spp + Streptococcus spp, Consorcio III Micrococcus spp +
Enterobacter spp y Consorcio IV Corynebacterium spp + Micrococcus spp.
El desarrollo de este modelo de adaptación se basó (a) en el estudio de los porcentajes de
biodegradación por los consorcios bacterianos y (b) en el recuento de los consorcios
(expresado como UFC / mL). en medio con sales y medio de sales modificado con crudo al
10%
(a) Porcentaje de biodegradación. Las pruebas para establecer la capacidad de
biodegradabilidad de los consorcios I, II III y IV escogidos en las pruebas preliminares: se
basaron tomando como variables experimentales los nutrientes (medio con sales C y medio
con sales D) y el uso de Tween 80 (Polisorbato 80 Monooleato de polioxietileno sorbitano).
♦ Influencia del Tween 80 en la Biodegradación por los consorcios I, II, III, IV
mediante bioaumentación en un medio con sales C. En el Cuadro 30 y en la Figura 58 se
observan los porcentajes de biodegradación obtenidos a nivel de laboratorio en un medio de
sales C rico en nutrientes.
Cuadro 30 Porcentaje de Biodegradación en medio de sales C sin/con Tween 80.
Medio de sales C (% Degradación.)

Sin Tween 80 Con Tween 80
Hora
Replica Replica Replica Replica Replica 2 Replica
1 2 3 1 3
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
14 11,00 9,00 13,00 11,00 9,00 13,00
28 17,00 15,00 18,00 20,33 22,00 18,00
42 21,33 19,00 24,00 30,67 28,00 33,00
56 26,67 25,00 29,00 38,33 35,00 41,00
70 34,67 32,00 37,00 45,00 48,00 39,00
84 43,00 41,00 45,00 46,33 43,00 49,00
98 43,67 42,00 45,00 51,67 55,00 48,00
112 47,00 46,00 48,00 56,00 56,00 53,00
126 50,00 48,00 52,00 55,00 58,00 52,00
60
%Degradación
50
40
30
20
10
0 Sin Tween 80 Con Tween 80
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tie m po (Horas )
Figura 58. Curva comparativa de la biodegradación en un medio de sales C con
surfactante y un medio de sales C sin surfactante.
Como se puede apreciar en el Cuadro 30 y en la Figura 58 la desorción del contaminante
permitió obtener resultados de biodegradación del 55% en un medio con Tween 80
comparada con una degradación del 50% en un medio de sales C sin Tween 80 al cabo de
126 horas.
En las etapas de biodegradación se pudieron distinguir dos fases: una fase inicial de
degradación rápida donde ocurrió la degradación de compuestos fácilmente asimilables y
una fase de degradación lenta donde quedan los compuestos difíciles de degradar.
Con los dos experimentos se logró una disminución de la concentración del crudo, por
bioprocesos de biodegradación por medio de los consorcios I, II, III y IV.
♦ Influencia del Tween 80 en la Biodegradación por los consorcios I, II, III y IV
mediante bioaumentación en un medio con sales D. En el Cuadro 31 y en la Figura 59 se
observan los porcentajes de biodegradación obtenidos a nivel de laboratorio en un medio de
sales D.
Cuadro 31. Porcentaje de Biodegradación en medio de sales D, con/sin Tween 80.
Medio de sales D (% Degradación)

Sin Tween 80 Con Tween 80
Hora
Replica Replica Replica Replica Replica 2 Replica
1 2 3 1 3
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
14 10,00 12,00 9,00 15,00 11,00 13,00
28 19,00 17,00 18,00 21,00 19,00 23,00
42 31,00 33,00 29,00 36,00 36,00 35,00
56 39,00 38,00 36,00 48,00 45,00 48,00
70 49,00 52,00 46,00 56,00 49,00 55,00
84 54,00 57,00 51,00 65,00 59,00 63,00
98 57,00 61,00 53,00 69,00 71,00 67,00
112 61,00 65,00 58,00 66,00 73,00 68,00
126 61,00 68,00 55,00 71,00 75,00 67,00
80
60
%Degradación
40
20
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tie m po (Horas )
Sin tween 80 Con tween 80
Figura 59 Curva comparativa de biodegradación en medio de sales D con surfactante y
medio de sales D sin surfactante.
Como se observa en el Cuadro 31 y en la Figura 59 se lograron degradaciones del 70% del
hidrocarburo presente en un medio de sales D con Tween 80 y 60% en un modelo sin
Tween 80, en un tiempo de 126 horas.
Aunque con el surfactante Tween 80 se presentaron diferencias en los porcentajes de
biodegradación, estos no fueron significativos, por consiguiente luego de un análisis no se
aconseja su uso porque:
♦ Aumentan la contaminación (algunos biosurfactante son menos biodegradables que el
contaminante original).
♦ Aumentan los costos de los procesos de biodegradación.
♦ Pueden interferir con la viabilidad microbiana.
♦ No se encuentra homología en los resultados con el uso de surfactante debido a que su
efecto está correlacionado con factores propios de cada región a descontaminar.
Así mismo se realizaron experimentos para dibujar una curva de biodegradación en la
Figura 60
En la Figura 60 se observan los montajes experimentales a nivel de laboratorio realizados
para obtener una curva de biodegradación del crudo Cusiana, teniendo en cuenta el medio
de sales utilizado y la presencia o no de Tween 80 como biosurfactante.

(A) (B)
Figura 60 Montajes experimentales para determinar el porcentaje de biodegradación del
crudo Cusiana por consorcios microbianos (A) Montaje con surfactante y (B) Montaje sin
surfactante.
 Influencia del medio con sales en la Biodegradación por los consorcios bacterianos.
En todos los tratamientos se logró una disminución de la concentración del crudo por medio
de los consorcios I, II, III y IV, se obtuvo los mejores resultados en el medio de sales D,
con porcentajes de biodegradación del 70 % correspondiente al medio con surfactante y
60% al medio de sales sin surfactante. Respecto al medio de sales C se alcanzó una
biodegradación de 55% en el medio con surfactante y 45% en el medio sin surfactante.
En la Figura 61 se muestra la diferencia entre los porcentajes de biodegradación en los dos
medios, favoreciendo al medio D, preparado sin extracto de levadura; cuando existe aporte
orgánico adicional al medio las bacterias optan por hacer uso de ellos disminuyendo el
porcentaje de biodegradación.
70
60
%Degradación
50
40
30
20
10
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tie m po (Horas )
Medio C Medio D
Figura 61 Diagrama comparativo de los porcentajes de biodegradación en los medios con
sales C y D.
(b) Recuento de los consorcios I, II, III y IV (expresado como UFC / mL). en medio
con sales D y medio con sales D modificado con crudo al 10% Para estas pruebas se
descartó al medio con sales C por su mayor contenido de sales, mayor costo y menor efecto
en los bioprocesos de biodegradación.
En el Cuadro 32 y en la Figura 62 se observan el recuento de los consorcios I, II, III y IV
para el medio de sales D y medio de sales D modificado con crudo al 10%.
Cuadro 32. Resultados del recuento de los consorcios bacterianos I, II, III y IV como UFC
y variaciones del pH en el medio con crudo al 10% y sin la adición de crudo.
Día Consorcios I, II, III, IV Consorcios I, II, III, IV

M edio D (sin crudo) Medio D (Con crudo 10%)
UFC / mL x 10 6 UFC / mL x 10 6
Rép 1 pH Rép 2 pH Rép 3 Ph Rép 1 pH Rép 2 pH Rép 3 pH
10 2,89 7,24 2,89 7,21 2,89 7,22 2,89 7,1 2,89 7,01 2,89 7,13
11 2,99 7,19 2,9 7,17 3 7,17 15,2 6,99 25 7,05 32 7,11
12 3,3 7,21 3,2 7,14 3,3 7,16 510 7,02 720 7,07 650 7,14
13 5,8 7,23 5,6 7,12 6,2 7,18 320 7,03 420 7,09 520 7,16
14 5,9 7,27 5,6 7,21 5,9 7,23 470 7,04 460 7,1 500 7,17
15 6 7,28 5,7 7,25 5,7 7,29 330 7,02 350 7,12 460 7,12
16 5,5 7,3 5,3 7,28 5,2 7,32 299 6,8 233 7,03 370 7,08
17 4,6 7 4 7,18 4,8 7,21 440 6,73 430 6,98 420 7,01
18 4,1 6,89 4 6,98 4,2 7,01 570 6,81 590 6,87 770 6,95
19 5,3 6,42 5,8 6,56 5,8 6,57 520 6,74 540 6,81 610 6,83
20 5,5 6,54 5,9 6,52 5,5 6,56 570 6,08 550 6,21 510 6,15
21 4,2 6,9 4,5 6,87 4,7 6,92 160 6 275 6,11 560 6,1
22 3,7 7,29 3 7,12 3,6 7,01 320 6,59 360 6,45 420 6,38
23 2,23 7,17 2,01 7,14 2,6 7,12 680 6,68 830 6,52 820 6,55
24 2,41 7,02 2,2 7,11 2,9 7,15 820 6,57 840 6,55 810 6,58
7 1000
6
Log (UFC / mL)
800
Log (UFC / mL)
5
600
4
3 400
2 200
1 Medio D sin crudo Medio D con crudo
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 -200
(A) (B)
Figura 62. Representación del recuento de los consorcios I, II, III y IV como UFC (A) en
medio con sales D y (B) en medio con sales D modificado con crudo al 10%
En la Figura 62 se observan diferencias en el tipo de crecimiento en los dos medios de
cultivo. Cuando la población bacteriana creció en un medio con sales sin crudo el
comportamiento poblacional de los consorcios I, II, III y IV presentaron un período de

adaptación de dos días, seguido de la fase de crecimiento logarítmico en el cual se logró el
primer y máximo pico poblacional al tercer día. Una vez alcanzado el primer pico
poblacional, se manifestó una fase estacionaria corta hasta el quinto día, momento donde
empezó a disminuir la población bacteriana hasta el octavo día, tiempo donde se
incremento nuevamente los consorcios bacterianos, presentando el último pico poblacional
que se mantuvo hasta el décimo día, instante en el cual se inicio la ultima etapa del
crecimiento manifestándose lisis celular por la falta de nutrientes. (Figura 62 A )
En el medio de sales D modificado con crudo se observó un período de adaptación de un
día seguido de la fase de crecimiento logarítmico alcanzándose el primer pico poblacional
el segundo día Una vez alcanzado el primer pico poblacional, se presentó una disminución
de la población hasta el sexto día momento en el cual nuevamente se incrementó la
población presentándose dos picos poblacionales mas en el tiempo ocho y trece; este último
pico tuvo un crecimiento logarítmico de pendiente pronunciada indicando el máximo
desarrollo de uno de los microorganismos del consorcio.
La forma atípica de las dos curvas de crecimiento de los consorcios se explica porque cada
acción microbiana provoca cambios en la configuración del sustrato y se presentan
depresiones diauxicas.
En la Figura 63 se hace una comparación del crecimiento celular de los consorcios I, II, III
y IV en un medio con sales D sin modificar y un medio con sales D modificado con crudo
al 10%. En este diagrama se aprecia como el consorcio I, II, III y IV inoculado en un

medio de sales D sin crudo, no presentó un crecimiento logarítmico representativo,
manteniéndose el consorcio inicial inoculado sin crecimiento celular. La influencia del
sustrato orgánico en el crecimiento celular fue muy significativa, obteniéndose una alta
población celular y una curva de crecimiento predominante, concluyendo con esta
observación una adaptación del consorcio bacteriano al crudo Cusiana.
1000
Log (UFC / mL)
100
10
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tiempo (Días)
Medio D s in crudo Medio D con crudo
Figura 63. Comparación del recuento de los consorcios I, II, III y IV en medio de sales D
y medio de sales D modificado con crudo al 10%.
En el Cuadro 32 y en la Figura 64 se observan las variaciones del pH como consecuencia
del crecimiento del consorcio numero I, II, III y IV en el medio D y medio D modificado
con crudo al 10%. El pH máximo fue de 7.32 hacia el día 16 para el crecimiento sobre el
medio D sin modificar y de 7,17 al 14 día en el medio D modificado, el pH menor, 6.42 se
alcanzó al 19 día en un medio D sin crudo y de 6 al día 14 en un medio D modificado con
crudo al 10%.
8
7
6
5
pH
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tiempo (Días)
Medio D s in crudo Medio D con crudo
Figura 64. Gráfica comparativa de la variación del pH como consecuencia del crecimiento
del consorcio Numero I, II, III y IV en el medio D y medio D modificado con crudo al
10%.
3.4.4 Montaje de tres biorreactores para la producción de biomasa microbiana. Los
medios de cultivo usados para el crecimiento de microorganismos a gran escala fueron: (a)
Medio nutritivo B para el pool de formas bacilares (pool I), bioaumentado en el biorreactor
(1) y para el pool de tipos Cocobacilos - Cocos (pool II) bioaumentado en el biorreactor (2),
(b) Medio con sales D para el consorcio I, II, III y IV bioaumentado en el biorreactor (3)
(Figura 65).
Para el tratamiento de producción de biomasa microbiana a gran escala se escogió como
medio de suministro de oxígeno la inyección de aire por medio del compresor. El
compresor funcionó continuamente durante 16 horas, con ocho horas de descanso, en la
cual se le realizó el mantenimiento. Operó continuamente durante los 30 días destinados

para el tratamiento 'in Situ'. Las ocho horas de descanso fueron reemplazadas por bombas
neumáticas con salidas de aire de 20 cm3 / s.
Consorcios
(3)
Pool
Pool I
11
(1)
(2)
(A) (B) (C)
Figura 65. Biorreactores para la producción a gran escala de los diferentes
microorganismos utilizados en el bioproceso. (A) Biorreactor 1 para el crecimiento de pool
de formas bacilares, (B) Biorreator 2 para el crecimiento de pool de formas Cocos -
Cocobacilos y (C) Biorreator 3 para el crecimiento de los consorcios I, II, III y IV.
Los biorreactores sirvieron como sistemas que proveían de masa bacteriana al proceso
biodegradativo, por tal motivo se realizaron cinéticas de crecimiento celular de los pool 1 y
2 y de los consorcios I, II, III y IV para saber el momento logarítmico del crecimiento.
 Pool de formas bacilares bioaumentado en el biorreactor 1. Los datos
correspondientes a la medición del pH y recuento de células del biorreactor, se observan en
el Cuadro 33.
Cuadro 33. Recuento de los microorganismos del pool de formas bacilares y medición del
pH en el biorreactor 1 (adición cada tres días de 240 microorganismos x 105).
Nº de Células Nº de Células
Día Biorreactor 1 adicionadas pH
(Células/mL x 105) (Células / mL x 10-5)
1 98 7.60
2 110 7.68
3 259 7.81
4 620* 240 7,83
5 790 7.81
6 2010 7.89
7 1210 240 7.90
8 1980 7.88
9 2980 7.85
10 4500 240 7.83
11 2450 7.80
12 5500 7.80
13 8200 240 7.77
14 4500 7.70
15 3100 7.72
16 4200 240 7.69
17 83** 7.65
18 139 7.69
19 320 7.71
20 520 240 7.74
21 622 7.78
22 510 7.84
23 700 240 7.84
24 798 7.85
25 871 7.85
26 1050 240 7.80
27 970 7.79
28 1970 7.84
29 2210 240 7.87
30 3600 7.98
31 4500 7.95
32 9100 240 7.91
* El fondo azul claro corresponde al número de células bacteriana el día de su primera
inoculación.
**El día 17 en todos los tratamientos se comenzó con un nuevo inóculo y un nuevo medio
de cultivo iniciándose nuevamente el crecimiento celular de los microorganismos.
Como se puede apreciar en el Cuadro 33 y en la Figura 66 B, Las variaciones del pH fueron
mínimas, el pH máximo fue de 7.98 hacia el día 30 y un pH mínimo 7.6 hacia el día 1, el
pH tuvo un valor inicial de 7.6 con un valor final de 7.91, al final de la etapa experimental
de 32 días.
10000 8,1
8
8000
7,9
(pool Bacilos/mL)
6000
Concentración
7,8
pH
4000 7,7
2000 7,6
7,5
0
7,4
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31
-2000 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31
(A) (B)
Figura 66. (A) Concentración del pool de formas bacilares en el biorreactor 1, y (B)
Variaciones del pH iniciadas por el crecimiento celular del pool de forma bacilar
bioaumentados en el biorreactor número (1) en un medio con sales D en un tiempo
experimental de 32 días
En cuanto al desarrollo microbiano del pool de forma bacilar, se observaron en la Figura
66(A) las típicas conformaciones diauxicas propias de un sistemas microbianos variado. En

la etapa experimental de 32 días se obtuvo un máximo crecimiento celular del pool de
formas bacilares (células / mL) de 9100 x 10 5 hacia el día 32 y un mínimo crecimiento de
98 x 105 para el día 1 y 83 x 10 5 para el día 17 (Se obtuvo los mínimos crecimientos al
inicio del montaje del biorreactor).
 Pool de tipos Cocobacilos - Cocos. bioaumentado en el biorreactor 2. Los datos
el Cuadro 34.
Cuadro 34. Recuento de los microorganismos del pool de Cocobacilos - Cocos y medición
del pH en el biorreactor 2 (adición cada tres días de 240 microorganismos x 105).
Día Nº (Células/mL x 105) Nº (Células/mL x 105)

en biorreactor 2 adicionadas
pH
1 82 7,65
2 91 7,57
3 215 7,62
4 240* 240 7,56
5 598 7,68
6 245 7,87
7 610** 240 7,98
8 620 8,01
9 540 8,09
10 1560 240 8,27
11 2580 8,23
12 3700 8,25
13 5600 240 8,29
14 3200 8,31
15 3800 8,25
16 4100 240 8,29
17 72 8,31
18 87 8,26
19 147 7,61
20 241 240 7,68
21 245 7,87
22 198 7,91
23 460 240 8,04
24 310 8,09
25 1250 8,1
26 2960 240 8,15
27 4500 8,19
28 5600 8,23
29 2980 240 8,25
30 3200 8,2
31 4500 8,17
32 5600 240 8,01
* El fondo azul claro corresponde al número de células bacteriana el día de su primera inoculación.
** El fondo de color gris corresponde a los días de riego.
pH tuvo un valor inicial de 7.65 con un valor final de 8,01 al final de la etapa experimental
de 32 días.
6000 8,4
5000 8,2
8
4000
7,8
pH
3000
7,6
2000 7,4
1000 7,2
0 7
-1000 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31
T iempo (Días) Tiempo (Días)
(A) (B)
Figura 67. (A) Concentración del pool de Cocos - Cocobacilos en el biorreactor 2, y (B)
Variaciones del pH iniciadas por el crecimiento celular del pool de Cocos - Cocobacilos
experimental de 32 días.
En cuanto al desarrollo microbiano del pool de Cocos - Cocobacilos, se observaron en la
Figura 67 (A) las típicas conformaciones diauxicas propias de un sistemas microbianos
variado. En la etapa experimental de 32 días se obtuvo un máximo crecimiento celular del
pool de Cocos - Cocobacilos (células / mL) de 5600 x 105 hacia el día 32 y un mínimo
crecimiento de 82 x 105 para el día 1 y 72 x 10 5 para el día 17 (Se obtuvo los mínimos
crecimientos al inicio del montaje del biorreactor).
 Consorcios I, II, III y IV bioaumentado en el biorreactor 3. Los datos
el Cuadro 35.
Cuadro 35. Recuento de los microorganismos de los consorcios I, II, III y medición del pH
en el biorreactor 3 (adición cada tres días de 240 microorganismos x 105).
Nº (Células/mL x 105) Nº (Células/mL x 105)

Día en biorreactor 3 adicionadas
pH
1 56 7,47
2 125 7,56
3 238 7,61
4 298 240 7,57
5 615 7,65
6 840 7,18
7 980 240 7,45
8 1260 7,21
9 970 7,31
10 1230 240 7,41
11 870 7,13
12 1390 7,87
13 1870 240 7,41
14 1970 6,54
15 1580 6,91
16 1800 240 6,87
61 17 7,15
87 18 7,28
187 19 7,45
245 20 240 7,87
211 21 7,47
202 22 7,41
291 23 240 7,23
245 24 6,98
298 25 6,74
243 26 240 6,41
310 27 6,72
560 28 7,01
970 29 240 7,09
710 30 7,16
960 31 7,41
1250 32 240 7,24
pH tuvo un valor inicial de 7.47 con un valor final de 7.24 al final de la etapa experimental
de 32 días.
2500 10
(consorcio I,II,III,IV / mL)
2000 8
Concentración
1500 6
pH
1000 4
500 (A) 2
(B)
0 0
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31
-500
Figura 68. (A) Concentración de los consorcios I, II, III y IV en el biorreactor 3, y (B)
Variaciones del pH iniciadas por el crecimiento celular de los consorcios I, II, III y IV
experimental de 32 días.
En cuanto al desarrollo microbiano de los consorcios I, II, III y IV, se observaron en la
Figura 68(A) las típicas conformaciones diauxicas propias de un sistemas microbianos
variado y gran variabilidad en los recuentos microbianos con notables fases intermedias de
adaptación. En la etapa experimental de 32 días se obtuvo un máximo crecimiento celular
de los consorcios I, II, III y IV (células / mL) de 1970 x 105 hacia el día 14 y un mínimo
crecimiento de 56 x 105 para el día 1 y 61 x 10 5 para el día 17 (Se obtuvo los mínimos
crecimientos al inicio del montaje del biorreactor).
3.5 INTERRELACION PLANTA - BACTERIA - CRUDO.
Figura 69. Vista general de los semilleros.

En la Figura 69 se observa la vista general de los semilleros ubicados en el área de trabajo
obteniéndose en total 28 semilleros. A estos se les colocó un polisombra sencillo para
evitar el golpe directo de las gotas de lluvia y disminuir las perdidas por lixiviación.
3.5.1 Aplicación de los Bioprocesos de Biorremediación, de Biodegradación natural,
de Fitorremediación y de Fitobactorremediacion 'in Situ'. El diseño experimental
consistió en un análisis comparativo de los bioprocesos (Biorremediación, Fitorremediación
y de Fitobactorremediacion 'in Situ'), que determinó cuál de ellos era el más económico y
tenía los más altos porcentajes de biodegradación del crudo Cusiana en suelos
contaminados por derrames inducidos de crudo, al igual que la influencia del crudo y de la
relación Planta - bacteria en los procesos biodegradativos.
Para esto, se establecieron las siguientes 3 fases experimentales:

FASE I: Análisis de la Biorremediación, de la Fitorremediación y de la
Fitobactorremediación sobre el crudo Cusiana contenido en cada uno de los semilleros.
Se tomaron muestras de suelo a 20 cm de profundidad a cada uno de los semilleros, cada
diez días, durante un mes, con lo cual se determinaron los porcentajes de degradación
logrados por la Biorremediación (semilleros sin plantas y con inóculo de los
correspondientes microorganismos de estudio), la Fitorremediación (semilleros con plantas
y sin inóculo), el patrón (semilleros sin plantas y sin inóculo) y la Fitobactorremediación
(semilleros con plantas y con inóculo. En el Cuadro 36 y en las Figuras 70 y 71 se
presentan los porcentajes de degradación logrados por cada uno de estos bioprocesos.
Cuadro 36 Resultados de los porcentajes de degradación logrados por Biorremediación,
(solo microorganismos), Fitorremediación (solo plantas) y Fitobactorremediación (con
microorganismos y plantas), realizados durante un mes sobre un sustrato con crudo al 30%.
Porcentajes de biodegradación
Crudo en gramos / 100 g de suelo
Tratamientos
10 Días 20 Días 30 Días
Jul 11/00 Jul 21/00 Jul 31/00
c0d0 0 4,05 11,15
c0d1 20,95 51,69 70,66
c0d2 10,47 57,43 78,04
c0d3 7,09 30,41 62,84
c1d0 6,08 23,65 41,22
c1d1 14,19 37,84 57,77
c1d2 12,84 44,59 64,19
c1d3 8,78 33,78 59,46
c2d0 4,05 33,78 47,3
c2d1 19,59 34,46 57,43
c2d2 4,05 52,03 67,57
c2d3 12,16 35,81 64,19
* C0 = Sin plantas C1 = Swinglea glutinosa C2 = Brachiaria spp.
** d0 = Sin inóculo microbiano, d1 = pool de formas bacilares,
d2 = Consorcio I, II, III y IV, d3 = pool de Cocos – Cocobacilos.
Los efectos de las plantas (Fitorremediación), de las bacterias (Biorremediación) y de las
bacterias junto con las plantas (Fitobactorremediación) en los bioprocesos de
biodegradación de suelos contaminados por derrames inducidos de crudo Cusiana se
estudiaron en tres etapas.
Etapa 1. Biorremediación. Se determinaron los porcentajes de degradación logrados en
los semilleros sin plantas y con inóculo microbiano (Figuras 70 y 71).

Tratamiento sin plantas + pool de formas bacilares
80
70 70,66
biodegradación
Porcentaje de
60
50 51,69
40
30
20 20,95
10
0 0
0 10 20 30
Tiempo (Días)
(A)
Tratamiento sin plantas + pool de Cocos - Cocobacilos

70
60 62,84
biodegradación
Porcentaje de
50
40
30 30,41
20
10 7,09
0 0
0 10 20 30
Tiempo (Días)
(B)
Figura 70 Porcentajes de remoción logrados por Biorremediación mediante (A) un pool
de formas bacilares y (B) un pool de Cocos - Cocobacilos.
Tratamiento sin plantas + Consorcios I, II, III y IV

100
biodegradación
Porcentaje de
80 78,04
60 57,43
40
20
10,47
0 0
0 10 20 30
Tiempo (Días)
(A)
Tratamiento patrón
12
11,15
10
biodegradación
Porcentaje de
8
6
4 11,15%
2 4,05%
0%
0
-2 0 10 20 30
Tiempo (Días)
(B)
Figura 71 Porcentajes de remoción logrados por Biorremediación mediante (A) los
consorcios, I, II, III y IV, e (B) patrón (sin plantas y sin inóculo).
Cuadro 37. Cuadro comparativo de los porcentajes de remoción logrados por
Biorremediación a los 30 días del tratamiento.
Porcentajes de remoción logrados por la Biorremediación a los 30 días del tratamiento

Patrón Pool de formas bacilares Pool de Cocos - Cocobacilos Consorcios I, II, III, IV
Figura 71 B Figura 70 A Figura 70 B Figura 71 A
11.15% 70.66% 62.84% 78.0%
Tratamiento de biorremediación
90
P at ró n
80
Porcentaje de biodegradación
70
60 Sin p lan t as +
p o o l 'Bacilo s'
50
40
Sin p lan t as +
30 Co n so rcio s I,
20 II, III, IV
10 Sin p lan t as +
p o o l Co co s -
0
Co co bacilo s
-10 0 10 20 30
Tiempo (Días)
Figura 72. Curvas comparativas de los Porcentajes de biodegradación logrados por el
diseño experimental de Biorremediación
En la Figura 72 y en el Cuadro 37 se observan que a los 30 días, en los tratamientos de
Biorremediación utilizando un inóculo del pool de Cocobacilos y Cocos se obtuvo el

porcentaje de biodegradación más bajo (62.84%), con el pool de formas bacilares se obtuvo
porcentaje de biodegradación medio (70.66%) y utilizando los consorcios I, II, III y IV se
obtuvo un porcentaje de biodegradación más alto (78.04%) siendo este el mejor resultado.
En todos los tratamientos se observaron períodos cortos de adaptación de los
microorganismos (significa que las bacterias 'recordaron' al contaminante) en los primeros
días del ensayo, con curvas iniciales de biodegradación bajas, seguida de una fase de
biodegradación logarítmica con mayor número de microorganismos biodegradativos.
En la Figura 73 se observan los semilleros usados para las pruebas de Biodegradación a
nivel de campo.
Patrón. Suelo + crudo + consorcios I, II, Suelo + crudo + pool de Cocos y Suelo + crudo + pool de Bacilos .
Intemperismo. III, IV Cocobacilos
Figura 73. Tratamientos en campo de los diferentes semilleros que visualizan los efectos de los inóculos bacterianos en la
biodegradación
Etapa 2. Fitorremediación. Se determinaron los porcentajes de degradación logrados en
los semilleros con plantas y sin inóculo microbiano (Figuras 74).
Swinglea glutinosa sin inóculo.

50
biodegradación
40 41,22
Porcentaje de
30
23,65
20
10
6,08
0 0
0 10 20 30
Tiempo (Días)
(A)
Brachiaria spp sin inoculo

50
biodegradación
47,3
Porcentaje de
40
33,78
30
20
10
4,05
0 0
0 10 20 30
Tiempo (Días)
(B)
Figura 74 Porcentajes de remoción logrados por Fitorremediación mediante (A) Swinglea
glutinosa y (B) Brachiaria spp.

Fitorremediación a los 30 días del tratamiento.
Porcentajes de remoción logrados por Fitorremediación a los 30

días del tratamiento
Patrón Swinglea glutinosa Brachiaria spp.
Figura 71 B Figura 73 A Figura 73 B
11.15% 41.22% 47.3%
Figura 75. Curvas comparativas de los Porcentajes de biodegradación logrados por el

Tratamiento de Fitorremediación
diseño experimental de
50 Fitorremediación.
Swinglea glutinosa y pool de formas bacilares P at rón
70 40
60
biodegradación
Porcentaje de
50
En la Figura 75 y en30el Cuadro 38 se observan que a los 30 días en los tratamientos
57,77
de
40 Swinglea
37,84
30 20 glut inosa sin
Fitorremediación
20
(con porcentajes mayores de remoción, comparado con el tratamiento inóculo
14,19
10 10
patrón 11.15%),
0 0
utilizando Swinglea glutinosa se obtuvo el porcentaje de remoción más Brachiaria
0 spp sin
0 10 20 30 inoculo
bajo (41.22%), y utilizando
0 Brachiaria sppTiempo
se obtuvo
10 el porcentaje
(Días) 20 de remoción más
30alto
Figura A -10
(47.3%) siendo este el mejor resultado. Tiempo (Días)
Swinglea glutinosa y Consorcios I, II, III. IV
70
Etapa 3. Fitobactorremediación. Se determinaron los porcentajes de degradación
64,19
60
biodegradación
Porcentaje de
50
logrados en los semilleros con plantas y con inóculo microbiano44,59
(Figuras 76 y 77).
40
30
20
10 12,84
0 0
0 10 20 30
Figura B Tiempo (Días)
Swinglea glutinosa y pool de Cocos y Cocobacilos

70
60
biodegradación
Porcentaje de
50 59,46
40
30 33,78
20
10
8,78
0 0
0 10 20 30
Figura C Tiempo (Días)
Figura 76 Porcentajes de remoción logrados por Fitobactorremediación mediante
Swinglea glutinosa y (A) pool de formas bacilares. (B) Consorcios I, II, III y IV, (C) pool
de Cocos - Cocobacilos.
Brachiaria spp y pool de formas bacilares
biodegradación 70
60
Porcentaje de
50 57,43
40
30 34,46
20 19,59
10
0 0
0 10 20 30
Tiempo (Días)
(A)
Brachiaria spp y Consorcios I, II, III, IV

80
biodegradación
60
Porcentaje de
67,57
52,03
40
20
0 0 4,05
0 10 20 30
-20
Tiempo (Días)
(B)
Brachiaria spp y pool de Cocos - Cocobacilos

70
biodegradación
60
Porcentaje de
50 64,19
40
35,81
30
20
10 12,16
0 0
0 10 20 30
Tiempo (Días)
(C)
Figura 77 Porcentajes de remoción logrados por Fitobactorremediación mediante
Brachiaria spp y (A) pool de formas bacilares. (B) Consorcios I, II, III y IV, (C) pool de
Cocos - Cocobacilos.
Fitobactorremediación a los 30 días del tratamiento.
Porcentajes de remoción logrados por Fitobactorremediación a los 30 días del tratamiento

Patrón pool de formas bacilares Consorcios I, II, III y IV Pool de Cocos - Cocobacilos.
S. S. S.
Figura 71 glutinosa Brachiaria spp glutinosa Brachiaria spp glutinosa Brachiaria spp
Figura 75 Figura 76 A Figura 75 Figura 76 B Figura 75 Figura 76 C
B A B C
11.15 57.77 57.43 64.19 67.57 59.46 64.19
80
Patrón
Tratamiento de Fitobactorremediación
70
Swinglea
glutinosa +pool
60 de formas
bacilares
Swinglea
50 glutinosa +
consorcios I, II,
III, IV.
40 Swinglea
glutinosa +pool
de Cocos -
Cocobacilos
30
Brachiaria spp +
pool de formas
bacilares
20
Brachiaria spp +
consorcios I, II,
10 III, IV
Brachiaria spp +
0 pool Cocos -
0 10 Tiempo (Días) 20 30 Cocobacilos
-10
Figura 78. Curvas comparativas de los Porcentajes de biodegradación logrados mediante el
diseño experimental de Fitobactorremediación.
En la Figura 78 y en el Cuadro 39 se observan que a los 30 días en los tratamientos de
Fitorrebactomediación (con porcentajes mayores de remoción, comparado con el
tratamiento patrón 11.15%), utilizando Brachiaria spp y el pool de tipos bacilares se
obtuvo el porcentaje de remoción más bajo (57.43%), y utilizando Brachiaria spp y los
consorcios I, II, III, IV se obtuvo el porcentaje de remoción más alto (67.57%) siendo este
el mejor resultado.
Las mejores relaciones para obtener ventajas biodegradativas fueron donde se involucraron
las especies de plantas con el inóculo de los consorcios I, II, III, IV observándose
porcentajes de biodegradación entre 67.57% para Brachiaria spp y 64.19% para Swinglea
glutinosa y donde se alterno Brachiaria spp con el pool de Cocobacilos y Cocos donde se
observó un porcentaje de biodegradación del 64.19%. Ventajas que fueron obtenidas por el
uso de microorganismos con inducción enzimática de sus propiedades biodegradativas, y el
uso de microorganismos numerosos y predominantes en la rizosfera de plantas.
La Figura 79 muestra el cuadro junto con las curvas comparativas de los resultados
obtenidos en los procesos experimentales de Fitobactorremediación, Biorremediación,
Fitorremediación y el tratamiento patrón

En la Figura 79 se observan datos comparativos entre los diferentes bioprocesos.
Porcentajes de remoción logrados por Fitobactorremediación, Biorremediación y Fitorremediación a los 30 días del tratamiento
pool de formas Consorcios I, II, III y Pool de Cocos -
Fitorremediación Biorremediación
bacilares IV Cocobacilos.
Swinglea Brachiari Pool de
Patrón Brachiaria Brachiaria Brachiaria Pool de Consorcios I,
S. glutinosa S. glutinosa S. glutinosa glutinosa a spp. bacilos
Figura spp spp spp Cocobacilos II, III, IV
Figura 75 A Figura 75 B Figura 75 C Figura 73 Figura 73 Figura 70
Figura 76 A Figura 76 B Figura 76 C Figura 70 B Figura 71 A
71 B
A B A
11.15 57.77 57.43 64.19 67.57 59.46 64.19 41.22% 47.3% 70.66% 62.84% 78.0%
(11)* (6)* (8)* (4)* (3)* (7)* (4)* (10)* (9)* (2)* (5)* (1)*
90
80
Porce ntaje de biode gradación
70
60
50
40
30
20
10
0
-10 0 10 Tiempo (Días) 20 30
Patrón Swinglea glutinos a + pool de bacilos
Swinglea glutinos a + Cons orcios I, II, III, IV Swinglea glutinos a + pool Cocos - Cocobacilos
Brachiaria s pp + pool bacilos Brachiaria spp + cons orcios I, II, III IV
Brachiaria s pp + Cocos - Cocobacilos pool de formas bacilares
Cons orcios I, II, III, IV Pool de Cocobacilos - Cocos
Swinglea glutinos a Brachiaria spp
*Valores comparativos máximos y mínimos en los porcentajes de biodegradación.
Figura 79 Curvas comparativas de los Porcentajes de biodegradación logrados mediante el diseño experimental de
Fitobactorremediación, Fitorremediación y Biorremediación.
• Se observó que para la mayoría de los semilleros se presentó un período de latencia,
donde el porcentaje de biodegradación fue bajo. En los primeros diez días se obtuvo un
porcentaje de biodegradación menor al 20%, este período esta relacionado con el previo
crecimiento de los consorcios bacterianos inoculados, y la adaptación de las especies
vegetales después del transplante en un suelo contaminado con crudo el Cusiana,
adaptación que duró aproximadamente 12 días en todos los casos.
En los semilleros donde estaban presentes las inoculaciones de los consorcios I, II, III, IV
adaptado en un medio de sales ausente de elementos orgánicos se obtuvo los mejores
porcentajes de biodegradación (En la Figura 79 el 3* y 4*) siguiendo el tratamiento
con el inóculo de pool Cocos-Cocobacilos (En la Figura 79 el 4* y 7*) y finalmente
el pool Bacilos (En la Figura 79 el 6* y 8*). Este incremento en eficiencia demuestra
la importancia del uso de los consorcios microbianos nativos bioaumentados
adaptados en bioprocesos como soluciones loables en suelos contaminados con
derrames de crudo.
• De acuerdo con los resultados de biodegradación obtenidos en los diferentes semilleros
se observó que en las eras donde estaban presentes todos los grupos de organismos a
manera de consorcio (Bacterias + raíz) no se obtuvo porcentajes de biodegradación
superiores a aquellos tratamientos donde solo se encontraban inoculaciones bacterianas.
Esto es debido a relaciones de antagonismo entre los organismos en condiciones estresantes
causados por un aumento excesivo de su población bacteriana, competencia por la escasez
de alimento, presencia de contaminantes tóxicos. Permitiendo un mejor funcionamiento de

los microorganismos por sus mayores capacidades de tomar nutrientes y por su previa
adaptación a los contaminantes.
• El tratamiento Brachiaria spp + pool de Cocobacilos - Cocos ( en la Figura 79 el 4*)
tuvo los resultados más favorables, respecto a este inóculo, indicando los efectos sinergicos
de Brachiaria spp frente al consorcio Cocobacilos - Cocos en un sustrato contaminado.
FASE II Efecto del crudo en el desarrollo de las plantas.
• Efecto del crudo en el desarrollo Brachiaria spp. Los valores agronómicos de altura del
vástago, diámetro del tallo, biomasa de la raíz, longitud de la raíz, biomasa total, cobertura,
nutrición de las plantas e índice de tolerancia se indican en los Cuadros 40 y 43
La respuesta al trasplante de Brachiaria spp cultivadas en suelos contaminados con crudo
Cusiana y Brachiaria spp cultivadas en suelo no contaminado fue la muerte de los tallos
rastreros más largos y el aumento de la necromasa en la base del vástago; quince días
después aparecieron tallos nuevos cortos, erectos, con hojas de color verde claro y mayor
cobertura y crecimiento.
Los valores agronómicos de altura del vástago, diámetro del tallo, longitud de la raíz, y
cobertura se determinaron por la ecuación 5 (pagina 111) El índice de tolerancia se
determinó por la ecuación 6 (pagina 112). Se obtuvo un índice de tolerancia de 1.04,
esquematizado en la Figura 80 notándose una respuesta positiva del cultivo Brachiaria spp
al sustrato suelo – crudo al 30% con un buen crecimiento.

Cuadro 40. Resultados agronómicos de altura y diámetro del vástago, cobertura y biomasa de las plantas, densidad, biomasa, y
longitud de la raíz logrados en plantas de Brachiaria spp y Swinglea glutinosa crecidas durante un mes en dos sustratos experimentales.
ToleranciaIndice de
Tratamientos Raíz Tallo Planta
Longitud Biomasa Longitud Diámetro Biomasa Cobertura
(cm) (g) (cm) (cm) (g) (%)
Final Final Inicial Final Inicial Final Final Inicial Final
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
18,0 20,5 3,7 4,0 41,0 39,0 55,0 53,0 0,4 0,6 0,5 0,7 30,3 15,4
13,0 11,3 3,5 4,1 32,0 34,0 43,0 48,0 0,6 0,5 0,7 0,6 32,2 26,1
C1d0s0 44 47 80 82
14,5 13,0 3,1 3,6 26,0 21,0 30,0 38,0 0,4 0,5 0,6 0,6 25,1 28,6
25,5 18,0 3,0 3,8 36,0 22,0 51,0 37,0 0,5 0,5 0,6 0,6 27,2 35,8
0.146
15,0 17,5 3,0 1,9 36,0 35,0 39,0 36,0 0,4 0,5 0,5 0,5 21,9 18,4
11,0 12,7 2,3 1,7 32,0 43,0 35,0 44,0 0,4 0,5 0,4 0,5 33,9 20,7
c1d0s1 60 63 70 73
11,0 13,5 2,7 2,3 23,0 34,0 25,0 35,0 0,4 0,5 0,5 0,5 12,4 23,3
15,0 9,8 2,7 1,9 34,0 33,0 37,0 34,0 0,5 0,5 0,6 0,5 8,5 14,2
38,0 36,0 4,4 5,3 35,0 37,0 63,6 101,3 0,5 0,6 0,7 0,7 18,3 26,3
39,0 41,0 4,6 4,9 31,0 38,0 56,6 115,3 0,6 0,7 0,7 0,8 47,9 41,9
C2d0s0 35 31 80 86
28,0 33,0 4,4 4,7 32,0 35,0 61,0 102,0 0,6 0,7 0,8 0,9 25,3 29,7
25,0 26,0 5,0 5,3 30,0 42,0 51,6 134,5 0,5 0,5 0,7 0,7 50,1 43,3
1.04
32,0 31,0 7,0 6,9 29,0 37,0 68,3 75,8 0,4 0,5 0,5 0,6 72,4 75,9
33,0 26,0 6,4 6,3 34,0 36,0 80,1 68,5 0,5 0,7 0,6 0,9 44,5 47,3
c2d0s1 25 36 90 92
35,0 30,0 6,9 5,4 31,0 43,0 66,6 168,3 0,6 0,8 0,7 0,9 53,1 40,4
31,0 32,0 6,0 5,0 37,0 41,0 76,6 107,0 0,5 0,6 0,6 0,8 29,7 31,0
* C1 = Swinglea glutinosa. C2 = Brachiaria spp, d0 = sin inóculo.
** S0 = suelo sin crudo, S1 = suelo con crudo
Brachiaria spp
54
Suelo
53
sin
52 crudo
51 Suelo
50 con
crudo
49
Tiem po (30 Días )
Figura 80 Crecimiento del tallo de Brachiaria spp en un sustrato con crudo y otro sin
Brachiaria spp sin crudo (inicial) Brachiaria spp con crudo (inicial)
Brachiaria spp sin crudo (Final) Brachiaria spp con crudo (Final)
Figura 81 Observación de los tratamientos en campo de los diferentes semilleros que
visualizan los efectos del crudo en el desarrollo de Brachiaria spp.

En la Figura 81 se observan los resultados de los tratamientos realizados en campo en las
pruebas de tolerancia de Brachiaria spp al crudo Cusiana, notándose diferencias claras en
cada una de las variables estudiadas, obteniéndose los siguientes resultados (Cuadro 41):
Cuadro 41. Resultados finales de cada una de las variables estudiadas en plantas de
Brachiaria spp cultivadas en suelos contaminados y sin contaminar.
Variables Brachiaria spp sin crudo Brachiaria spp con crudo

Altura tallo 50.75 cm 53 cm
Diámetro tallo 0.163 cm 0.125 cm
Longitud raíz 33.25 cm 31.25 cm
Biomasa raíz 4.83 g 6.24 g
Biomasa total 35.38 g 49.38 g
Cobertura 25% 30.25%
Con estos resultados se observa una tendencia a desarrollar biomasa aérea ‘ Vicio de
crecimiento’ en un suelo contaminado. A diferencia de la aparente similitud en el
desarrollo de raíces en los dos tipos de suelos.
En el Cuadro 42 se observan los resultados de las variaciones de pH en cada uno de los
semilleros de estudio, cultivados con Brachiaria spp.
No se presentaron variaciones significativas en un suelo contaminado con crudo Cusiana y
en un suelo sin contaminar. Los semilleros cultivados con Brachiaria spp en suelos no
Cuadro 42 Variaciones del pH como consecuencia del crecimiento de Brachiaria spp en
un suelo contaminado / sin contaminar.

Variación del pH
Brachiaria spp
Réplicas
Día
S0 C2 S1 C2
1 2 1 2
6 6.0 6.3 6.1 6.0
11 6.4 6.2 6.2 6.4
16 6.1 6.4 6.4 6.3
21 6.0 6.6 6.6 6.4
26 6.3 6.1 6.7 6.7
31 6.4 6.3 6.4 6.5
* S0 = Suelo sin crudo, S1 = Suelo con crudo.

**C2 = Brachiaria spp.
contaminados presentaron un pH máximo de 6.4 hacia el día 31 y un pH mínimo de 6.0 al
6 día, y en suelos contaminado presentaron un pH máximo de 6.7 hacia el día 26 y un pH
mínimo de 6.0 al 6 día.
En cuanto a los nutrientes para Brachiaria spp (Cuadro 43) la disponibilidad relativa de los
micronutrientes (excepto el Boro) para las plantas y la microbiota del suelo esta debajo de
un pH de 5.5, y la disponibilidad de los elementos primarios y secundarios esta por encima
de este pH, por lo tanto como observamos en los Cuadros 42 y 43 el pH del suelo incentivó
la disponibilidad de los elementos mayores para las plantas y bacterias.
En este sentido como se observa en el Cuadro 43 los análisis foliares resultaron ser
adecuados o superiores a los niveles aceptados (Anexo C) en cuanto a K+, Mg++ y Ca++ e
inferiores para los microelementos.

En el Cuadro 43 se observa el análisis foliar para cada elemento de estudio, realizados en el
laboratorio.
Cuadro 43 Resultados del análisis foliar para los elementos Ca, Mg, K, Al, Cu, Zn, Fe,
Mn, B y Ni en Brachiaria spp para cada tratamiento.
Tratamiento Ca Mg K Al Cu Zn Fe Mn B Ni
Brachiaria spp % ppm
Suelo sin crudo + plantas sin
1,6 0,9 2,2 1,8 5 15,5 81,7 13,3 2,4 0,06
inóculo
Suelo + crudo + plantas sin
1 0,8 1,6 1,2 6,4 18,1 140 21,5 3,6 0,09
inóculo
Estos resultados son dependientes de los nutrientes que aporta el suelo a los
microorganismos y plantas. Como los nutrientes primarios y secundarios se encontraban en
niveles adecuados en el suelo, no se encontraron deficiencias en las plantas, caso contrario
para los micronutrientes.
Pero esta disponibilidad de los nutrientes no solo esta afectada por su presencia en el suelo
ó el pH edáfico, también influyen factores como la competencia entre los organismos y la
presencia de contaminantes. Se observo que la presencia del crudo en el suelo disminuyó la
población bacteriana, que son más eficaces para tomar los nutrientes, por ello los niveles
bajos de los micronutrientes (Cu, Zn, Fe, Mn y B) son aun más bajos en el análisis foliar de
las plantas desarrolladas en un suelo sin contaminar, respecto a las plantas cultivadas en un
medio contaminado.
La presencia del contaminante, disminuyo en parte la disponibilidad de los nutrientes
primarios y secundarios (Ca y K) para las plantas, por ello, los niveles adecuados de los
nutrientes primarios y secundarios de Brachiaria spp cultivada en suelos contaminados
están en los valores bajos del intervalo de los niveles aceptados, comparado con los valores
altos del intervalo de los niveles aceptados en Brachiaria spp cultivadas en suelos sin
contaminar.
El Boro se mantiene en niveles deficientes, el Zinc y el Manganeso están bajos. Los demás
nutrientes se encontraron en los niveles adecuados.
Se observó un incremento notorio del Hierro en las plantas cultivadas en suelos
contaminados con crudo de Cusiana.
En el Cuadro 43 se aprecian los datos del análisis foliar para los metales pesados,
observándose una Fitoextracción de Ni de los suelos contaminados por el crudo de Cusiana
(0.09 ppm), comparado con el valor del análisis foliar para las muestra vegetales de plantas
cultivadas en un suelo sin contaminar (0.06 ppm). El valor encontrado en el análisis foliar
de Brachiaria spp cultivada en suelos contaminados, se encuentra dentro de los rangos
aceptados para esta especie vegetal, con lo que se determinó que no existió un flujo de
materiales tóxicos hacia los productores secundarios.
• Efecto del crudo en el desarrollo Swinglea glutinosa. Los valores agronómicos de
altura del vástago, diámetro del tallo, biomasa de la raíz, longitud de la raíz, biomasa total,
cobertura, nutrición de las plantas e índice de tolerancia se indican en los Cuadros 40 y 46.
El transplante de Swinglea glutinosa no tuvo efectos adversos: el 97 % de las plantas
cultivadas pudieron desarrollarse. Durante el crecimiento en un suelo sin sustrato (crudo)
se observaron hojas de color verde oscuro, hojas caídas durante el transcurso del
experimento con un peso seco de 3.06 gramos, un gran número de retoños que aumentó de
manera sustanciosa la cobertura y muy pocas hojas inferiores de color amarillo.
En un suelo contaminado se observaron hojas de color verde - amarillento, hojas caídas
durante el transcurso del experimento con un peso seco de 3.06 gramos y un buen número
de retoños con hojas grandes.
Se obtuvo un índice de tolerancia de 0.144, esquematizado en la Figura 82 notándose una
respuesta negativa del cultivo Swinglea glutinosa al sustrato suelo – crudo al 30% .
Swinglea glutinosa
14
12 Suelo
Altura del tallo (cm)
10 sin
8 crudo
6
Suelo
4 con
2 crudo
0
Tiem po (30 Días)
Swinglea glutinosa sin crudo (inicial) Swinglea glutinosa con crudo (inicial)
Figura 82 Crecimiento del tallo de Swinglea glutinosa en un sustrato con crudo y otro sin
Swinglea glutinosa sin crudo (final) Swinglea glutinosa con crudo (final)
Figura 83. Tratamientos en campo de los diferentes semilleros que visualizan los efectos
del crudo en el desarrollo de Swinglea glutinosa.
En la Figura 83 se observan los tratamientos realizados en campo para las pruebas de
tolerancia de Swinglea glutinosa en la presencia del crudo Cusiana, notándose diferencias
claras en cada una de las variables estudiadas, obteniéndose los siguientes resultados
(Cuadro 44):
Swinglea glutinosa cultivadas en suelos contaminados y sin contaminar

Variables S. glutinosa sin crudo S. glutinosa con crudo
Altura tallo 13 cm 1,88 cm
Diámetro tallo 0,11 cm 0,04cm
Longitud raíz 16,7 cm 13,2 cm
Biomasa raíz 3,6 g 2,31 g
Biomasa total 27,6 g 19,2 g
Cobertura 35.5% 10%
La comparación de los datos determina una notable disminución de cada uno de los
parámetros de medida. Notándose una tolerancia baja por parte de Swinglea glutinosa al
hidrocarburo.
Cuadro 45 Variaciones del pH como consecuencia del crecimiento de Swinglea glutinosa
en un suelo contaminado / sin contaminar.
Variación del pH
Swinglea glutinosa
Día
S0 C1 S1 C1
RÉPLICAS
1 2 1 2
6 6.1 6.3 6.0 6.0
11 6.5 6.5 6.3 6.4
16 6.4 6.4 6.5 6.2
21 6.2 6.7 6.9 6.8
26 6.3 6.4 6.8 7.1
31 6.1 6.2 7.0 6.7
* S0 = Suelo sin crudo, S1 = Suelo con crudo.
** C1 = Swinglea glutinosa.
No se presentaron variaciones significativas en un suelo contaminado con crudo Cusiana y
en un suelo sin contaminar. Los semilleros cultivados con Swinglea glutinosa en suelos no
contaminados presentaron un pH máximo de 6.7 hacia el día 21 y un pH mínimo de 6.1 al
sexto día, y en suelos contaminado presentaron un pH máximo de 7.1 hacia el día 26 y un
pH mínimo de 6.0 al sexto día.

En cuanto a los nutrientes, como se vé en los Cuadros 45 y 46 el pH y las cantidades
necesarias de nutrientes en el suelo benefició la disponibilidad de los elementos mayores
para de las plantas y bacterias. Se presentaron niveles adecuados o superiores a los niveles
aceptados en cuanto a K+, Mg++ y Ca++ e inferiores para los microelementos. (Anexo C).
Mn, B y Ni en Swinglea glutinosa correspondientes a cada tratamiento
Tratamiento Ca Mg K Al Cu Zn Fe Mn B Ni
Swinglea glutinosa % ppm
Suelo sin crudo + plantas
4,5 0,5 0,9 3,2 3,6 20,2 87,6 17,9 4.72 0,08
sin inóculo
Suelo + crudo + plantas sin
6,3 0,65 1,25 4,6 3,5 23,8 148 16,3 6 0,09
inóculo
Se encontró que la presencia del crudo en el suelo disminuyó la población bacteriana, que
son más eficaces para tomar los nutrientes, por ello se observó en el análisis foliar de las
plantas, que los niveles bajos de los micronutrientes (Cu, Zn, Fe, Mn y B) y los niveles
aceptados de los elementos primarios y secundarios (Ca, Mg y K) se encontraron en rangos
superiores en las plantas cultivadas en un suelo contaminado, respecto a las plantas
cultivadas en un medio sin contaminar.
El Boro se mantiene en niveles deficientes, el Zinc, el cobre y el Manganeso están bajos y
el Calcio, el Magnesio, el Potasio y el Hierro están en los niveles adecuados.

Se observo un incremento notorio del Hierro en las plantas cultivadas en suelos
contaminados con crudo de Cusiana.
En el Cuadro 46 se aprecian los datos del análisis foliar para los metales pesados y no se
observo una Fitoextracción de Ni por parte de Swinglea glutinosa en suelos contaminados
(0.09 ppm), comparado con el valor del análisis foliar para las muestra vegetales de
Swinglea glutinosa cultivadas en un suelo sin contaminar (0.08 ppm). Este valor determinó
que no existió un flujo de materiales tóxicos hacia los productores secundarios.
Se observo que el crudo ejerció un efecto positivo en la fertilidad del suelo y en la nutrición
de las plantas, las diferencias de Boro podrían estar asociadas a su concentración en el
suelo; lo mismo que el Cobre, Zinc y Manganeso, que están a concentraciones bajas.
La presencia de algunos compuestos de bajo peso molecular y de Hierro en el crudo de
Cusiana, determinó un efecto negativo en el crecimiento de Swinglea glutinosa y una
tolerancia a niveles aumentados de Hierro y a la presencia de estos compuestos de bajo
peso molecular por parte de Brachiaria spp.
Se observo que el crudo ejerció un efecto positivo en el desarrollo de las plantas de
Brahiaria spp cultivadas en suelos contaminados.
FASE III Análisis de la interrelación planta - bacteria sobre los procesos
biodegradativos. Este análisis se estudió en tres etapas:

ETAPA 1. Efecto de la población bacteriana en el desarrollo de las plantas cultivadas
en los diferentes semilleros contaminados con crudo Cusiana.
 Efecto de la población bacteriana en el desarrollo de Brachiaria spp. Las variables
estudiadas se indican en los Cuadros 47, 48, y 49.
Cuadro 47 Observaciones de las variables estudiadas para Brachiaria spp en cada

tratamiento.
Brachiaria spp
Variables
Raíz Tallo Planta
Tratamientos
(cm) (g) (cm) (cm) (g) %
Patrón 31.25 6.24 52.9 0.125 81.79 60.5
Consorcio I, II, III, IV 36,5625 9,3 65,85 0,1125 52,4125 53
Pool Bacilos 32,625 6,2875 56,3375 0,1375 55,5375 40.5
Pool Cocos - Cocobacilos 30,79 8,2 66,5 0,175 78,5 70
* El fondo de color gris corresponde a los valores que son menores al tratamiento patrón
Cuadro 48 Efectos de los inóculos en la altura del vástago, cobertura, diámetro del tallo, densidad de la raíz y biomasa en Brachiaria
spp crecidas durante un mes en un sustrato experimental de suelo - crudo.
Raíz Tallo Planta
Tratamientos
(cm) (g) (cm) (cm) (g) (%)
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
32 31 7 6,9 29 37 68,3 75,8 0,4 0,5 0,5 0,6 112,4 105,9
33 26 6,4 6,3 34 36 80,1 68,5 0,5 0,7 0,6 0,9 104,5 107,3
C2d0s1 25 36 90 92
35 30 6,9 5,4 31 43 66,6 168,3 0,6 0,8 0,7 0,9 93,1 80,4
31 32 6 5 37 41 76,6 107 0,5 0,6 0,6 0,8 19,7 31
32 36 7,9 5,4 33 34 46,3 78,3 0,4 0,6 0,5 0,7 82,3 69,4
28 33 8 5,1 31 35 47,5 125 0,8 0,4 0,9 0,5 60 66,1
C2d1s1 23 33 67 70
34 35 7,1 4,4 39 37 76,3 122,5 0,4 0,9 0,5 1,1 54,7 44,4
31 32 7,6 4,8 34 36 58,8 175 0,9 1 1 1,3 31,6 35,8
38 30 7,7 12,7 28 31 69,3 85 0,7 0,7 0,8 0,9 50,2 24,6
38,5 36 6,9 10,1 26 27 63,4 102,9 0,7 0,9 0,8 1 70,9 32,4
C2d2s1 21 29 76 80
38 39 7,3 10,9 33 34 73 127,1 0,8 0,6 0,9 0,7 50,7 57,7
36 37 6,9 11,9 38 33 88,6 167,5 0,9 0,7 1 0,8 59,7 73,1
34 29 8,3 9 31 35 60,2 117,5 1 0,8 1,1 0,9 94,1 89,1
34,5 27 7,4 8,9 35 32 76,6 118 1 1 1,3 1,3 96,9 88,1
C2d3s1 26 31 97 100
31,8 32 6,8 8 27 41 58,8 175 0,7 1,1 0,8 1,3 60,8 69
24 34 7,7 9,3 29 38 64,8 129 0,8 0,8 0,9 1 62,3 67,4
* C2 = Brachiaria spp. S1 = suelo con crudo. ** d0 = sin inóculo, d1 = pool bacilos, d2 = Consorcio I, II, III, IV, d3 = pool de Cocos – Cocobacilos.
El fondo de color gris del Cuadro 47, indican los resultados de los parámetros que son
menores al tratamiento patrón y con esto se aprecia que los inóculos microbianos
beneficiaron el desarrollo del tallo y de la raíz de Brachiaria spp y disminuyeron la parte
aérea de la planta.
En el tratamiento Brachiaria spp más los consorcios I, II, III y IV se observó un buen
número de tallos largos y viejos, hojas de color verde, algunos tallos jóvenes y necromasa
en su vaina foliar, aquí se vio favorecida la variable raíz al obtenerse los mayores valores
del crecimiento (36.56 cm).
El tratamiento Brachiaria spp más el pool de Cocobacilos y Cocos presentó la mejor
apariencia, con muchos tallos jóvenes erectos con hojas de color verde y un apreciable
aumento en la cobertura (70%), en este tratamiento se vio favorecida la biomasa de la raíz,
el tallo y la parte aérea de la planta, indicando un efecto positivo del inóculo en el
desarrollo de la planta.
El tratamiento Brachiaria spp más el pool de bacilos fue muy parecido al patrón,
presentaron muchas hojas muertas en su vaina foliar, las hojas fueron de color verdoso y
tuvieron poco aumento en la cobertura (40.5%).
En el tratamiento Brachiaria spp sin inóculo (‘Patrón’) se observaron muchas hojas muertas
en su vaina foliar, y hojas de color verdoso, presentó los valores más bajos para las
variables tallo (52.9 cm) y raíz (31.25 cm) y los mas altos para la biomasa de la planta
(81.79 g) (Figura 84).
Cuadro 49 Resultados del análisis foliar para los elementos Ca, Mg, K, Al, Cu, Zn, Fe, B
y Ni en Brachiaria spp más los inóculos bacterianos correspondientes a cada tratamiento.
Ca Mg K Al Cu Zn Fe Mn B Ni
Tratamiento
% ppm
Brachiaria spp
Suelo con crudo, sin inóculo 1,6 0,9 2,2 1,8 5 15,5 81,7 13,3 2.4 0,06
Suelo con Pool de bacilos 1,3 1,2 2,2 1,1 6,3 16,7 78,6 32 2.8 0,06
crudo y Consorcio I, II, III, IV 1,3 1,1 2,3 1,6 5,1 15,5 71,4 26,6 3.26 0,04
Con Pool de Cocos- 1,7 1,5 2,2 0,7 4 16,3 152 39,3 2.8 0,01
Inóculo. Cocobacilos
En el análisis foliar se observaron rangos mayores de los microelementos y del Magnesio,
en las plantas inoculadas con bacterias, excepto el Aluminio, el Hierro y el Calcio
que presentaron rangos menores.
En el tratamiento Brachiaria spp más el pool de Cocobacilos – Cocos se encontraron
niveles altos de Hierro, que no llegaron a ser tóxicos para Brachiaria spp, pues este fue el
tratamiento que presentó la mejor apariencia.
En el Cuadro 49 se observan valores adecuados para Ca, Mg, K y Fe, valores bajos para los
micronutrientes excepto el Hierro y valores deficientes para el Boro (Anexo C).

Brachiaria spp + pool de Cocos y Brachiaria spp + Consorcio I, II, III, Brachiaria spp sin inóculo (inicial) Brachiaria spp + pool bacilos
Cocobacilos (inicial) IV (inicial) (inicial)
Brachiaria spp + pool Cocos Brachiaria spp + Consorcios I, II, Brachiaria sin inóculo Brachiaria spp + pool bacilos
y Cocobacilos (Final) III, IV) (Final) (Final) (Final)
Figura 84. Tratamientos en campo de los diferentes semilleros que visualizan los efectos de los inóculos bacterianos en el desarrollo
fisiológico de Brachiaria spp.

Las deficiencias de Boro y los valores bajos de los micronutrientes están asociadas a su
concentración en el suelo.
Las cantidades necesarias de nutrientes en el suelo benefició la disponibilidad de los
elementos mayores para Brachiaria spp y para las bacterias.
La presencia de niveles medios o altos de K+ benefició el desarrollo de esta gramínea, ya
que son adecuadas para tomar este tipo de iones.
En todos los tratamientos se observaron niveles de Ni aceptados para los tejidos vegetales
(0.06 ppm, 0.04 ppm, y 0.01 ppm) sin efectos negativos para los productores secundarios.
En general, se presentó un efecto positivo en la nutrición de Brachiaria spp por parte de los
inóculos bacterianos.
 Efecto de la población bacteriana en el desarrollo de Swinglea glutinosa. Los valores
agronómicos de altura del vástago, diámetro del tallo, biomasa de la raíz, longitud de la
raíz, biomasa total, cobertura y nutrientes se indican en los Cuadros 50, 51 y 52
 El fondo de color gris del Cuadro 50, indican los resultados de los parámetros que son
menores al tratamiento patrón y con esto se aprecia que los inóculos microbianos
beneficiaron el desarrollo vegetal de Swinglea glutinosa y disminuyeron la biomasa total de

las plantas inoculadas con el Pool de bacilos (14,8 cm) y el Pool Cocos - Cocobacilos (15,8
cm).
Cuadro 50. Resultados de las variables estudiadas para Swinglea glutinosa en cada
tratamiento.
Swinglea glutinosa
Variables
Raíz Tallo Planta
Tratamientos
(cm) (g) (cm) (cm) (g) %
Patrón 13,1875 2,3125 1,75 0,038 19,2 10
Pool de bacilos 18,325 2,5 1,95 0,038 14,8 10.5
Consorcios I, II, III, IV 16,45 2.85 3,413 0,025 22,6 28.5
Pool Cocos - Cocobacilos 14,9 1,85 2,088 0,038 15,8 -14.5
 En el tratamiento Swinglea glutinosa más el pool de bacilos, se presentaron hojas de
color verde claro, pequeños retoños, aumentando de manera discreta la cobertura (10.05%),
muy pocas hojas inferiores de color amarillo y hojas caídas durante el transcurso del
experimento con un peso seco de 0.9 gramos, se presentó el mayor valor para la longitud de
la raíz (18.325 cm) Se obtuvo una planta muerta en las dos réplicas (Figura 85).
 En el tratamiento Swinglea glutinosa más los Consorcios I, II, III, IV, se presentaron los
mayores valores de crecimiento de 2.85 cm para la longitud de la raíz, 3.4 cm para la
longitud del tallo, 22.6g para la biomasa total de la planta y 28.05% en el aumento de la
cobertura. Se observaron hojas de color verde claro, buen número de retoños, hojas caídas
Cuadro 51 Efectos de los inóculos en la altura del vástago, cobertura, diámetro del tallo, densidad de la raíz
y biomasa en Swinglea glutinosa crecidas durante 30 días en un sustrato experimental de suelo - crudo.
Raíz Tallo Planta

Tratamientos
(cm) (g) (cm) (cm) (g) (%)
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
15 17,5 3 1,9 36 35 39 35 0,4 0,5 0,5 0,5 21,9 18,4
11 12,7 2,3 1,7 32 43 35 44 0,4 0,5 0,4 0,5 33,9 20,7
C1d0s1 60 63 70 73
11 13,5 2,7 2,3 23 34 25 35 0,4 0,5 0,5 0,5 12,4 23,3
15 9,8 2,7 1,9 34 33 37 34 0,5 0,5 0,6 0,5 8,5 14,2
19,3 20 3 1,7 31,7 32,8 33.0 34.0 0,5 0,5 0,5 0,6 15,8 15,7
22 22 3,1 1,8 38 29 40,5 31,2 0,3 0,6 0,5 0,6 16,5 17
C1d1s1 65 70 75 81
24 15,3 3,3 2,4 39 26 39,4 28,3 0,5 0,4 0,5 0,4 18 12,5
15 9 2,6 2,1 40,8 38 45 39,5 0,6 0,5 0,6 0,5 11,4 11,6
22 12,3 2,3 2,8 27 35 30,6 35,3 0,5 0,6 0,5 0,6 13,7 41,5
11 22 1,9 3,8 35 34 41,2 36,3 0,6 0,6 0,6 0,6 22,5 20,8
C1d2s1 42 50 70 79
10 17,3 2,1 3,5 40,5 36 46,8 39 0,5 0,4 0,5 0,6 16,2 19,7
14 23 2,5 3,9 26 41 26,6 46 0,5 0,4 0,5 0,4 21,3 25,2
11 23 2,3 2,1 39 39 40,5 39,5 0,5 0,5 0,5 0,6 18 12,1
14 11 1,7 1,4 24 30 25,5 31,5 0,5 0,4 0,5 0,5 15,6 14,1
C1d3s1 53 65 40 47
16,7 19,5 1,6 1,6 30 28 34,1 31 0,5 0,5 0,5 0,5 14,1 17,5
11 13 2,1 2 31 32 34,3 33,3 0,4 0,4 0,5 0,4 13,4 21,8
* C1 = Swinglea glutinosa. S1 = suelo con crudo. ** d0 = sin inóculo, d1 = pool de bacilos,
d2 = Consorcio I, II, III, IV. d3 = pool de Cocos – Cocobacilos.
durante el transcurso del experimento con un peso seco de 3.0 gramos. Se obtuvo una
planta muerta en las dos réplicas (Figura 85).
 El tratamiento Swinglea glutinosa más el pool de Cocobacilos - Cocos fue el más
afectado; se presentaron hojas de color verde amarillento, algunas tenían puntos redondos
de color amarillo, muy pocos retoños y una disminución de la cobertura del (-14.5%), hojas
caídas durante el transcurso del experimento con un peso seco de 4.5 gramos. Se
obtuvieron tres plantas muertas en cada réplica. (Figura 85).
 En el tratamiento Swinglea glutinosa sin inóculo (‘Patrón’), las hojas superiores nuevas
fueron grandes, de color verde claro con un buen número de retoños que no aumentaron
mucho la cobertura (10%) porque sus ramas no se extendieron, hojas caídas durante el
transcurso del experimento con un peso seco de 3.06 gramos. No se obtuvo ninguna planta
muerta. (Figura 85)
Mn, B y Ni en Swinglea glutinosa más los inóculos bacterianos correspondientes a cada
tratamiento.
Ca Mg K Al Cu Zn Fe Mn B Ni
Tratamiento
% ppm
Swinglea glutinosa
Patrón 4,5 0,5 0,9 3,2 3,6 20,2 87,6 17,9 4.72 0,08
Suelo con Pool bacilos 5 0,5 0,8 4,5 4,35 31,5 103 13,5 4.8 0,1
crudo y Consorcio I, II, III, IV 5,2 0,6 1 3,2 3,75 26,4 96 17 5.56 0,1
Con
Pool Cocos- Cocos 3,8 0,55 0,75 1,95 4,5 19,1 87,6 18,2 3.9 0,06
Inóculo.
En cuanto a los nutrientes (Cuadro 52) se apreciaron niveles bajos para los microelementos,
y niveles altos para los nutrientes secundarios.
Las deficiencias de los microelementos están asociadas a su concentración en el suelo.
En general, se presentó un efecto positivo en la nutrición de Swinglea glutinosa por parte de
los inóculos bacterianos.
En todos los tratamientos se observaron niveles de Ni aceptados para los tejidos vegetales
(0.1 ppm, 0.1 ppm, y 0.06 ppm) con un flujo nulo de elementos tóxicos para los
productores secundarios.
Se observó para todos los tratamientos cultivados con Brachiaria spp y Swinglea glutinosa
• Niveles altos de Ca, y Mg, observación vista en el análisis de suelos contaminados con
crudo (Cuadro 9). Existe poca información disponible sobre los síntomas de toxicidad de
estos elementos
• Niveles adecuados de potasio para la mayoría de los tratamientos. Normalmente no
existe demasiada absorción de este elemento.
• Niveles bajos de los microelementos, asociados con su concentración en el suelo

Swinglea glutinosa + pool Swinglea glutinosa +Consorcios I, Swinglea glutinosa sin inoculo Swinglea glutinosa + pool bacilos
Cocobacilos y Cocos. Tratamiento II, III, IV (inicial)
(inicial) (inicial) (inicial)
Swinglea glutinosa + pool Cocobacilos y Swinglea glutinosa + Swinglea glutinosa sin inoculo Swinglea glutinosa + pool bacilos
Cocos. Tratamiento Consorcios I, II, III, IV (Final)
(Final) (Final) (Final)
Figura 85. Tratamientos en campo de los diferentes semilleros que visualizan los efectos de los inóculos bacterianos en el desarrollo
fisiológico de Swinglea glutinosa.

Las deficiencias de micronutrientes, con frecuencia B, Cu y Zn son muy comunes en
Colombia; el Cu y el Zn son cationes metálicos pesados que son fácilmente adsorbidos por
el suelo. El Boro es un elemento que es fácilmente lixiviado.
ETAPA 2. Efecto de las plantas en el crecimiento poblacional de las bacterias
inóculadas presentes en los diferentes semilleros con suelos contaminados con crudo
Cusiana. Los valores del crecimiento celular durante el transcurso del experimento se
indican en la Figura 86 y en el Cuadro 53.
Cuadro 53 Recuentos de los inóculos bacterianas bioaumentados en los diferentes
semilleros durante el período de tratamiento ''in Situ'.
Tratamientos número de bacterias (Cel / g) x 105

c 0 d1 co d2 c 0 d3 c 1 d1 c 1 d2 c1 d3 c2 d1 c 2 d2 c 2 d3
Día
RÉPLICAS
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
0 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8
3 20 25 950 980 33 38 15 19 42 52 19 27 29 38 82 98 950 990
6 350 380 2200 2900 250 280 201 250 320 360 121 150 720 670 650 690 2950 3100
9 850 730 4100 4200 610 600 450 310 700 780 261 220 1110 1690 910 870 5700 5300
12 1210 1550 7100 7900 980 910 530 690 1000 1100 650 590 970 980 1200 1350 6800 7100
15 2130 2500 9400 9900 1920 1200 820 880 1510 1600 880 950 1500 1750 1900 1400 8900 8100
18 3800 3900 11900 11700 2900 2600 1100 1210 1800 1950 1250 1300 2200 2500 2900 2400 9100 9900
21 4800 4000 12600 13000 3800 3500 1450 1300 2500 2100 1300 1500 3100 2800 2700 2900 10500 10800
24 5700 5400 13400 13900 4900 4100 1500 1650 2400 2800 1400 1700 3800 3600 3400 3800 11700 11100
27 6900 6200 14000 14200 4200 4500 1700 1650 3200 3100 1850 1950 4200 3800 4100 4700 11900 12400
* C0 = Sin plantas C1 = Swinglea glutinosa C2 = Brachiaria spp.

** d1 = pool de bacilos d2 = Consorcios I, II, III, IV. d3 = pool de Cocos – Cocobacilos.
7,E+08 2,E+09 pool Cocobacilos -
Consorcios
1,E+09 1,E+09 Cocos
N bacterias (Cel/g)
6,E+08 Pool bacilos I, II, III, IV
1,E+09 1,E+09
5,E+08
1,E+09 1,E+09
4,E+08
8,E+08 8,E+08
3,E+08 6,E+08
6,E+08
2,E+08 4,E+08 4,E+08
1,E+08 2,E+08 2,E+08
0,E+00 0,E+00 0,E+00
-1,E+08 0 6 12 18 24 0 6 12 18 24 0 6 12 18 24
Tie m po (Días )
Bacilos sin plantas Consorcio sin plantas Cocobacilos sin plantas
Bacilos con S. glutinosa Consorcio con S. glutinosa Cocobacilos + S. glutinosa
Bacilos con Brachiaria spp Consorcio con Brachiaria sp Cocobacilos + Brachiaria sp
(A) (B) (C)
Figura 86. Crecimiento de los inóculos bacterianos presentes en los diferentes semilleros.
(A) pool de bacilos, (B) pool de los Consorcios I, II, III, IV, (C) pool de cocos -
cocobacilos.
En la Figura 86 A se pueden apreciar las influencias de las diferentes especies vegetales en
el crecimiento del pool de bacilos, notándose un crecimiento máximo para el tratamiento
sin plantas (6500 x 105 cel / g), un crecimiento medio para Brachiaria spp (4000 x 10 5 cel /
g) y un crecimiento mínimo para el tratamiento con Swinglea glutinosa (1700 x 105 cel / g),
determinándose un efecto negativo de la Swinglea glutinosa hacia el pool de bacilos.
Con esto se observó que la presencia de plantas no estimuló el crecimiento del pool de
'bacilos’ inoculados ya que no se presentaron diferencias significativas en el crecimiento
poblacional de dicho pool. (Cuadro 53).

En la Figura 86 B se observan las influencias de las diferentes especies vegetales en el
crecimiento de los consorcios I, II, III, IV; obteniéndose crecimientos bajos para los
tratamientos con Swinglea glutinosa (3150 x 105 cel / g) y Brachiaria spp (4300 x 105 cel /
g) con curvas similares. El tratamiento sin plantas presentó una curva de pendiente
pronunciada indicando un mayor crecimiento de este consorcio en ausencia de plantas
(14100 x 105 cel / g). Al igual que la anterior gráfica estas plantas no presentaron
sinergismos con el inóculo bacteriano.
En la Figura 86 C se observan las influencias de las diferentes especies vegetales en el
crecimiento del pool de Cocobacilos – Cocos, obteniéndose crecimientos altos de
pendiente pronunciada para el tratamiento con Brachiaria spp (12100 x 10 5 cel / g), a
diferencia de los otros dos tratamientos que presentaron crecimientos bajos (4300 x 10 5
cel / g para el patrón y 1900 x 105 cel / g para Swinglea glutinosa), indicando con esto un
sinergismo de la Brachiaria spp frente al pool de Cocos – Cocobacilos.
En la Figura 87 se observan los tratamientos que ofrecieron el mayor y menor aporte a la
población bacteriana inóculada. Observándose los mínimos valores para la especie vegetal
Swinglea glutinosa (1650 x 105 cel / g para el pool de bacilos, 3150 x 10 5 cel / g para el
inóculo de los consorcios I, II, III, IV y 1900 x 10 5 cel / g para el pool de Cocos -
Cocobacilos) indicando con ello un efecto antagónico entre las plantas y los inóculos
bacterianos bioaumentados.
16000
Sin plantas + Bacilos
14000
Sin plantas + Consorcio
12000
Sin plantas + Cocos y Cocobacilos
10000
Swinglea glutinosa + Bacilos
8000
Swinglea glutinosa + Consorcio
6000
S. glutinosa + Cocos - Cocobacilos.
4000
Brachiaria spp + Bacilos
2000 Brachiaria spp + Consorcio
0 Brachiaria spp + Cocos - Cocobacilos
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
-2000
Tiempo (Días)
Figura 87. Comparación del crecimiento de los inóculos bacterianos bioaumentados en
los diferentes semilleros de tratamiento.
Los consorcios I, II, III, IV bioaumentados presentaron un alto porcentaje de
biodegradación en un sustrato sin plantas (78%) con un alto número poblacional de
microorganismos. (14100 x 105 cel / g), indicando con esto una efectividad en los procesos
biodegradativos.
La especie vegetal Brachiaria spp presentó las mayores poblaciones bacterianas (12100 x
105 cel / g) frente al pool de Cocos – Cocobacilos mostrando con esto una relación de
sinergismo.
Los valores mas altos del crecimiento bacteriano los tuvieron los tratamientos sin plantas
(excepto el tratamiento Brachiaria spp más pool de Cocos - Cocobacilos.), observándose
un efecto nulo de las plantas frente a los inóculos bacterianios).

Cuadro 54 Variación del pH del suelo como consecuencia del crecimiento de las cepas
bacterianas bioaumentadas y de las especies vegetales en los diferentes semilleros durante
30 días del período de tratamiento ''in Situ'.
Variación del pH
c 0 d1 c o d2 c 0 d3 C1 d1 c 1 d2 c1 d3 c 2 d1 c2 d2 c2 d3
Día
RÉPLICAS
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
0 6,5 6,5 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52 6,52
5 6,5 6,48 6,54 6,51 6,47 6,42 6,53 6,41 6,47 6,41 6,42 6,53 6,46 6,39 6,21 6,36 6,52 6,49
10 6,1 6,38 6,47 6,32 6,32 6,35 6,41 6,36 6,45 6,25 6,31 6,23 6,45 6,35 6,18 6,28 6,48 6,51
15 6,04 6,1 6,14 6,18 6,28 6,32 6,4 6,37 6,2 6,25 6,21 6,25 6,35 6,4 6,19 6,22 6,44 6,55
20 6 6,09 6,22 6,2 6,22 6,14 6,45 6,34 6,21 6,25 6,17 6,29 6,32 6,41 6,15 6,19 6,47 6,46
25 6,2 6,07 6,12 6,21 6,18 6,21 6,35 6,3 6,25 6,21 6,19 6,31 6,23 6,39 6,03 6,18 6,43 6,4
Figura6,688. Comparación de las variaciones del pH en los diferentes semilleros de los

Sin plantas + Bacilos
6,5
inóculos bacterianos bioaumentados. Sinn plantas + Consorcios
6,4
Sin plantas + Cocos y Cocobacilos
6,3
Swinglea glutinosa + Bacilos
6,2
Swinglea glutinosa + Consorcios
pH
En el Cuadro
6,1 54 y la Figura 88 se observan las variaciones de pH registradas de cada uno
S. glutinosa + Cocobacilos y Cocos
6
de los 5,9
semilleros, obteniéndose un rango aceptable de 6.05 Brachiaria
- 6.53spppara
+ Bacilos
el crecimiento
Brachiaria spp + Consorcios
celular 5,8
de cada uno de los consorcios bacterianos y de las especies vegetales
Brachiaria cultivadas.
spp + Cocobacilos y Cocos Se
5,7
demuestra0el papel 5buffer que

10
cumple15el suelo20al observase
25
solo variaciones bajas de los
Tie m po (Días )
rangos de pH en las diferentes condiciones aportadas por los tratamientos.
ETAPA 3 Efecto de las plantas en el crecimiento poblacional de las bacterias presentes
en el suelo en los diferentes semilleros con suelos contaminados con crudo Cusiana. Los
valores del crecimiento celular durante el transcurso del experimento se indican en la
Figura 89 y el Cuadro 55.
Cuadro 55 Recuento de las bacterias nativas presentes en los diferentes semilleros
durante 30 días del período de tratamiento ''in Situ'.
Tratamientos número de bacterias

(cel/g) x 105
Día C0d0S1 C1d0S1 C2d0S1
Réplicas
1 2 1 2 1 2
0 8 8 8 8 8 8
3 17 25 26 42 95 101
6 25 31 84 123 147 112
9 97 104 121 174 210 187
12 159 171 197 229 489 501
15 111 123 223 247 525 546
18 241 274 301 368 754 702
21 301 345 524 587 645 701
24 256 301 601 629 687 725
27 374 403 598 637 704 738
*S1 = suelo con crudo, d0 = sin inóculo, C0 = sin plantas,

C1 = Swinglea glutinosa C2 = Brachiaria spp.
800
Log células / mL
600
400
200
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
Tiempo (Días)
Crudo sin plantas sin inoculo Crudo Sw inglea glutinosa Crudo Brachiaria spp
Figura 89. Crecimiento de las bacterias nativas presentes en los diferentes semilleros
contaminados
En la Figura 89 se observa una fase de adaptación de las bacterias nativas al crudo
Cusiana, etapa que dura aproximadamente nueve días, posteriormente se inició el
crecimiento celular manifestándose un leve sinergismo. Se observo el máximo valor de
crecimiento en Brachiaria spp 721 x 105 (cel / g), el nivel medio en Swinglea glutinosa
615 x 105 (cel / g) y el nivel mas bajo en el tratamiento patrón 388 x 10 5 (cel / g).
Observándose una diferencia no significativa en el crecimiento poblacional de las bacterias
presentes en los suelos contaminados.
3.5.2 Influencia de las precipitaciones en el proceso de biodegradación. En la tabla 10
y en la Figura 89 se observan las precipitaciones que se presentaron durante los treinta días
del período de tratamiento ‘in Situ’.
Tabla 10 Precipitaciones en el período de experimentación.
Mes Precipitación
Julio. 1 / 00 0,0
Julio. 2 / 00 0,0
Julio. 3 / 00 0,4
Julio. 4 / 00 0,6
Julio. 5 / 00 0,0
Julio. 6 / 00 28,5
Julio. 7 / 00 0,4
Julio. 8 / 00 0,0
Julio. 9 / 00 0,0
Julio. 10 / 00 0,0
Julio. 11/ 00 2,1
Julio. 12 / 00 7,8
Julio. 13 / 00 0,1
Julio. 14 / 00 2,3
Julio. 15 / 00 5,6
Julio. 16 / 00 0,3
Julio. 17 / 00 0,1
Julio. 18 / 00 0,0
Julio. 19 / 00 1,2
Julio. 20 / 00 0,1
Julio. 21 / 00 0,2
Julio. 22 / 00 0,0
Julio. 23 / 00 0,0
Julio. 24 / 00 4,7
Julio. 25 / 00 0,0
Julio. 26 / 00 0,9
Julio. 27 / 00 1,9
Julio. 28 / 00 2,5
Julio. 29 / 00 15,3
Julio. 30 / 00 20,6
Julio. 31 / 00 0,0
TOTAL 95,6
Fuente: Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales (IDEAM).

Valores totales diarios de precipitación (mms)
Latitud: 0700N Longitud: 7305 W Elevación: 1000 m.s.n.m
Estación: 2319070 Piedecuesta Granja. Año. 2000.
35
Precipitación (mms) 30
25
20
15
10
5
0
-5
Fecha
Figura 90. Precipitaciones en el período de experimentación.
En la Figura 90 se observan cinco picos importantes, indicando un período medio en
lluvias.
En general las precipitaciones o los riegos tuvieron influencia sobre los resultados del
proceso de biodegradación; la movilidad, las reacciones metabólicas y por ende el
crecimiento de las poblaciones de microorganismos se vieron favorecidos por la formación
de una interfaz agua – aceite en los espacios intersticiales del suelo, sumado al aire
circulante en la matriz, lo cual conllevó a una mayor disponibilidad de biomasa microbiana
para realizar el biotratamiento, además tuvieron influencia en los procesos de lixiviación
que de alguna manera intervinieron en los mecanismos de recuperación de suelos.

3.6 ANALISIS ESTADISTICO.
El análisis estadístico se inició con la verificación del supuesto ‘homogeneidad de
varianzas’, aplicando la prueba de Levene planteando las hipótesis de la siguiente manera:
H0: Las varianzas de los grupos analizados son iguales.
HA : Las varianzas de los grupos analizados son diferentes
El manejo estadístico se basó en las siguientes operaciones:
1) Para datos finales con homogeneidad de varianzas (P > 0.05) se aplico una prueba
paramétrica y para datos con heterogeneidad de varianzas de tipo irregular (P <0.05) se
aplico una prueba no paramétrica.
2) Para datos al azar de un factor con dos niveles independientes y varianzas homogéneas
se aplico la prueba 'Student' t.'; para varianzas heterogéneas se aplicó Wilcoson.
3) Cuando se obtuvieron datos al azar de un factor con mas de dos niveles independientes y
varianzas homogéneas se aplico la prueba ANOVA; si las varianzas eran heterogéneas se
aplico Kruskall – Wallis. Con base en los cálculos anteriores se elaboro una tabla del
análisis de varianza. Al comparar el estadístico de prueba (F 0, H calculado) con el valor
tabulado (valor critico) F∝ para ∝ = 0.05 y observarse FO > F tabulado se rechaza la H0

indicando una diferencia significativa entre los tratamientos. Estas pruebas son de tipo
general e indican que existen diferencias entre los tratamientos, pero no dice entre cuales.
4) Para definir cuáles tratamientos ocasionan rechazo se usó unas pruebas complementarias
o pruebas múltiples de promedios llamadas Post Anova (Test Tukey) y post Kruskal –
Wallis (Test Nemenyi), que señalan qué tan diferentes son los grupos.
5) Para datos al azar de dos factores con niveles independientes y varianzas homogéneas se
aplico la prueba ANOVA/MANOVA de dos vías; si las varianzas eran heterogéneas se
aplico Kruskall – Wallis con su posterior análisis de post Anova/ Kruskall. Con el análisis
descriptivo de las anteriores pruebas se planteó las hipótesis de la siguiente manera:
H0: σ2 = σ2
HA: σ2 ≠ σ2
Si el valor calculado era mayor que el valor critico y si la probabilidad era menor a 0.05 se
rechazaba la hipótesis nula indicando diferencias significativas entre los tratamientos.
3.6.1 Determinación del efecto del medio de sales y biosurfactante en la
biodegradación. En el Cuadro 56 se muestra el efecto estadístico del medio con sales y la
presencia ó ausencia del surfactante en la Biodegradación del crudo Cusiana.

Cuadro 56 Determinación del efecto del medio de sales y biosurfactante en la
Biodegradación.
H0: σ2 = σ2 No existen diferencias estadísticas significativas

Medio de sales C/D con
Consorcios Test estadístico
surfactante
F(1,df) 0.589185
Medio de Levene
Probabilidad 0.623294*
sales C/D ANOVA F P
sin Medio HO : Efecto de A = 0* Factor A 2.212362 0.139622*
Surfactante HO : Efecto de B = 0* Factor B 1.151367 0.285490*
surfactante
Interacción HO : Int AB = 0* Int AB 0.000620 0.980175*
• Datos con transformación de raíz cuadrada.

* Todas las HO se aceptan.
Este análisis estadístico indica que no existieron diferencias significativas en los
porcentajes de biodegradación utilizando un medio de sales D ó C (Factor A) con ó sin
surfactante (Factor B) (Figura 61).
Se favoreció al medio D, por sus bajos costos, por el aporte mínimo de sales a los suelos y
por un leve aumento en la biodegradación.
3.6.2 Determinación de la influencia del medio y del medio modificado con crudo al
10%, en el crecimiento de los inóculos seleccionados.
1) Determinación de la influencia del medio nutritivo y medio nutritivo modificado con
crudo al 10% en el crecimiento del pool de bacilos seleccionados. El cuadro 57 muestra la
influencia de los medios en el crecimiento microbiano.

Cuadro 57 Determinación de la influencia del medio nutritivo y medio nutritivo
modificado con crudo al 10%, en el crecimiento del pool de bacilos seleccionados.

Pool de Medio nutritivo sin
Test estadístico
Bacilos crudo
F(1,df) 25.20752
Medio Levene
Nutritivo T
Medio 0.000
Con crudo Wilcoson Factor A HO : Efecto de A = 0 (con ó sin) Probabilidad 0.0002*
* S e rechaza la H0
Los ensayos que se realizaron sobre el crecimiento poblacional del pool de bacilos en un
medio nutritivo con ó sin crudo se evalúan por el test de Wilcoson y la H0 (no existen
diferencias significativas) se rechaza con una P = 0.0002. Estos resultados se corresponden
con lo que se observa en las gráficas del comportamiento poblacional del pool de bacilos en
un medio nutritivo con ó sin crudo. (Figura 52).
Con este test se pudo determinar que el pool de bacilos presentó un mayor crecimiento
6
poblacional en un medio nutritivo sin crudo (102 x 10 al día 9) comparado con su
crecimiento en un medio nutritivo con crudo (15.1 x 10 6 al día 9), que era lo esperado.
La heterogeneidad que se presentó en el comportamiento general entre los dos medios
permite concluir que el crudo afectó el crecimiento del pool de formas bacilares.
Determinación de la influencia de la variación del pH en el crecimiento del pool de
bacilos.
Cuadro 58 Determinación de la variación del pH en el crecimiento del pool de bacilos.
Pool de Medio
Test estadístico
Bacilos nutritivo
F(1,df) 0.452360
Medio Levene
Probabilidad 0.503638
Nutritivo
fo 0.106614
Con crudo ANOVA
El pH en los medios nutritivos con ó sin crudo no presentaron diferencias significativas,
para confirmarlo se aplicaron las pruebas estadísticas, Anova, con un F calculado de
0.106614 y una P = 0.745097. Se corrobora la similitud química presentada entre los dos
medios empleados (Cuadro 28).
Esta semejanza en el pH de los dos medios determinó que no existió un efecto favorable o
desfavorable sobre la influencia del medio en el crecimiento poblacional microbiano por
parte del pH.
2) Determinación de la influencia del medio nutritivo y medio nutritivo modificado
con crudo al 10%, en el crecimiento del pool de Cocos - Cocobacilos seleccionados.
Los ensayos que se realizaron sobre el crecimiento de la población microbiana del pool de
Cocos - Cocobacilos se evalúan por el test Wilcoson la H0 (no existen diferencias
significativas) se rechaza. Estos resultados corresponden con lo que se observa en las

Figuras del comportamiento poblacional del pool de Cocos - Cocobacilos en un medio
nutritivo con ó sin crudo. (Figura 54).
Cuadro 59 Determinación de la influencia del medio nutritivo y medio nutritivo
modificado con crudo al 10%. en el crecimiento del pool de Cocos - Cocobacilos
seleccionados.

Cocobacilos Medio nutritivo sin
Test estadístico
Cocos crudo
F(1,df) 26.05654
Medio Levene
Nutritivo T
Medio 0.00
Con crudo Wilcoson Factor A HO : Efecto de A = 0
(con ó sin) Probabilidad 0.00000*
* S e rechaza la H0
Con este test se determino que el crecimiento del pool Cocos - Cocobacilos en ausencia de
6
crudo (1290 x 10 al día 7) presentó los niveles mas altos de crecimiento medido como
UFC/mL, comparado con su crecimiento en un medio nutritivo con crudo (370 x 10 6 al día
11)
La heterogeneidad que se presentó en el comportamiento general entre los dos medios
permite concluir que el crudo afectó el crecimiento del pool de Cocos - Cocobacilos.
Determinación de la variación del pH en el crecimiento del pool Cocos - Cocobacilos
El pH en los medios nutritivos con ó sin crudo no presentó diferencias significativas, para
confirmarlo se aplicaron las pruebas estadísticas, Anova con un F calculado de 0.005715 y

una P = 0.939975. Se corrobora la similitud química presentada entre los dos medios
empleados (Cuadro 29).
Cuadro 60 Determinación de la variación del pH en el crecimiento del pool de Cocos –
Cocobacilos.
Cocobacilos Medio
Test estadístico
Cocos nutritivo
Medio F(1,df) 0.765400
Levene
Nutritivo
fo 0.005715
ANOVA
Con crudo Probabilidad 0.939975
Esta semejanza en el pH de los dos medios determinó que no existió un efecto favorable o
desfavorable sobre la influencia del medio en el crecimiento del pool microbiano Cocos –
Cocobacilos por parte del pH.
3) Determinación de la influencia del medio de sales y medio de sales modificado con
crudo al 10%, en el crecimiento de los consorcios I, II, III, IV seleccionados.
Cuadro 61 Determinación del efecto del crudo en el crecimiento de los consorcios I, II, III, IV.

Consorcios
Test estadístico Medio con sales sin crudo
I, II, III, IV
F(1,df) 155.3179
Medio de Levene
Sales con
Medio T 0.000
crudo Wilcoson Factor A HO : Efecto de A = 0 (con ó sin)
* S e rechaza la H0
Los análisis estadísticos determinan que el crecimiento de las bacterias en presencia de
crudo (823 x 10 6 ) alcanzan los niveles mas altos, comparado con su crecimiento en un
medio sin crudo (2.5 x 10 6 ), presentándose diferencias estadísticas significativas con una P
= 0, confirmándose que en efecto, los consorcios I, II, III, IV fueron adaptados al crudo
Cusiana al presentar los mayores crecimientos en este medio.
Determinación de la variación del pH en el crecimiento de los consorcios I, II, III, IV. en
un medio con sales D.
Cuadro 62 Determinación de la variación del pH en el crecimiento de los consorcios I, II,
III, IV.
consorcios I, Medio de
Test estadístico
II, III, IV sales
Medio de F(1,df) 7.702782
Levene
Sales con
Kruskal - H 57.7779
crudo Wallis Probabilidad 0.0000
* S e rechaza la H0
En cuanto al pH se presentaron diferencias estadísticas significativas entre los dos medios
de cultivo, para confirmarlo se aplicaron las pruebas estadísticas, Kruskal -Wallis con una
H calculada de 57.7779 y una P = 0, corroborando lo observado en la Figura 64.
Estas variaciones de pH estuvieron en los rangos adecuados para el crecimiento bacteriano.

(para el medio D sin crudo 6.42 - 7.32 y con crudo 6 - 7.17).
3.6.3 Determinación de los efectos de las plantas en el desarrollo de los consorcios
inoculados.
1) Determinación de los efectos de Swinglea glutinosa y Brachiaria spp en el
desarrollo del pool de bacilos bioaumentados.
Cuadro 63 Determinación de los efectos de Swinglea glutinosa y Brachiaria spp en el
desarrollo del pool de bacilos bioaumentados.

Bacilos Test estadístico Inóculo sin plantas
F(1,df) 0.972537*
Swinglea Levene
glutinosa y Probabilidad 0.384308
Brachiaria spp Plantas fo 0.972537
con inóculo ANOVA Factor A HO : Efecto de A = 0*
(con ó sin) P 0.384308
• Patrón = semilleros inoculados con pool de bacilos sin plantas.

* Todas las H0 : se aceptaron.
Los resultados demuestran que no se presentaron diferencias en el crecimiento poblacional
del pool de bacilos en los tratamientos con presencia de plantas 'Fitorremediación' (1650 x
5 5
10 en Swinglea glutinosa y 4000 x 10 en Brachiaria spp) y en ausencia de plantas
'Biorremediación' (6500 x 10 5) (Figura 86)
2) Determinación del efecto de Swinglea glutinosa y Brachiaria spp en el desarrollo de
los consorcios I, II, III, IV bioaumentados. En el Cuadro 64 se observan las diferencias
estadísticas obtenidas en los diferentes tratamientos.

Cuadro 64 Determinación del efecto de Swinglea glutinosa y Brachiaria spp en el
desarrollo de los consorcios I, II, III, IV.

consorcios I,
Test estadístico Inóculo sin plantas
II, III, IV
F(1,df) 4.154646
Levene
Kruskal H 16.1941
S. glutinosa y Plantas
- Factor A HO : Efecto de A = 0
Brachiaria spp Wallis
con inóculo Nemenyi q q 0.05, ∝, 3
C0 = sin plantas c C0 vs C1 414* 3.314
C1 = S. glutinosa a C0 vs C2 346.5* 3.314
C2 = Brachiaria spp b C2 vs 1 67.5* 3.314
* S e rechaza la H0
c > b > a.
Los análisis indican que se presentaron diferencias estadísticas en los tres tratamientos, con
el mayor crecimiento poblacional de los consorcios I, II, III, IV en los tratamientos donde
no se cultivaron plantas ' Biorremediación' (14100 x 10 5 al día 27) y con el menor
crecimiento en los tratamientos donde se cultivo Swinglea glutinosa, (4400 x 105 al día 27)
'Fitorremediación', observándose con esto una relación negativa aportada por la plantas
hacia los microorganismos (Figura 86)
3) Determinación del efecto de Swinglea glutinosa y Brachiaria spp en el desarrollo
del Pool de ‘Cocobacilos – Cocos’ bioaumentados. En el Cuadro 65 se presentan las
diferencias poblacionales obtenidas en los diferentes tratamientos.
Cuadro 65 Determinación del efecto de Swinglea glutinosa y Brachiaria spp en el
desarrollo de los consorcios ‘Cocobacilos – Cocos’ bioaumentados.

Cocobacilos
Cocos
F(1,df) 0.125952
Levene
S. glutinosa y Plantas Estadístico fo 6.384081
Brachiaria spp
Anova Factor A HO : Efecto de A = 0
con inóculo
C0 = sin plantas a M 7.8109
Tukey C1 = S. glutinosa a M 7.5242
C2 = Brachiaria spp. b M 8.5028
• Datos con transformación logarítmica

* Se rechaza la H0
b > a = a.
Se determinó por el test de Anova diferencias en el crecimiento de los inóculos bacterianos
en los diferentes suelos, con una P = 0.003149 y por medio de un test post anova (Tukey)
se observo que la diferencia estaba dada por el tratamiento que poseía el pool ‘Cocobacilos
– Cocos’ + cultivo Brachiaria spp con un mayor crecimiento poblacional del consorcio
bacteriano.
Los análisis indican que existió un efecto sinergico por parte de Brachiaria spp hacia el
pool de ‘Cocobacilos – Cocos’ (12100 x 105 células/mL) Confirmando que las bacterias
que reaccionan con las raíces pertenecen a corresponden más marcadamente a los bacilos
cortos Gram negativos (Edwuarsiella spp, Hafnia spp, Enterobacter spp, Pseudomonas
putida) que, casi invariablemente, ocupan el mayor porcentaje de la rizosfera comparado
con la microbiota normal del suelo.

Se observo que no existió un efecto sinergico por parte de Swinglea glutinosa. para los tres
inóculos bioaumentados. Efecto causado por la presencia del suelo contaminado con crudo
Cusiana que aporto a esta especie vegetal condiciones adversas para su desarrollo.
La presencia de condiciones de estrés aportadas por el suelo contaminado, y la
bioaumentacion de microorganismos bacterianos con capacidades de asimilación nutritiva
rápida, afectaron el estado fisiológico de la planta disminuyendo los aportes rizosféricos
hacia la población bacteriana (Figura 86)
Estas condiciones hicieron que la degradación mediada por la rizosfera
'Fitobactorremediación' no tuviera resultados superiores a los tratamientos de
biorremediación (excepto Brachiaria spp más pool Cocobacilos – Cocos)
3.6.4 Determinación de las variaciones de pH en los diferentes semilleros inoculados.
1) Determinación de las variaciones del pH en el crecimiento poblacional del pool
bacilos’
Cuadro 66 Determinación de las variaciones del pH en el crecimiento poblacional del pool
de bacilos.
Pool de Bacilos Test estadístico Inóculo sin plantas

F(1,df) 21.81959
Swinglea glutinosa Levene Probabilidad 0.000001
y Brachiaria spp
Kruskal - H 4.017950
con inóculo
Wallis Probabilidad 0.1341
Los datos muestran que no se presentaron diferencias de pH en los distintos tratamientos
inoculados con el pool de bacilos. Determinados por el test Kruskal –Wallis con una
probabilidad de 0.1341.
2) Determinación de las variaciones del pH en el crecimiento poblacional de los
consorcios I, II, III, IV.
Cuadro 67 Determinación de las variaciones del pH en el crecimiento poblacional de los
consorcios I, II, III, IV.
consorcios I, II,
III, IV
S. glutinosa y F(1,df) 1.359505
Levene
Brachiaria spp fo 1.103580
ANOVA
con inóculo Probabilidad 0.343612
Como se aprecia no se presentaron diferencias de pH en los distintos tratamientos
inoculados con los consorcios bacterianos I, II, III, IV, determinados por el test Anova con
una probabilidad de 0.343612
3) Determinación de las variaciones del pH en el crecimiento poblacional del pool
Cocobacilos – Cocos. En el Cuadro 68 se aprecian las diferencias estadísticas en las
variaciones de pH en los diferentes tratamientos, obtenidas por Post Kruskal –Wallis
(Nemenyi).
Cuadro 68 Determinación de las variaciones del pH en el crecimiento poblacional del
inóculo pool de Cocobacilos – Cocos.
Cocobacilos
Cocos
F(1,df) 6.585688
S. glutinosa y Levene
Brachiaria Kruskal - H 8.897574
Wallis Probabilidad 0.0117
spp C0 a
Nemenyi C1 a
con inóculo
C2 b
C0 = sin plantas, C1 = Swinglea glutinosa, C2 = Brachiaria spp.

b > a = a.
Se obtuvieron diferencias en los cambios de pH en los distintos tratamientos. El
tratamiento sin plantas (6.18 - 6.52) y con Swinglea glutinosa (6.17 - 6.52) presentó las
mismas variaciones de pH con una ligera acidez, el tratamiento con Brachiaria spp presentó
una variación de pH entre 6.43 - 6.55. Estas variaciones bajas de pH permitieron comparar
los diferentes tratamientos en cuanto al crecimiento de la población bacteriana, sin otorgar
un benefició químico a un determinado tratamiento.
3.6.5 Determinación del efecto de las plantas en el crecimiento poblacional de las
bacterias presentes de manera natural en el suelo en cada uno de los diferentes
semilleros con suelos contaminados con crudo Cusiana. En el Cuadro 69 se aprecian las
diferencias estadistas en el crecimiento de una población nativa no bioaumentada
(microorganismos presentes de manera natural en el suelo objeto de la contaminación

inducida) para un tratamiento con cultivo de plantas comparada con un tratamiento sin
cultivo de ellas.
Cuadro 69 Determinación del efecto de las plantas en el crecimiento poblacional de las
bacterias nativas presentes en cada uno de los diferentes semilleros con suelos
contaminados con crudo Cusiana.

Bacterias
nativas
Suelo con crudo F(1,df) 0.008502
+ Levene
S. glutinosa
+ Plantas fo 2.571770
ANOVA Factor A HO : Efecto de A = 0*
Brachiaria spp (con ó sin) P 0.085241
Los tratamientos con cultivo de Brachiaria spp presentaron un leve aumento de la población
bacteriana nativa con respecto a los otros tratamientos. Pero esta diferencia no fue
significativa estadísticamente. Estos resultados se presentaron por el corto tiempo del
experimento, donde se hace necesario una adaptación inicial de las plantas después del
transplante y de los microorganismos a las nuevas condiciones ambientales (Figura 89).
3.6.6 Determinación del efecto del crudo en el desarrollo de las plantas.
1) Determinación del efecto del crudo en el desarrollo de Swinglea glutinosa.

Cuadro 70 Determinación del efecto del crudo en el desarrollo de Swinglea glutinosa.
+ S.Suelo
Efecto del crudo en el desarrollo de Swinglea glutinosa.

Test estadístico Suelo + Swinglea glutinosa + crudo
Raíz Tallo Planta
Longitud (cm) Biomasa (g) Longitud (cm) Diámetro (cm) Biomasa total
glutinosa
2,977990 5,743589 0,5482693
F(1,df) 0,309474 3.235849
84 74 52
Levene
0,106396 0,031071 0,4712623
Probabilidad 0,586786 0.093630
76 8* 48
t 1.857146 6.011465 7.637626 2.412446
'Student' t.' 0.000032 0.000002
Probabilidad 0.084452 0.030141*
* *
T 0
Wilcoxon 0,027714
Probabilidad
9*
* Se rechaza la hipotesis nula.
Figura 91 Figura comparativa del desarrollo de las distintas variables en Swinglea
glutinosa estudiadas en un suelo con ó sin crudo.
En los Cuadros 70 y 71 y en la Figura 91 se aprecian las diferencias estadísticas obtenidas
en cada una de las variables estudiadas.
Swinglea glutinosa cultivadas en suelos contaminados y sin contaminar

S. glutinosa S. glutinosa
Variables Rechazo
sin crudo con crudo
Altura tallo 13 cm H0 1,88 cm
Diámetro tallo 0,11 cm H0 0,04cm
Longitud raíz 16,7 cm Ha 13,2 cm
Biomasa raíz 3,6 g H0 2,31 g
Biomasa total 27,6 g H0 19,2 g
Cobertura 35.5% 10%
Los resultados demuestran que el cultivo de Swinglea glutinosa se vió afectado en su
crecimiento en cada una de las variables estudiadas (Longitud del tallo, diámetro del tallo,
biomasa de la raíz, biomasa total y cobertura) por la presencia de crudo Cusiana en el suelo.
Resultados vistos por el bajo índice de tolerancia obtenido (0.144). (Figura 91)
2) Determinación del efecto del crudo en el desarrollo de Brachiaria spp
Brachiaria spp cultivadas en suelos contaminados y sin contaminar.
Brachiaria spp sin Brachiaria spp

Variables Rechaza
crudo con crudo
Altura tallo 50.75 cm Ha 53 cm
Diámetro tallo 0.163 cm Ha 0.125 cm
Longitud raíz 33.25 cm H0 31.25 cm
Biomasa raíz 4.83 g H 0 6.24 g
Biomasa total 35.38 g Ha 49.38 g
Cobertura 25% Ha 30.25%
Cuadro 73 Determinación del efecto del crudo en el desarrollo de Brachiaria spp
Suelo +
Efecto del crudo en el desarrollo de Brachiaria spp.

Test estadístico Suelo + Brachiaria spp + crudo
Raíz Tallo Planta
Longitud (cm) Biomasa (g) Longitud (cm) Diámetro (cm) Biomasa total
Brachiaria spp
F(1,df)
9.270270 3.332352 0.155343 1.000000 0.633748
Levene
Probabilidad 0.008741 0.089333 0.699419 0.334282
0.439275
- -
t -4.87891 1.527525 -1.88312
'Student' t.' 0.191674 0.147253
Probabilidad 0.850750 0.000244 0.885032 0.148904 0.080628
T 0.00
Wilcoson
* Se rechaza la hipotesis nula.
Efecto del crudo en Brachiaria spp
Figura 92 Figura comparativa del desarrollo de las distintas variables en Brachiaria spp
estudiadas en un suelo con ó sin crudo.
Los resultados demuestran que el cultivo de Brachiaria spp no se vio afectado en su
crecimiento por la presencia del crudo Cusiana en el suelo, al no haberse obtenido
diferencias significativas en las variables que determinan la parte aérea de la planta (tallo,
biomasa y cobertura de la planta). En estos resultados se obtuvo una mayor biomasa de la
raíz de Brachiaria spp en suelos contaminados con crudo Cusiana, beneficiando la
Fitorremediación. Estos resultado mas un índice de tolerancia de 1.04 indica un optimo

desarrollo de esta especie vegetal en un suelo contaminado con crudo de Cusiana (Figura
92)
3) Determinación de la variación del pH como consecuencia del crecimiento de
Brachiaria spp, y Swinglea glutinosa en un suelo contaminado y sin contaminar.
Cuadro 74 Determinación de la variación del pH como consecuencia del crecimiento de
Brachiaria spp, y Swinglea glutinosa en un suelo contaminado y sin contaminar.
Suelo sin crudo

Variables
Test estadístico + S. glutinosa
vegetales +Brachiaria spp
Suelo con crudo F(1,df) 5.393937
+ Levene
S. glutinosa Kruskal - fo 5.7197
+
Brachiaria spp Wallis Probabilidad 0.1261
Se obtuvieron semejanzas en el estudio de pH de los diferentes tratamientos, indicando que
esta condición química no es un punto de partida para las diferencias presentadas en cada
uno de los tratamientos. Estas condiciones indican la actitud buffer del suelo al presentarse
un contaminante en su medio.
3.6.7 Determinación del efecto de la población bacteriana en el desarrollo de las
plantas cultivadas en los diferentes semilleros con suelos contaminados con crudo
Cusiana.
Cuadro 75 Determinación del efecto de la población bacteriana en el desarrollo de las plantas cultivadas en los diferentes
semilleros con suelos contaminados con crudo Cusiana.
Swinglea glutinosa + Crudo + Inóculos

Test Raíz Tallo Planta
spp+glutinosa + Crudo
estadístico Longitud (cm) Biomasa (g) Longitud (cm) Diámetro (cm) Biomasa total (g)
Pool 1 Consor Pool 2 Pool 1 Consor Pool 2 Pool 1 Consor Pool 2 Pool 1 Consor Pool 2 Pool 1 Consor Pool 2
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
F(1,df) 3.22672 8.93551 2.88117 1.03254 4.01902 0.89427 0.25925 3.64867 0.01907 0.33689 0.02621 0.00 4.21408 0.02295 3.42267
Levene 0.09404 0.00975 0.11172 0.32680 0.06472 0.36035 0.61856 0.07681 0.89212 0.57085 0.87368 1.00000 0.05927 0.88173 0.08552
P
-2,7605 -1,1265 -1,5412 -1,3120 2,99127 -0,4386 -2,1175 -0,7092 -1,8E- 0,35675 0 1,68608 -0,8385 1,16129
t
Swinglea
Student' t 16
P 0,02807 0,2970 0,16714 0,23090 0,02018 0,67411 0,07198 0,50107 1 0,73178 1 0,13564 0,42940 0,28358
crudoBrachiaria
Wilcoxon T 7.000
P 0.236
Test Brachiaria spp + Crudo + Inóculos
estadístico
F(1,df) 0.02258 0.03232 2.13629 0.00 23.9085 0.34372 2.01348 0.26721 1.26384 1.14545 1.57657 5.72727 3.64342 4.00495 4.45489
Levene
P 0.88269 0.85988 0.16593 1.00000 0.00023 0.56701 0.17778 0.61327 0.27983 0.30260 0.22980 0.03127 0.07700 0.06514 0.05327
t -0,9816 -4,4045 0,39498 -0,1144 -4,1891 -0,2355 -1,1819 -1,5789 -0,5516 0,55167 3,39967 1,73785 0,34281
Student' t
P 0,35898 0,00313 0,70461 0,91206 0,00409 0,82054 0,27580 0,1583 0,59833 0,59833 0,01144 0,12580 0,74180
Wilcoxon T 0.00 0.00

P 0.011 0.027
• Pool 1 = Bacilos.
• Consorcio 1 =I, II, III, IV.
• Pool 2 = Cocos – Cocobacilos.
* La hipótesis nula se rechaza
En la mayoría de los resultados no se encontraron diferencias significativas para las
variables estudiadas, a excepto de algunos casos que se describen en el cuadro 76.
Cuadro 76 Valores que dieron diferencias significativas en cada una de las variables
estudiadas de Brachiaria spp cultivadas en suelos contaminados y sin contaminar.
Brachiaria spp
Variables Sin inóculo Con inóculo
Pool Consorcios Pool Cocos Pool Consorcios Pool de Cocos -
Estudiadas. bacilos I, II, III, IV Cocobacilos bacilos I, II, III, IV Cocobacilos
Biomasa total 81.75 g 55.5 g
Longitud de la raíz 31.25 cm 36.56 cm
Biomasa de la raíz 6.24 g 9.3 g
Biomasa de la raíz 6.24 g 8.175 g
Diámetro del tallo 0.125 cm 0.175 cm
De las diferencias encontradas se vió un aporte de los inóculos bacterianos al desarrollo de
Brachiaria spp, con un aporte importante para la raíz, también se observo un efecto
negativo del pool de bacilos en el desarrollo de la biomasa total de Brachiaria spp.
En general se observo un aporte bajo de los microorganismos para el desarrollo fisiológico
de Brachiaria spp.
Los datos muestran que no se presentaron diferencias estadísticas significativas en cuanto al
desarrollo de Swinglea glutinosa con ó sin inóculo bacteriano, con dos excepciones en
cuanto a la variable raíz, al encontrarse diferencias significativas desfavorables en su
biomasa por el pool de Cocos - Cocobacilos y favorables en su longitud por el pool de
formas bacilares.
3.7 ANALISIS ECONOMICO.
El análisis de costos se llevó a cabo teniendo en cuenta dos fases consecutivas del proyecto.
Primero, la producción de microorganismos que involucró el período de aislamiento,
mantenimiento y bioaumentación, la segunda parte de biorremoción que incluyó la
Fitorremediación (en la que se cultivo Swinglea glutinosa y Brachiaria spp), la
Biorremediación y la Fitobactorremediación (en la que se bioaumento la población
microbiana en cada uno de los tratamientos durante un periodo de treinta días por medios
de 10 riegos cada 3 días).
3.7.1 Fase I: Producción de Microorganismos (para 441 Kg de suelo)
a. COSTOS FIJOS-
Biorreactores $ 900.000=
Depreciación de los Biorreactores $ 11.100=
Mantenimiento del biorreactor $ 22.500=
Compresor 3/4 HP $ 350.000=
depreciación del compresor $ 4.316=
Mantenimiento del biorreactor $ 22.500=
Material de vidrio $ 350.000=
Bombas de Oxigeno $ 126.000=
Depreciación de las bombas de Oxigeno $ 1.554=
Nevera $ 380.00=0
Depreciación de la nevera $ 4686=
TOTAL COSTOS FIJOS = $ 2'172.656=
b. COSTOS VARIABLES (para 10 corridas).
Inóculo $ 23.000=
Agar nutritivo $ 25.000=
Medio nutritivo $ 134.000=
Medio de sales $ 10.000=
Servicios públicos (Agua y energía) $ 50.000=
TOTAL COSTOS VARIABLES = $ 242.000=
3.7.2 Fase II:
Etapa 1: Biorremediación (para 147 Kg de suelo).
a. COSTOS FIJOS
Adecuación del terreno $ 55.000=

Otros $ 6.000=
TOTAL COSTOS FIJOS = $ 61.000

b. COSTOS VARIABLES (por 30 días)
Servicios públicos (Agua y energía) $ 18.000=
Etapa 2: Fitorremediación (para 147 Kg de suelo).
a. COSTOS FIJOS.

Otros $ 3000=
b. COSTOS VARIABLES.
 Costos agronómicos
Semillas $ 20.000=
Plantas $ 33.000=
Agua $ 5.000=
 Costos de análisis
Análisis de caracterización del terreno $ 66.000=

Análisis de tejido foliar para los elementos, $ 30.000=
Cu, Zn, Mn, Al, Fe, Ca, Mg, K, Ni.

Análisis de tejido foliar para N $ 25.000=
Análisis de tejido foliar para B $ 30.000=
Etapa 3: Fitobactorremediación. (para 294 Kg de suelo).
a. COSTOS FIJOS.

Otros $ 8000=
b. COSTOS VARIABLES.
 Costos agronómicos
Semillas $ 20.000=
Plantas $ 66.000=
Agua $ 23.000=
 Costos de análisis
Análisis de caracterización del terreno $ 66.000=

Análisis de tejido foliar para los elementos, $ 30.000=
Cu, Zn, Mn, Al, Fe, Ca, Mg, K, Ni.

Análisis de tejido foliar para N $ 25.000=
Análisis de tejido foliar para B $ 30.000=
Total costos de Biorremediación (para 147 Kg de suelo) $ 883.884=
Total costos de Fitorremediación (para 147 Kg de suelo) $ 267.000=

Total costos de Fitobactorremediación (para 294 Kg de suelo) $ 1' 952.770=
CONCLUSIONES
 Se presentaron apreciables variaciones en el crecimiento de los microorganismos en los
diferentes medios en que se cultivaron. En el Cuadro 77 puede observarse que en los
medios nutritivos, donde estaba presente el hidrocarburo más los pool bacterianos (el Pool
de bacilos y en el Pool de Cocos y Cocobacilos), se obtuvieron adaptaciones bajas a la
presencia del contaminante y en los medios con sales, donde estaba presente el
hidrocarburo más los Consorcios bacterianos I, II, III y IV, las adaptaciones fueron altas.
Cuadro 77. Crecimiento bacteriano en los diferentes medios de cultivos utilizados.
Número células / mL x 10 6
Tipos bacterianos en los
Sin crudo Con crudo al 10%
diferentes medios de cultivo
Agar nutritivo
Pool de Bacilos 102 18
Pool de Cocos y Cocobacilos 1020 370
Consorcios bacterianos I, II, Medio con sales D
III y IV 7.29 860
 Durante el bioproceso de biodegradación, el pH no presentó grandes variaciones para
los diferentes tipos microbianos en los 24 tratamientos (Cuadro 78), observándose que no
existió una influencia favorable o desfavorable en los procesos de biodegradación o
crecimiento microbiano pues aportó las mismas condiciones químicas.
Cuadro 78. Variaciones del pH en los diferentes tratamientos como consecuencia del
crecimiento de los microorganismos en los medios de cultivos.
Tipos Variaciones del pH en los diferentes tratamientos

bacterianos en
los diferentes Bajo condiciones
Biorreactor Semilleros
de laboratorio
medios cultivo
Pool de Bacilos 6.38 - 4.15. 7.98 -7.6 6.54 - 6.12
Pool de Cocos y
Cocobacilos 6.48 - 4.21 8.31 - 7.56 6.52 - 6.14.
Consorcios I, II,
III y IV 7.28 - 6.42 7.87 - 6.41 6.54 -6.12;
 Aunque el pool de bacilos y el pool de Cocos - Cocobacilos presentaron una baja
adaptación al crudo, se obtuvo un crecimiento poblacional adecuado para los procesos de

6
Fitobactorremediación en el día 4, tanto en el preinóculo (para el pool de bacilos 4.5 x 10
6
UFC/mL y para el pool de Cocos - Cocobacilos 30 x 10 UFC / mL) como en los
biorreactores (294 x 10 5 Células / mL).

 Para los diez días del bioproceso de biodegradación proporcionados por el inóculo de
los consorcios bacterianos I, II, III y IV bajo condiciones de laboratorio, se obtuvieron los
siguientes porcentajes máximos de biodegradación:
sin surfactante 50 %
Medio con sales C
con surfactante 58 %
sin surfactante 68 %
Medio con sales D
con surfactante 75 %
Encontrándose los mejores resultados para el medio con sales D (medio económico, bajo en
sales y sin compuestos orgánicos).
 La biodegradación del crudo de Cusiana tuvo dos etapas: una inicial rápida, donde
intervino la fácil biodegradación de algunos compuestos y la volatilidad del crudo con
valores del 21% y una segunda más lenta, donde quedaron compuestos difíciles de degradar
o recalcitrantes.
 El suelo contaminado presentó una degradación física por compactación, afectando la
germinación de las semillas y el desarrollo de las plantas; también produjo un ligero
aumento del valor del pH y de los iones de Ca y de Na.
 Para la mayoría de las semillas y plantas cultivadas en suelos contaminados con crudo
de Cusiana, se presentaron bajos niveles fitotóxicos a bajas concentraciones del
contaminante (10%) y altos niveles fitotóxicos a altas concentraciones del contaminante
(30%). Helianthus annuus fueron las únicas semillas que tuvieron altos porcentajes de
germinación (80%) en suelos contaminados con crudo de Cusiana al 30%, pero finalmente
todas murieron en su crecimiento.
 En los semilleros de biotratamiento se obtuvo la siguiente biorremoción (Cuadro 79).
Cuadro 79 Porcentajes de biorremoción logrados por Fitorremediación, Biorremediación
y Fitobactorremediación.
TRATAMIENTOS % Biorremoción %Eficiencia

Patrón Suelo contaminado 11.15
Pool de bacilos 70.66 59
Biorremediación Pool de Cocos - Cocobacilos 62.84 51
Consorcios I, II, III y IV. 78.04 66.5
Swinglea glutinosa 41.23 30
Fitorremediación
Brachiaria spp 47.3 35.8
Pool de bacilos más
57.77 46
Swinglea glutinosa
Pool de Cocos - Cocobacilos
59.46 48
más Swinglea glutinosa
Consorcios I, II, III y IV más
64.19 52.7
Swinglea glutinosa
Pool de bacilos más
57.43 45.9
Brachiaria spp
Pool de Cocos - Cocobacilos
64.19 52.7
más Brachiaria spp
Consorcios I, II, III y IV
67.57 56
más Brachiaria spp
 Se obtuvieron mayores porcentajes de biorremoción en los tratamientos inoculados
con bacterias que poseían inducción enzimática (consorcios I, II, III, IV con 78.04%),
comparado con los tratamientos inoculados con bacterias adaptadas al crudo Cusiana (pool
de bacilos 70.66% y pool de Cocos - Cocobacilos 62.84%).
 Los altos porcentajes de biorremoción por microorganismos nativos, demuestran su
importancia en los bioprocesos como una solución a la descontaminación de suelos.
 Los porcentajes de biorremoción por Fitobactorremediación no fueron superiores a los
procesos de biodegradación, a excepción del tratamiento inoculado con el pool de Cocos -
Cocobacilos en un cultivo de Brachiaria spp, donde se obtuvieron mayores resultados de
biodegradación (64.19%) respecto al tratamiento patrón (62.84%).
 Los mayores porcentajes de biorremoción por Fitorremediación con relación a los
bioprocesos naturales 'intemperismo' hacen de Brachiaria spp y Swinglea glutinosa una
buena opción para recuperar suelos contaminados con hidrocarburos.
 Se presentaron varias especies vegetales tolerantes a la contaminación, con diferencias
en su cobertura:
Brachiaria decumbens con una disminución de la cobertura del 64%

Brachiaria brizantha con una disminución de la cobertura del 57%
Swinglea glutinosa con un aumento de la cobertura del 35.5%
Brachiaria spp con un aumento de la cobertura del 35.5%
 El aumento de cobertura, los extensos y finos sistemas de raíz que proporcionaron un
mejor contacto suelo- raíz en la especie vegetal Brachiaria spp, fueron características que
aportaron ventajas a los procesos de Fitorremediación (47%), obteniéndose los mejores
resultados al compararse con los de Swinglea glutinosa (41.23%).
 Swinglea glutinosa presentó un bajo índice de tolerancia al crudo Cusiana (0.144) y
resultó afectada en cada una de las variables estudiadas. A diferencia, Brachiaria spp
presentó un alto índice de tolerancia (1.04) obteniéndose resultados similares al patrón en
cada una de las variables estudiadas.
 Un óptimo desarrollo de Brachiaria spp en suelos contaminados sin una previa
fertilización (cobertura del 92%), indicó que ésta era una especie vegetal poco exigente en
suelos y nutrientes, con una alta resistencia a la presencia de contaminantes y por ende, un
fuerte candidato para realizar procesos de Fitorremediación.
 El análisis foliar de Swinglea glutinosa y Brachiaria spp presentó niveles bajos de
micronutrientes y niveles aceptables para los elementos secundarios (Cuadro 80).
Cuadro 80 Análisis foliar para los elementos Ca, Mg, K, Al, Cu, Zn, Fe, Mn, B y Ni en
Swinglea glutinosa y Brachiaria spp.
Tratamientos Ca Mg K Al Cu Zn Fe Mn B Ni
S. glutinosa más Suelo + crudo 6,3 0,65 1,25 4,6 3,5 23,8 148 16,3 6 0,09
Brachiaria spp más Suelo + crudo 1 0,8 1,6 1,2 6,4 18,1 140 21,5 3,6 0,09
 Se observó un aumento no significativo de la población bacteriana, presente en los
suelos de forma natural, en la endorizosfera contaminada de Swinglea glutinosa (615 x 105

cel / g) y Brachiaria spp (721 x 105 cel / g), al compararse con el tratamiento patrón (388 x
105 cel/g), encontrándose ningún efecto de las plantas hacia las bacterias nativas.
 La población bacteriana inoculada de los diferentes microorganismos en la
endorizosfera de Swinglea glutinosa y Brachiaria spp no presentó un aumento significativo,
excepto el pool de Cocos - Cocobacilos inóculado en Brachiaria spp (12100 x 10 5
células/mL) comparado con el tratamiento patrón (4350 x 105 células/mL). Esto confirmó
que las bacterias que reaccionan a la presencia de las raíces pertenecen o corresponden de
forma más marcada a los Bacilos cortos gram negativos (Edwuarsiella spp, Hafnia spp,
Enterobacter spp, Pseudomonas putida).
 Los diferentes tipos bacterianos inoculados en los 24 tratamientos no aportaron
beneficios significativos a las especies vegetales Swinglea glutinosa y Brachiaria spp, salvo
algunas excepciones donde beneficiaron a la variable raíz.
 El efecto de las poblaciones microbianas bioaumentadas frente a las poblaciones
microbianas nativas del suelo es sinérgico; esto se evidenció en el bajo porcentaje de
biorremoción (11.15%) y en el número poblacional inferior (403 x 105) del bloque control,
comparado a los porcentajes obtenidos en el resto de tratamientos (> al 40%) y al mayor
número de microorganismos en los semilleros inoculados con: el pool de Bacilos (6900 x
105) el pool de Cocos - Cocobacilos (4900 x 105) y los consorcios I, II, III, IV (14200 x
105).
 La presencia de una población bacteriana bioaumentada, poco frecuente en la rizosfera
de plantas (pool de bacilos y consorcio I, II, III, IV), hizo que los aportes nutritivos por
parte de los exudados no fueran aprovechados al máximo por los microorganismos,
observándose una especialización de las bacterias rizosféricas al tomar nutrientes aportados
por los exudados de la raíz.

RECOMENDACIONES
Implementar el bioproceso que se diseña y se utiliza en la presente investigación como
una alternativa reproducible, eficiente y confiable de Fitobactorremediación y
Fitorremediación ’in Situ’.
Usar un tiempo mayor para los procesos de Fitorremediación para así permitir a las
plantas transplantadas un buen establecimiento en los suelos contaminados.
Realizar un levantamiento taxonómico y un seguimiento de las especies
colonizadoras en zonas afectadas por este tipo de contaminación, para facilitar la tarea de
selección de plantas resistentes a hidrocarburos.

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RESUMEN
Este estudio presenta los resultados de un ensayo de campo realizado sobre semilleros
petrolizados en el cual se compararon las eficiencias de tres bioprocesos, con respecto a la
remoción de hidrocarburos totales durante un periodo de 30 días, con el fin de restablecer
suelos contaminados con crudo Cusiana al 30 % P/P: 1) Biorremediación: Se
seleccionaron bacterias nativas presentes en el suelo (pool 1 = Bacillus, Corynebacterium y
Nocardia; pool 2 = Edwuarsiella, Hafnia, Enterobacter, Micrococcus, Streptococcus y
Pseudomonas; y consorcios = Bacillus, Micrococcus, Streptococcus, Enterobacter y
Corynebacterium) y se adaptaron al hidrocarburo para iniciar los procesos de
biodegradación por bioaumentación. 2) Fitorremediación: Se estudió la vegetación
cultivada y se seleccionaron aquellas con mayor tolerancia y rápida cobertura en suelos
contaminados por hidrocarburos (Swinglea glutinosa y Brachiaria spp). 3)
Fitobactorremediación: Las bacterias nativas adaptadas se inocularon en la rizosfera de las
plantas seleccionadas y se describieron las relaciones planta - bacteria, que se manifestaron
en el crecimiento de los microorganismos y de las plantas, para determinar su influencia en
la biorremoción. Las mediciones de las variables de crecimiento (número de bacterias /
mL, longitud y biomasa de la raíz, diámetro y altura del tallo, biomasa total y cobertura) se
sometieron a un análisis de varianza empleando un diseño completamente al azar. Se
encontró que a) la Biodegradación (70.5%) es más eficiente que la Fitorremediación
(44.26%) y que la Fitobactorremediación (62%), b) la Fitorremediación es un bioproceso
lento y económico con buenos aportes para la biorremoción y c) el empleo de entes
biológicos ausentes de sinergismo, 'Fitobactorremediación', no aportó resultados mayores
en procesos de biorremoción respecto a los presentados en biorremediación, exceptuando el
tratamiento Brachiaria spp inoculada con el pool 2, que mostró diferencias significativas en
el número poblacional de microorganismos (P = 0.00315) entre todos los tratamientos, y el
mayor porcentaje de biorremoción entre los tratamientos inoculados con el pool 2 (64.19%)
d) a diferencia de Brachiaria spp (índice de tolerancia 1.04), Swinglea glutinosa fue
afectada por el crudo Cusiana (índice de tolerancia 0.144) y mostró diferencias
significativas para las variables de crecimiento en los siguientes niveles de probabilidad:
Biomasa de la raíz (0.000032), longitud del tallo (0.000002), diámetro del tallo (0.0277),
biomasa total (0.030).

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FITOBACTORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS POR

MILTON FAJARDO MANTILLA

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

MILTON FAJARDO MANTILLA

OLGA LUCIA SANMIGUEL ARISMENDY

Trabajo de investigación para optar el título de biólogo

Dra. GRACIELA CHÁLELA MSc. Dr. Rer. Nat

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

Bucaramanga, Febrero del 2.001

Innovación en Biotecnología Industrial (CINBIN) UIS Directora de la investigación.

Al equipo de trabajo del Centro de Innovación en Biotecnología Industrial (CINBIN).

Ramiro Álvarez Sierra, profesor de la escuela de Biología.

Ingeniero Gilberto Moreno. Administrador Sede UIS Guatiguará.

Gonzalo Calderón Caballero y al equipo de trabajo de la Granja Guatiguará.

Ingeniero Libardo Ochoa. Empresa Colombiana de Petróleos – Gerencia Complejo de

Autónoma Regional para la Defensa de la Meseta de Bucaramanga (CDMB).

Ing. Milagro León Escobar Munera, Subdirección Administración de Recursos Naturales de

La Corporación Regional para la Defensa de la Meseta de Bucaramanga (CDMB).

hidropónico de Jensen y medio de Jensen modificado con crudo

de arena modificada con crudo al 10% y 30 %.

en un sustrato de arena y sustrato de arena modificado con crudo al 10% y 30 %.

sepium en un suelo sin crudo y un suelo con crudo al 10% y 30 %.

crudo y un suelo sin crudo al 10% y 30 %.

2.5.1.2.5 Medio de sales C. (según Ercoli et al)

agar nutritivo y agar nutritivo modificado con crudo Cusiana.

nutritivo y agar nutritivo modificado con crudo Cusiana.

medio de sales modificado con crudo Cusiana.

rremediacion 'In situ'

en las diferentes eras con suelos contaminados con crudo Cusiana.

hidropónico de Jensen y medio de Jensen modificado con crudo.

de arena modificada con crudo al 10% y 30

'Estacas' de Gliricidia sepium en suelo y suelo contaminado con crudo al 10% y

contaminado con crudo al 10% y 30%. En el cuadro 10, figura 26 y 27 se observan

agar nutritivo y agar nutritivo modificado con crudo Cusiana.

3.4.3.1.1.3 Análisis de la influencia del medio de sales en la biodegradación 146

nutritivo y agar nutritivo modificado con crudo Cusiana.

10%. en el crecimiento de los Bacilos seleccionados.

medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10%.

medio nutritivo modificado con crudo al 10%.

10%. en el crecimiento de los Cocobacilos y Cocos seleccionados.

bacteriano en medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10%.

al 10% en el crecimiento celular.

bacteriano en el medio de sales D y medio de sales D modificado con crudo al 10%.

3.4.4.1 Medio 162

Remediación 'In situ'

cada una de las eras.

en las diferentes eras con suelos contaminados con crudo Cusiana.

variables estudiadas se indican en el cuadro 41 y 42.

3.6.1 Porcentaje de biodegradación en medio de sales C y D con surfactante y sin el 214

Figura 1. Curva de crecimiento de los organismos 11

y un medio de jensen modificado con crudo al 3 %, 1 % y 15 %.

y sustrato de arena más crudo Cusiana al 10% y 30%.

sustrato de arena modificada con crudo al 10% y 30%

Helianthus annuus en un sustrato de suelo y sustrato de suelo más crudo Cusiana al

Figura 28 Seguimiento del cultivo de Brachiaria decumbens y Brachiaria brizantha 123

en un sustrato con crudo al 30%

sustrato con crudo al 30% un mes después de su cultivo

Figura 31 Pruebas de crecimiento de plántulas Swinglea glutinosa en un suelo 125

contaminado con crudo al 10% y 30% un mes después de su cultivo.

Figura 32 Caracterización macroscópica y microscópica de Edwarsiella spp 128

y medio de sales D sin surfactante.

modificado con crudo al 10%

un medio nutritivo y medio nutritivo modificado con crudo al 10%

modificado con crudo al 10%